噬菌體仲裁通訊系統(tǒng)的研究進(jìn)展

焦文豪，徐冰紅，劉 靜，劉培源，嚴(yán)漢池

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

細(xì)胞決策指導(dǎo)生物體的發(fā)育，研究細(xì)胞命運(yùn)選擇發(fā)生的具體機(jī)制至關(guān)重要［1］。目前在不同噬菌體中發(fā)現(xiàn)了復(fù)雜的決策行為，包括細(xì)菌及噬菌體的特異性相互作用［2］、噬菌體子代之間的小分子通訊［3］等行為。其中溫和噬菌體在裂解循環(huán)中產(chǎn)生大量噬菌體顆粒釋放到環(huán)境中［4］，而在溶原循環(huán)中，噬菌體將其DNA 整合到宿主基因組中，與宿主建立潛在的有益關(guān)系［5］，使宿主不受同一噬菌體的感染［6］。近年來，在感染枯草芽孢桿菌的SPbeta 噬菌體中發(fā)現(xiàn)一種新的通訊系統(tǒng)，稱為仲裁通訊系統(tǒng)［7］。仲裁系統(tǒng)本質(zhì)上代表了噬菌體編碼的群體感應(yīng)系統(tǒng)［8］，該系統(tǒng)由3 個噬菌體基因組成：aimP，編碼43 個氨基酸的前體仲裁（arbitrium）肽，分泌到胞外加工成6 個氨基酸的成熟信號肽，再次轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞與AimR 蛋白結(jié)合，解除AimR 蛋白對aimX基因的調(diào)控作用，使噬菌體進(jìn)入溶原周期；aimR，編碼的AimR 蛋白結(jié)構(gòu)上類似于RRNPP 蛋白（革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白）結(jié)構(gòu)，是AimP 編碼肽的胞內(nèi)受體，同時作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控aimX基因的表達(dá)；aimX編碼一個非編碼RNA 作為溶原性的負(fù)調(diào)控蛋白。在整個仲裁系統(tǒng)中，AimR 作為最關(guān)鍵的蛋白對決定噬菌體進(jìn)入溶原裂解周期有重要影響。噬菌體的通訊系統(tǒng)對其自身和與細(xì)菌整體進(jìn)化都起到了重要作用［9］，因此對噬菌體通訊系統(tǒng)的研究受到廣泛關(guān)注。本研究對AimR 蛋白的結(jié)構(gòu)特征、肽作用原理進(jìn)行綜述，希望為進(jìn)一步研究這種蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及利用通訊系統(tǒng)進(jìn)行病害防治提供參考。

1 AimR 蛋白及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征

1.1 AimR 蛋白的結(jié)構(gòu)特征

AimR 蛋白全長386 個氨基酸，由N-末端螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（Helix-turn-helix，HTH）DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain，DBD，殘基1-73）和專門識別仲裁肽的C-末端的三十四肽重復(fù)序列域（Tet?ratricopeptide repeat，TPR，殘基 79-386）組成，中間由短連接器（殘基 74-78）連接［10］。全長AimR 蛋白由24 個螺旋二級結(jié)構(gòu)組成（圖1）。其中前5 個螺旋形成 DBD 域，其余 α-螺旋分為 8 個 TPR 域和 C 端帽狀限制螺旋。AimR 蛋白在溶液中以具有活性的二聚體形式存在，其二聚作用由C 端限制螺旋介導(dǎo)，其中 L383、L380、L384 和 L386 通過與其他單元的匹配殘基形成范德華相互作用而導(dǎo)致二聚作用。同時AimR 單體通過其N-末端和C-末端之間的相對排列而產(chǎn)生咀嚼狀運(yùn)動［11］。對AimR 蛋白表面靜電勢分析發(fā)現(xiàn)，DBD 表面有一個較大的具有DNA 結(jié)合活性的正電荷區(qū)，可與DNA 結(jié)合介導(dǎo)裂解過程。同時每個AimR 蛋白單體的構(gòu)象略有不同，為AimR 蛋白質(zhì)帶來一定的可塑性［12］。

1.2 AimR-AimP 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征

細(xì)菌表面寡肽通透酶轉(zhuǎn)運(yùn)體（Oligopeptide per?mease transporter，OPP）將仲裁肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)并提高濃度后AimR 受體與肽結(jié)合，介導(dǎo)噬菌體進(jìn)入溶原周期［13］。在AimR-AimP復(fù)合物結(jié)構(gòu)中（圖1），2個AimR蛋白分子同樣由C端限制螺旋介導(dǎo)形成同型二聚體，TPR 域形成一個深凹的口袋，氨基部分稍微打開，小內(nèi)腔寬度增加，以使每個AimR分子結(jié)合一個AimP六肽（GMPRGA）［14］。同時AimP 結(jié)合引起 AimR N 端構(gòu)象的細(xì)微變化，使AimR 分子形成了一個擴(kuò)展但更嚴(yán)格的DBD域，阻止了AimR蛋白與aimX啟動子區(qū)的結(jié)合，降低了AimR的DNA結(jié)合能力。

在 AimR-AimP 復(fù)合物中，AimP 六肽的 C 端丙氨酸面向口袋內(nèi)部，N 端甘氨酸位于入口點(diǎn)。這些肽與受體的結(jié)合主要通過極性相互作用來協(xié)調(diào)，特別是通過AimR 蛋白家族中保守的Arg、Asp、Gln、Asn 和 Glu 來實現(xiàn)。在 phi3T 噬菌體中，phAimR 的Asn195、Arg 221、Gln291 和 Asp352 通過鹽橋和氫鍵與SAIRGA 六肽結(jié)合。而在SPbeta 噬菌體中，AimR和AimP 之間的相互作用是由廣泛的氫鍵和疏水接觸網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)，AimR 肽主鏈上的氧原子與4 個AimP 殘基形成了氫鍵［12］：Q299AimR 、E300AimR 與G1AimP 氮部分相互作用，N239AimR 與 P3AimP 形成氫鍵，N202AimR 與 G5AimP 相互作用，R228AimR與A6AimP 的氧基接觸，而AimR 的5 個疏水殘基（L205、L242、F276、F362、L363）與 M2AimP 的側(cè)鏈發(fā)生范德華相互作用。此外利用單點(diǎn)突變，證實了AimR 的 N202、N206、N239、N299、N329 和 D360 殘基對與AimP 結(jié)合有重要作用，這些殘基可能形成噬菌體在溶原裂解之間轉(zhuǎn)換的開關(guān)。

1.3 AimR-DNA 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征

在肽濃度低的時候，AimR 特異性靶向aimP基因下游的51 bp DNA 序列，該序列包含一個31 bp 的回文序列（5ACTTAAATATTAGGTTTTAATAACATC?TAGT3），AimR 與回文序列結(jié)合，激活aimX轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)噬菌體進(jìn)入裂解途徑［14］。回文序列中，A、C 堿基是AimR 與DNA 識別的關(guān)鍵，仲裁肽的存在和核苷酸的缺失都會導(dǎo)致回文序列與受體結(jié)合能力明顯降低［15］。在 AimR- DNA 復(fù)合物（圖1）中，整體結(jié)構(gòu)和二聚體排列與AimR 相似，AimR-DNA 復(fù)合物通過典型的HTH 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行DNA 識別，而來自TPR 結(jié)構(gòu)域的殘基與間隔DNA 主鏈相互作用。DNA 結(jié)合型的AimR 二聚體有2 個相互作用面：一個與單獨(dú)AimR 及AimR-肽結(jié)合形式相同，由C 端限制螺旋介導(dǎo)；另一個由每個原體的螺旋6、螺旋7 和loop 7 的殘基 Glu132、Tyr161 和 Asn166 生成，這些殘基彼此形成氫鍵［14］。

AimR 與DNA 的相互作用主要由N 端區(qū)介導(dǎo)，包括廣泛的氫鍵和離子相互作用，產(chǎn)生2 個作用界面［14］。首先，AimR 二聚體的每個原體通過其 DBD 區(qū)域?qū)ΨQ地與DNA 片段的主要溝槽結(jié)合。每個DBD域的識別螺旋α3 面向DNA 軸，并通過殘基Asn30 和Asn32 的側(cè)鏈與主溝的堿基特異性地相互作用。其次，N 端正電荷斑塊中的 10 個殘基（Lys29、Lys43、Thr44、Asn46、Lys77、Thr78、Lys79、Arg82、Asn109、Lys145）參與了 A9、T10、T11、A20、T28、A29、G30、T7′、G8′、T9′、T26、T27′和 A29′的骨架磷酸鹽的配位，構(gòu)成了第二個DNA結(jié)合界面。與肽結(jié)合型AimR相比，DNA 結(jié)合型AimR 組裝的二聚體更為封閉，并且肽結(jié)合引起的構(gòu)想改變縮短了AimR 的DNA 識別螺旋之間的間距，使AimR 不能與DNA 結(jié)合。

2 仲裁通訊系統(tǒng)的作用機(jī)制

2.1 仲裁肽調(diào)控模型

大腸桿菌噬菌體的裂解-溶源決定已被廣泛研究，其主要受感染細(xì)胞的代謝狀態(tài)和感染噬菌體數(shù)量的影響［16］。在λ 噬菌體中，其裂解-溶源決定受噬菌體編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CⅠ、CⅡ和Cro 之間的相互作用以及宿主編碼許多因子的影響［17］。溶原狀態(tài)的主調(diào)控因子是CⅠ阻遏蛋白，它與裂解基因的啟動子結(jié)合并抑制其表達(dá)［18］。當(dāng)噬菌體大量存在時，CⅠ阻遏蛋白抑制噬菌體裂解基因，使噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)。

在仲裁系統(tǒng)中，aimX基因編碼一個短的（51 個氨基酸）開放閱讀框，其后是一個62 個堿基的非編碼 RNA 區(qū)域，在一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)處終止［15］。aimX 基因與CⅠ基因重疊，可以轉(zhuǎn)錄形成順式反義RNA，這種順式反義轉(zhuǎn)錄本可以通過抑制翻譯或刺激RNA降解來沉默重疊的基因［19］。在裂解條件下，aimX通過反式調(diào)控抑制了CⅠ阻遏蛋白的表達(dá)。這種沉默反過來在仲裁肽的存在下得到緩解，從而導(dǎo)致aimX表達(dá)受到抑制。這些結(jié)果為仲裁肽介導(dǎo)的溶源決策提供了一個完整的模型：SPbeta 噬菌體感染細(xì)菌初期，噬菌體表達(dá)aimR和aimP基因。二聚體AimR 蛋白與特定的DNA 結(jié)合，激活aimX編碼一個非編碼RNA 作為溶原周期的負(fù)調(diào)控蛋白，進(jìn)而抑制CⅠ阻遏蛋白表達(dá)，阻斷溶原的發(fā)生。AimP 被釋放到胞外后，被胞外蛋白酶加工成成熟的仲裁肽，經(jīng)過幾個感染周期后，仲裁肽會在環(huán)境中積累。通過OPP 通道內(nèi)化到鄰近細(xì)胞中。在后期階段，噬菌體會感染胞內(nèi)肽濃度較高的細(xì)胞，這種情況下，AimR 與仲裁肽結(jié)合，阻止了aimX的表達(dá)。隨后，噬菌體CⅠ阻遏蛋白表達(dá)并與裂解基因的啟動子結(jié)合，抑制其表達(dá)并進(jìn)入穩(wěn)定的溶原狀態(tài)（圖2）。

2.2 仲裁肽的特異性結(jié)合影響決定

仲裁系統(tǒng)已經(jīng)在100 多種噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，仲裁肽多為6 肽，在個別噬菌體中也可長達(dá)10 個氨基酸［20］。仲裁肽的序列不盡相同，其中80%的仲裁肽分布在6個大家族中（GMPRGA、GVVRGA、GFGRGA、SASRGA、GFTVGA、SAIRGA），其高度保守的 RGA C-端區(qū)域和可變的N 端區(qū)域解釋了肽受體的特異性，保守的RGA 基序和主鏈與受體蛋白的結(jié)合通過AimR 中完全保守的 N202、R228 和 T236 殘基來實現(xiàn)［15］。其中Ala 側(cè)鏈夾在2 個保守的疏水殘基之間，Arg 與嚴(yán)格保守的D360 形成鹽橋。肽的N 端部分賦予了肽的可變性，AimR 殘基（SPbeta 中的 A273 和M296）與肽的第三位相互作用是高度可變的。并且肽的N 端部分通過與受體中高度保守的殘基相互作用進(jìn)行錨定，確保了受體可讀出肽的正確構(gòu)象。

由于肽的可變性，仲裁肽只與來自同一噬菌體的相應(yīng)AimR 受體特異性結(jié)合，觸發(fā)裂解-溶原轉(zhuǎn)化。成熟的SPbeta AimP 仲裁肽為GMPRGA，其序列與phi3T 的SAIRGA 肽不同。GMPRGA 肽沒有顯示出與phi3T AimR 受體的特異性結(jié)合，GMPRGA 肽也只促進(jìn)SPbeta 的溶原，不影響phi3T 的溶原。這些結(jié)果表明，序列特異性肽指導(dǎo)噬菌體溶原發(fā)生在特異性噬菌體中。雖然仲裁肽的存在對噬菌體的溶原作用有顯著影響，但這種影響不是絕對的［21］。即使肽濃度高的情況下，溶原發(fā)生的概率只是明顯升高，并不是全部溶原化；同樣，在缺乏肽的情況下，噬菌體也不會發(fā)生專性裂解。因此，噬菌體有一個隨機(jī)、獨(dú)立溶菌化的趨勢。

2.3 仲裁肽影響AimR 受體的構(gòu)象改變

AimR 的結(jié)構(gòu)具有內(nèi)在的靈活性，影響了HTH結(jié)構(gòu)域在二聚體中的相對分布，當(dāng)與AimP 結(jié)合后AimR 表現(xiàn)出更緊密的構(gòu)象，引起超螺旋螺距的減小。AimP 結(jié)合引起的閉合運(yùn)動減少了TPR 域N 端和C 端之間的距離，允許2 個子域殘基之間形成新的相互作用，從而穩(wěn)定肽結(jié)合構(gòu)象［15］。同單獨(dú)AimR 和 DNA 結(jié)合形式比較，AimR-AimP 二聚體中2 個單體幾乎完全相同，表明肽與TPR 域相互作用引起的封閉結(jié)構(gòu)使AimP 穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，迫使TPR 域N 端C 端的接近來實現(xiàn)這些交互。此外，AimR 蛋白的N 端和C 端在不同的構(gòu)象中幾乎是相同的，而連接區(qū)域起著鉸鏈的作用，表明AimR 閉合更像是一種剛體運(yùn)動，同時序列分析也表明，該連接子在AimR 受體中高度保守，因此連接區(qū)域一定是AimP誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件。

在沒有仲裁肽的情況下，二聚體AimR 表現(xiàn)出動態(tài)的開放和封閉構(gòu)象，分別有利于與肽和DNA 結(jié)合。肽結(jié)合后，AimR 處于開放狀態(tài)，很難過渡到封閉狀態(tài)。然后，肽抑制AimR 與目標(biāo)DNA 結(jié)合。同樣，這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變抑制機(jī)制在不同的噬菌體中也存在差異［22］。在phi3T 噬菌體中，肽結(jié)合可以完全破壞AimR 蛋白的二聚體狀態(tài)，導(dǎo)致其向單體狀態(tài)轉(zhuǎn)移，降低其DNA 結(jié)合活性。在SPbeta 噬菌體中，AimR 與AimP 結(jié)合后，發(fā)生構(gòu)象改變進(jìn)而失去DNA結(jié)合活性，但其二聚體狀態(tài)并未改變，肽實際上通過鎖定AimR 二聚體的形式來促進(jìn)溶源。這意味著在SPbeta 噬菌體的仲裁系統(tǒng)中，AimP 通過一種不同于phi3T 噬菌體中相應(yīng)機(jī)制的機(jī)制來滅活A(yù)imR，說明噬菌體中至少存在2 種不同的寡聚化調(diào)控機(jī)制。

2.4 仲裁肽影響AimR 受體與DNA 的結(jié)合

AimR 在無肽狀態(tài)下是一種轉(zhuǎn)錄激活子，AimR的N 端部分對DNA 靶向至關(guān)重要，同時二聚體的形成對其DNA 結(jié)合特性也十分重要。AimR 的DNA結(jié)合活性，實際是由仲裁肽調(diào)節(jié)。肽施加的剛性阻止了AimR 與DNA 的結(jié)合，也證實了AimR 的可塑性對DNA 結(jié)合至關(guān)重要，AimR 是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活的DNA 結(jié)合蛋白，它們在與肽結(jié)合后失去活性，對SP?beta 噬菌體的裂解溶原決策是至關(guān)重要的。

在仲裁系統(tǒng)中，AimR 在不存在仲裁肽的情況下作為二聚體與噬菌體DNA 結(jié)合，是aimX 的轉(zhuǎn)錄激活體，激活aimX 轉(zhuǎn)錄aimX 通過順反義機(jī)制直接抑制CI 抑制因子，阻斷溶原的發(fā)生；反過來aimX 的沉默會導(dǎo)致溶原增加。AimR 與仲裁肽結(jié)合后，失去其DNA 結(jié)合活性，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，以確定噬菌體溶原裂解過程的轉(zhuǎn)變［15］。仲裁肽影響AimR 受體與DNA 的結(jié)合是通過改變AimR 受體的構(gòu)想來實現(xiàn)的，噬菌體phi3T 的AimR 受體在結(jié)合了仲裁肽SAIRGA 后，其低聚物狀態(tài)從二聚物變?yōu)榉腔钚詥误w，抑制aimX 轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致溶原性。而添加SPbeta GMPRGA 肽并沒有導(dǎo)致SPbeta AimR 寡聚狀態(tài)的改變，AimR 蛋白仍為二聚體狀態(tài)，但AimP 結(jié)合引起AimR N 端構(gòu)象的變化，使 AimR 蛋白不能與 aimX 啟動子區(qū)結(jié)合，aimX 沉默進(jìn)入溶原途徑。不同構(gòu)象改變也說明了肽與其受體在仲裁系統(tǒng)中的高度特異性，都導(dǎo)致2 個菌株偏向溶原。

3 AimR 蛋白屬于 RRNPP 家族

群體感應(yīng)現(xiàn)象是細(xì)菌調(diào)節(jié)自身密度的重要方法，其中起重要作用的是RRNPP 蛋白家族［23］。RRNPP蛋白家族是重要的胞質(zhì)肽感應(yīng)調(diào)節(jié)因子，包括5 個代表性成員，即Rap、Rgg、NprR、PICR 和PrgX，它們在控制細(xì)菌群體感應(yīng)中有重要作用［24］。通過群體感應(yīng)，細(xì)菌能夠產(chǎn)生和響應(yīng)小信號分子參與細(xì)胞間交流，可通過細(xì)菌毒力因子表達(dá)、細(xì)菌結(jié)合、生物膜形成、孢子形成、抗生素合成等多種生理過程來調(diào)節(jié)種群密度，對維持細(xì)菌的菌群數(shù)量有重要作用［25］。

與在仲裁系統(tǒng)中一樣，RRNPP 家族由一個細(xì)胞質(zhì)受體和一個短的（5~10 個氨基酸）信號肽組成［26］。RRNPP 家族調(diào)節(jié)因子與信號肽結(jié)合激活后，肽段通過調(diào)節(jié)RRNPP 受體的低聚物狀態(tài)或構(gòu)象的改變來發(fā)揮作用［27］。例如，NprX 與對應(yīng)肽的結(jié)合促進(jìn)了二聚體NprR 向四聚體的轉(zhuǎn)化，四聚體專門針對DNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)［28］。除了Rap亞家族外，所有的RRNPP成員都有一個N 端HTH 基序與DBD 域的雙域結(jié)構(gòu)和一個 C 端的肽結(jié)合域［29］。RRNPP 家族成員的結(jié)構(gòu)特征表明肽結(jié)合域是由TPR 域組成，該重復(fù)序列采用超螺旋折疊，內(nèi)凹槽為肽結(jié)合處。與仲裁系統(tǒng)類似，肽與TPR 域的結(jié)合調(diào)節(jié)RRNPP 受體的轉(zhuǎn)錄活性。這些相似性表明，仲裁系統(tǒng)是RRNPP 家族的成員，具有相似的作用機(jī)制。結(jié)構(gòu)上也顯示短肽結(jié)合在AimR 的螺旋空腔里面，表明AimR 屬于RRNPP蛋白家族。雖然AimR 屬于RRNPP 蛋白家族，AimR對GMRPGA 肽的調(diào)節(jié)方式與經(jīng)典的RRNPP 轉(zhuǎn)錄因子相似，但與不包括側(cè)鏈特異性接觸的RRNPP 與信號肽的相互作用不同，它們之間的調(diào)節(jié)機(jī)制也存在一定差異。

4 小結(jié)與展望

仲裁系統(tǒng)的研究說明肽通訊對噬菌體和細(xì)菌的協(xié)同進(jìn)化有重要作用，表明噬菌體群體感應(yīng)是生物學(xué)中值得研究的重要方面。仲裁系統(tǒng)中，3 個基因各司其職，保障了噬菌體高效合理的生存。其中胞內(nèi)肽濃度是噬菌體進(jìn)入溶原或裂解途徑的關(guān)鍵，而肽序列具有多樣性，不同的噬菌體之間通過不同的分子語言向同類傳遞信息，表明了噬菌體特異性的進(jìn)化驅(qū)動力，為深入了解病毒和微生物社會網(wǎng)絡(luò)的分子通信機(jī)制提供了思路。目前具備仲裁系統(tǒng)的噬菌體依賴特定細(xì)菌，只侵染具有OPP 通道和胞外蛋白酶的芽孢桿菌，表明仲裁系統(tǒng)只是噬菌體通訊系統(tǒng)的一部分，可能只存在于感染特定細(xì)菌的噬菌體中。同時噬菌體構(gòu)成了很大的社會網(wǎng)絡(luò)，有關(guān)仲裁系統(tǒng)的研究對了解整個噬菌體的群體感應(yīng)有重要借鑒意義，也為其他方面的研究打開一些思路。例如，仲裁系統(tǒng)為噬菌體提供了一定機(jī)制來估計感染的數(shù)量，而這種策略是否存在于感染真核生物的病毒中來介導(dǎo)休眠或裂解，其他基因是否參與了噬菌體的群體感應(yīng)等，還有待考證；噬菌體中是否存在串?dāng)_現(xiàn)象等也有待研究。相信隨著仲裁系統(tǒng)的深入研究，這些問題會得到解答。