嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮一體式時間分辨熒光免疫層析定量卡的制備及應用

張海濤，張居清，祁蘇嫻，朱亞俊，于 婷，楊婷婷,*

1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司 (無錫 214063)2.盱眙金谷糧食集團有限公司 (盱眙 211700)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又稱嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族化合物，由小麥赤霉病菌、禾谷鐮刀菌復合群產(chǎn)生[1]。近些年研究發(fā)現(xiàn)嘔吐毒素對人患有食管癌和IgA腎病有關，對人類及動物的健康構(gòu)成威脅[2]。研究表明，嘔吐毒素在人體內(nèi)會存在一定量的沉積，但是無特殊的靶器官，細胞毒性極強。當人和畜牧食入被污染的糧食和飼料后，會引起嘔吐、腹瀉、厭食、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時會破壞造血系統(tǒng)甚至造成死亡。玉米赤霉烯酮，是一種鐮刀菌屬真菌分泌的類雌激素霉菌毒素，大量存在于玉米、小麥等農(nóng)作物中，對動物肝臟等器官損傷較大，在體內(nèi)沉積，會造成動物機能異常甚至死亡，給農(nóng)牧場帶來巨大的影響和經(jīng)濟損失[3-5]。

鑒于霉菌毒素對人類健康及糧食制品相關產(chǎn)業(yè)鏈的巨大危害，我國制定了嚴格的食品安全國家標準，GB 2761—2017對食品中霉菌毒素限量均做了明確的規(guī)定，其中明確規(guī)定谷物及其制品中DON的限量標準為1 000 μg/kg、谷物及其制品中ZEN的限量標準為60 μg/kg[6]。隨著國人對食品安全重視程度意識的不斷增強，監(jiān)管部門對霉菌毒素的監(jiān)測也愈發(fā)廣泛。在監(jiān)測工作中發(fā)現(xiàn)很多谷物容易同時受到多種霉菌毒素的污染，傳統(tǒng)的單樣品多毒素分指標檢測方法極大的增加了檢測的時間、人力和物力成本，如何實現(xiàn)多毒素一體式同步檢測就顯得尤為重要。

糧食安全關乎整個食品產(chǎn)業(yè)鏈的安全。基于小麥、玉米等原糧中同時受到嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素污染比較普遍的客觀現(xiàn)實，迫切需要建立一種更快速、更方便、更經(jīng)濟的快速篩查檢測方法。鑒于此，本實驗室在DON、ZEN單毒素檢測試紙條的基礎上，研制出嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮一體式時間分辨熒光免疫層析定量卡并進行了初步的推廣應用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

多通道時間分辨熒光免疫分析儀，SW-2型，江蘇省蘇微微生物研究有限公司；高速冷凍離心機，GL-21M型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；低速垂直混合儀，HS-3型，寧波市新芝生物科技有限公司；數(shù)顯超聲清洗機，JM-07D，深圳潔盟清洗設備科技有限公司；精密鼓風干燥箱，BPG-9006型，上海一恒科學儀器有限公司；數(shù)顯三維噴金劃膜儀，HM3035型、精密數(shù)控裁條機，CTS300型、全自動裁條斬切機，ZQ2000型，上海金標生物科技有限公司。

玉米赤霉烯酮溶液標準物質(zhì)，GBW(E)100301，國家糧食和物資儲備局科學研究院；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇溶液標準物質(zhì) ，GBW(E)100304，國家糧食和物資儲備局科學研究院； N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、碳二亞胺(EDC)、牛血清白蛋白( BSA )， Sigma-Aldrich 公司； ZEN-BSA 偶聯(lián)物、DON-BSA偶聯(lián)物、抗ZEN單抗、抗DON單抗，江蘇省蘇微微生物研究有限公司制備；羊抗鼠IgG，上海杰一生物技術有限公司；硝酸纖維素膜CN140，德國賽多利斯；樣品墊，SB08，上海金標生物科技有限公司；吸水紙，SX27，上海金標生物科技有限公司；PVC單面白色塑料膠板，SM31-25型，上海金標生物科技有限公司；小麥、玉米等原糧，實驗室收集(經(jīng)HPLC定值)。

1.2 實驗方法

1.2.1抗DON單抗(或ZEN單抗)的熒光納米微球標記[7]

準確移取100 μL經(jīng)10 min后超聲分散后的銪Eu3+納米微球，加入到2 mL 帶蓋圓底離心管中，隨即準確加入900 μL超純水進行混合，將混合物超聲分散5 min。另分別配制碳二亞胺(EDC)乙醇溶液和50 mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)乙醇溶液，準確移取配制好的EDC和NHS溶液各取50 μL加入上述超聲分散后的混合物中，置于25 ℃條件下低速垂直混合儀上進行40min的旋轉(zhuǎn)混合。將垂直混合后的離心管放入15 000 r/min的高速離心機內(nèi)離心20 min，去除離心后混合物的上清液，然后準確加入1 mL超純水進行5 min的超聲活化。在超聲活化后的微球混懸液中準確加入0.05 mg抗DON單抗(或抗ZEN單抗)，繼續(xù)置于垂直混合儀上25 ℃條件下混合反應2 h，加入牛血清白蛋白使之最終濃度為0.5%，4 ℃封閉1 h，然后將封閉后的離心管放入15 000 r/min的高速離心機內(nèi)離心20 min，去除離心后混合物的上清液，然后準確加入1 mL復溶液并超聲分散5 min，置于2 ℃～8 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2熒光免疫試紙條的組裝

通過前期的實驗條件篩選，確定最佳包被抗原、羊抗鼠IgG的工作濃度以及熒光抗體的工作濃度。用三維噴金劃膜儀將 DON-BSA包被抗原(T1線)、ZEN-BSA包被抗原(T2線)和羊抗鼠IgG(C線)分別固相于NC膜上。將一定濃度的兩種熒光標記抗體混勻后噴涂于結(jié)合墊上，上述NC膜和結(jié)合墊于45 ℃鼓風干燥箱中干燥24 h以上。以PVC單面白色塑料膠板為襯板，將制備好的樣品墊、結(jié)合墊、固相后的NC膜與吸水墊，按順序粘貼在PVC襯板上(見圖1)形成試紙條大板，然后用全自動斬切機將整張大板切割成4 mm寬、60 mm長的個體按層析順序固定于塑料卡內(nèi)，用壓殼機壓緊卡殼，制備成DON/ZEN一體式時間分辨熒光免疫層析檢測卡。將檢測卡連同干燥機一并放入鋁箔袋中在塑封機商進行熱封，常溫保存。

圖1 時間分辨熒光免疫層析卡的組裝示意圖

1.2.3檢測原理

嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮(DON/ZEN)一體式時間分辨熒光免疫層析檢測卡基于抗原抗體免疫性競爭結(jié)合的原理，待測定樣本中如果含有DON、ZEN等待測抗原，則在層析涌動過程中會與結(jié)合墊上熒光微球標記的特異性單克隆抗體反應，抑制帶有熒光標記物的抗體與固相在NC膜檢測線上DON-BSA與ZEN-BSA固相物的結(jié)合。待測物中DON與ZEN含量不盡相同，結(jié)合于檢測線上的熒光標記的抗體量也不同，相應的檢測線上微球的熒光強度也有強弱。使用多通道時間分辨熒光免疫分析儀對檢測線進行掃描，儀器將光信號轉(zhuǎn)換為電壓信號，經(jīng)過放大輸入到模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器，將模擬信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，通過讀數(shù)儀微處理器預置代碼程序分別計算檢測線T1、T2與C的熒光強度比值，結(jié)合標準定量曲線即可一體式同步定量測定樣本中DON與ZEN的含量。

1.2.4標準曲線的建立

用體積比為50∶50的甲醇-水將DON與ZEN的標準溶液分別定容配制成1 000 ng/mL的標準儲備溶液；配制4‰的Tween-PBS(0.01 moL/L，pH 7.2)采用梯度稀釋的方法配制系列濃度為0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、25、50 ng/mL的DON/ZEN混標工作液。取各濃度混標工作液100 μL加至一體式檢測卡的樣品孔中，每個濃度做7平行，然后用多通道時間分辨熒光免疫分析儀讀取T1、T2線熒光強度與C線熒光強度值，計算各濃度的T1/C與T2/C值。以系列標準工作溶液濃度為X值，各系列標準液的熒光強度T/C值與0 ng/mL標準液的熒光強度T/C值二者之間的比值為Y值，采用四參數(shù)Logistic擬合的方法分別繪制DON與ZEN的標準定量曲線。

1.2.5樣品處理與測定

稱取2 g粉碎后混合均勻的樣品至離心管中，再用量筒取10 mL 60%甲醇-水至其中，混勻，密封；在漩渦振蕩器上振蕩3 min，移至高速離心機中4 000 r/min 離心 5 min，得上清液；用移液器吸取500 μL樣品稀釋液至離心管中，再定量吸取100 μL離心后樣品上清液至其中，在漩渦振蕩器上振蕩30 s待用。提前將未使用的檢測卡及配套試劑從冰室中取出平衡至室溫，將檢測卡平放，用移液器準確吸取100 μL 混合后的待測樣液垂直加入樣品孔中，開始計時；25 ℃反應 10 min 后，將檢測卡放入多通道時間分辨熒光免疫分析儀中讀數(shù)，儀器結(jié)合項目定量曲線預置信息計算檢測結(jié)果。

1.2.6方法的技術參數(shù)

(1)靈敏度

(2) 檢出限與定量限

(3)準確度

采用空白基質(zhì)樣品添加回收實驗，在小麥和玉米樣本中分別加入高、中、低這3個不同濃度的DON與ZEN標準溶液，按照1.2.5的步驟進行操作，采用時間分辨熒光檢測儀讀數(shù)得出檢測濃度，按公式(1)進行計算。

(1)

(4)精密度

精密度依據(jù)批內(nèi)精密度，指同一批次產(chǎn)品檢測同一樣本結(jié)果的重復性，用變異系數(shù)(CV)表示。分別選擇低、中、高3種濃度的DON和ZEN標準溶液，采用不同批次的測試卡，重復10次試驗，計算出同批次和不同批次批間的變異系數(shù)(CV)。

變異系數(shù)(CV)=標準差/檢測均值/100%

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的建立

從圖2、圖3可以看出曲線橫坐標采用的是濃度的自然對數(shù)，通過計算繪制得到的曲線是平滑的S型曲線，在0.5～50 ng/mL濃度范圍內(nèi)，DON的有效抑制率在78%～3%，線性回歸相關系數(shù)為R2=0.990 1，直線方程y= -0.197 1x+ 0.623 4；在0.25～25 ng/mL濃度范圍內(nèi)，ZEN的有效抑制率在86%～14%，線性回歸相關系數(shù)為，直線方程y= -0.187 2x+ 0.597 8。從而確定了DON和ZEN的標準曲線的線性范圍，并以此作為以下實驗的線性濃度。

圖2 DON不同濃度(0.2～50 ng/mL)平滑曲線

圖3 ZEN不同濃度(0.2～50 ng/mL)平滑曲線

2.2 靈敏度

在優(yōu)化的測定條件下，對于DON，0濃度T/C的均值為3.006 2，標準差s為0.209 1，方法的靈敏度為0.42 ng/mL。而對于ZEN，0濃度T/C的均值為1.229 5，標準差s為0.071 6，方法的靈敏度為0.17 ng/mL。

2.3 定量限與檢出限

對小麥、玉米的空白基質(zhì)進行檢測并計算后結(jié)果如表1，該方法中，DON的檢出限為91.7 μg/kg，定量限為215.6 μg/kg，ZEN的檢出限為10.05 μg/kg，定量限為20.13 μg/kg。

表1 DON及ZEN檢出限及定量限

2.4 精密度

分別采用不同批次的熒光層析卡對低、中、高3種濃度的DON與ZEN標準溶液進行十次檢測，批次內(nèi)和批次間的CV值分別在4.93%～6.83% 和5.39%～9.25%(表2)，批內(nèi)和批間CV均小于10%，說明該方法熒光層析卡均一性良好。

表2 熒光測試卡檢測DON、ZEN的精密度試驗(n=10)

2.5 準確度

根據(jù)國家限量標準以及本方法的線性范圍，我們設定了3個濃度，涵蓋了低、中、高濃度的加標回收測定。分別在陰性小麥和玉米中加入不同濃度水平的DON和ZEN標準溶液，DON加標濃度分別為500、1 000、2 000 μg/kg，ZEN加標濃度分別為30、60、120 μg/kg，TRFIA重復測定5次，DON的平均回收率在93.5%～106.5%，ZEN的平均回收率在88.9%～108.7%(見表3和表4)。

表3 小麥、玉米不同 DON濃度加標回收率

表4 小麥、玉米不同 ZEN濃度加標回收率

3 結(jié)論

本研究基于時間分辨熒光標記技術，應用免疫反應原理，開發(fā)出了DON-ZEN一體式時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡。結(jié)合現(xiàn)代光電轉(zhuǎn)換技術及AI算法，在多通道時間分辨熒光免疫分析儀上，實現(xiàn)了一次取樣、一次樣本前處理、一次加樣的一體式嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素的同步檢測。對所建立的方法進行了一系列參數(shù)優(yōu)化，該方法的DON的檢出限為91.7 μg/kg，定量限為215.6 μg/kg，ZEN的檢出限為10.05 μg/kg，定量限為20.13 μg/kg。樣品中DON的平均回收率在93.5%～106.5%，ZEN的平均回收率在88.9%～108.7%。

所建立的一體式時間分辨免疫熒光免疫層析定量卡操作簡單，樣品前處理只需要用甲醇簡單振蕩提取，經(jīng)稀釋后即可同時測定一個樣本中兩種毒素的含量，整個操作過程更快速、更方便、更經(jīng)濟，極大地滿足了糧食收儲及糧食制品加工企業(yè)的日常檢測需求。