miRNA對水稻脅迫應答及產(chǎn)量調(diào)控影響的研究進展

于雅潔，李紹清

（武漢大學生命科學學院/雜交水稻國家重點實驗室，武漢 430072）

MicroRNA（miRNA）是長度為 20~24 nt 的一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在動植物體內(nèi)都大量存在［1，2］。水稻（Oryza sativaL.）作為重要的糧食作物，為全球超過1/5 人口提供口糧，但各種生物及非生物脅迫均會對水稻質(zhì)量及產(chǎn)量產(chǎn)生影響。因而如何提高水稻應對脅迫的能力，并提高水稻產(chǎn)量成為科學家們研究的重點。本研究論述了miRNA 在增加水稻產(chǎn)量和應對水稻脅迫方面的作用，以期為水稻種質(zhì)資源挖掘和品種改良提供新的研究思路。

1 miRNA 的發(fā)現(xiàn)及作用機制

1.1 miRNA 的發(fā)現(xiàn)

1993 年，研究秀麗隱桿線蟲的生物學家在線蟲中發(fā)現(xiàn)了一種常見的21 個核苷酸的RNA 片段，將其命名為lin-4。lin-4抑制了核蛋白lin-14 的表達，通過該方式調(diào)節(jié)線蟲發(fā)育［3］。

2000 年，科學家在線蟲中又發(fā)現(xiàn)了一種small RNA。同lin-4類似的是，該small RNA 也可以通過結合一些靶基因mRNA的3′-UTR 而調(diào)節(jié)線蟲的發(fā)育，這種 small RNA 被命名為let-7［4］。

為了探究植物中是否存在miRNA，2002 年，遺傳學家從擬南芥中分離出了許多微小的RNA 片段，通過克隆所有在microRNA 大小范圍內(nèi)的RNA 并分析了它們序列的某些特征，發(fā)現(xiàn)了16 個miRNA，并將其命名為miR156至miR171，這是首次在植物中發(fā)現(xiàn) miRNA 的存在［5］。

近年來，隨著高通量測序技術逐漸成熟，已經(jīng)從多種動植物中鑒定出38 589 條保守的或物種特異的miRNA［6，7］。 這 充 分 說 明 miRNA 研 究 領 域 快 速 發(fā)展，并從側面證明miRNA 廣泛參與動植物的生理生化過程。

1.2 miRNA 的作用機制

動植物細胞內(nèi)的miRNA 均為短序列RNA，不會編碼蛋白質(zhì)，并且都有很高的保守性［8］。動物和植物在miRNA 產(chǎn)生方式上存在差異，并且植物miR?NA 和動物miRNA 在進化上是獨立進行的，因此植物和動物的miRNA 在序列、前體以及成熟過程等方面都有所區(qū)別［9-11］。

動物miRNA 在進化上非常保守，線蟲體內(nèi)55%的miRNA 都可以在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其同源物［12］。miR?NA 在動物中與靶基因 mRNA 的 3′UTR 區(qū)特異結合，從而引起mRNA 的降解或抑制蛋白的翻譯。其中miRNA 中心位點處與靶基因的結合允許一定數(shù)量的堿基錯配［13，14］。動物中大多數(shù) miRNA 是 RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，但一些人類miRNA 已被證明是RNA 聚合酶Ⅲ活性的產(chǎn)物［13，15］。

植物miRNA 的合成過程十分精確，miRNA 與靶基因編碼區(qū)特定位點在植物中會以完全互補（或接近完全互補）的方式結合。通過切割靶基因的mRNA，植物 miRNA 對其進行調(diào)控［9］。

2 miRNA 對水稻生物脅迫的調(diào)控

全球1/5 的人口以稻米為主要糧食作物。雖然近幾十年來水稻產(chǎn)量持續(xù)增加，但伴隨著農(nóng)藥的廣泛使用，水稻生產(chǎn)中病原菌耐藥性現(xiàn)象愈發(fā)嚴重，病害發(fā)生越來越頻繁，病原菌逐漸成為全球水稻生產(chǎn)的主要威脅之一，因此迫切需要提高水稻植株抵御有害微生物的能力，研究發(fā)現(xiàn)miRNA 可以從多種途徑調(diào)控水稻的生物脅迫響應，因而miRNA 成為水稻抗病的一個重要突破口。

2.1 miRNA 對水稻應對稻瘟病的調(diào)控

稻瘟病會對水稻產(chǎn)量產(chǎn)生很大的威脅，因而明晰稻瘟病的發(fā)病機制及采取有效的預防措施成為穩(wěn)定水稻產(chǎn)量的重要措施之一。

OsmiR7695是第一個被發(fā)現(xiàn)的參與稻瘟病調(diào)控網(wǎng)絡的miRNA，通過負調(diào)控其靶基因OsNramp、OsmiR7695可以促進水稻對稻瘟病的抗性［16］。Li等［17］通過對正常條件下以及在稻瘟病感染時易感植株和抗性植株的小RNA 文庫進行深度測序，發(fā)現(xiàn)過表達OsmiR160a和OsmiR398b的轉(zhuǎn)基因水稻植株同樣表現(xiàn)出對稻瘟病的抗性增強。通過對感病植株和抗性植株的分析，Li 等［18］發(fā)現(xiàn)OsmiR169a的表達量在感病植株中明顯上升。并且NF-YA 的家族成員作為OsmiR169a的靶基因，其表達量在過表達OsmiR169a的植株中呈下降的趨勢。這一結果暗示著OsmiR169通過抑制NF-YA基因的表達從而在水稻對稻瘟病菌的免疫中起負調(diào)控作用。在水稻對稻瘟病的抵御中，ARF12基因同樣起到重要作用，ARF12是OsmiR167d的靶基因，在過表達OsmiR167d的植株中觀察到該基因的表達量降低，同時伴隨著植株對稻瘟病的抗性降低，因此OsmiR167d-ARF12調(diào)控模塊在提高水稻抗病性方面具有一定的應用價值［19］。作為抗稻瘟病的陽性因子，OsTCP21受OsmiR319b的調(diào)控。在過表達OsmiR319b的植株中，OsTCP21的表達量降低，而與OsTCP21表達相關的OsLOX2/5的表達量同樣呈降低的趨勢，最終導致植株對稻瘟病抗病性下降［20］。OsmiR396是水稻中十分重要的小RNA 家族之一，通過抑制多個不同Os?GRFs因子的表達，OsmiR396負調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性，在過表達OsmiR396后，水稻對稻瘟病的抗性下降［21］。植物在防御稻瘟病中的一個有效方法是通過RNAi 系統(tǒng)識別和破壞病毒產(chǎn)生的RNA 分子，而這一過程依賴AGO 家族蛋白，其中就包括AGO1。而 Wu 等［22］發(fā)現(xiàn)，OsmiR168會負調(diào)控植物內(nèi)AGO1 的表達，且在感病植株中觀察到OsmiR168的表達量上升，除了AGO1 之外，AGO18 可以通過與OsmiR168結合，降低其對AGO1 的影響，從而增強植株的抗病性。

2.2 miRNA 對水稻應對條紋葉枯病的調(diào)控

在水稻的常見病害中，條紋葉枯病會對水稻產(chǎn)量造成嚴重的威脅，因而控制水稻條紋葉枯病的發(fā)病也是現(xiàn)階段科學家們需要攻克的難題之一。

在水稻中，通過抑制OsmiR171b的表達，Tong等［23］發(fā)現(xiàn)水稻表現(xiàn)出葉片發(fā)育遲緩且葉綠素含量降低的癥狀，而這一癥狀與水稻感染條紋葉枯病的癥狀相似。過表達OsmiR171b的水稻中對條紋葉枯病的敏感性降低，且條紋葉枯病的癥狀減輕。Wang等［24］發(fā)現(xiàn)OsmiR444是 影 響抗 病 毒 信 號 傳遞 到OsRDR1的關鍵因素，水稻在被病毒感染后體內(nèi)Os?miR444的表達增強。隨后，OsmiR444的過表達進一步增強了水稻對條紋葉枯病的抗性，而抗性的上調(diào)則是通過上調(diào)OsRDR1的表達實現(xiàn)的。通過進一步分析，他們發(fā)現(xiàn)在OsmiR444上調(diào)后，OsMADS23、Os?MADS27a和OsMADS57作為OsmiR444的靶基因，其對OsRDR1轉(zhuǎn)錄的抑制作用被降低。這些結果表明，一個OsmiR444及其MADS box 靶點直接控制OsRDR1轉(zhuǎn)錄從而參與水稻抗條紋葉枯病的調(diào)控。

為了研究水稻對條紋葉枯病的反應，Yang 等［25］通過深度測序篩選出了與條紋葉枯病相關的miR?NA 及mRNA，并進一步通過qRT-PCR 分析所選的miRNA 及mRNA 的表達差異發(fā)現(xiàn)，針對條紋葉枯病，OsmiR1423-5p和OsmiR1870-5p表達上調(diào)，其對應的靶標基因RPM1和EFRmRNA 表達下調(diào)，這證明通過上調(diào)相應miRNA 的表達，植物會對條紋葉枯病產(chǎn)生相應的抵御反應。相似地，Yao 等［26］前期試驗發(fā)現(xiàn)OsmiR528通過調(diào)控其靶標基因L Ascorbate Oxidase（AO）的表達，植物表現(xiàn)出對條紋葉枯病抗性降低，說明OsmiR528在植物應對條紋葉枯病中起負調(diào)控作用，而后期他們發(fā)現(xiàn)，OsmiR528-AO這一防御模塊是由轉(zhuǎn)錄因子SPL9 所調(diào)控，通過特異性結合OsmiR528啟動子區(qū)域，SPL9 可以正向調(diào)控Os?miR528的表達，進一步降低AOmRNA 的水平，從而導致水稻對條紋葉枯病的抗性降低。

3 miRNA 對水稻非生物脅迫的調(diào)控

非生物脅迫特別是干旱、鹽堿等是限制植物生長、發(fā)育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的因素。因此，如何在外界環(huán)境不利于水稻生長的情況下，通過水稻體內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡積極應對非生物脅迫，進而降低外界環(huán)境對水稻生長的不利影響，這成為了科學家需要攻克的難點。

3.1 miRNA 對水稻應對干旱的調(diào)控

在水稻生產(chǎn)中，由于降雨不足造成的干旱往往會限制水稻的產(chǎn)量。Zhang 等［27］通過對水稻中miR?NA 敲除株系的大規(guī)模篩選，鑒定出OsmiR166敲除株系（STTM166）的植物表現(xiàn)出卷葉表型，而該表型通常是水稻受到干旱脅迫時所表現(xiàn)的。STTM166水稻植株的葉片具有較小的球狀細胞和異常的厚壁細胞，并且STTM166 植株氣孔導度降低，蒸騰速率降低，這些變化可以有效地減少植株體內(nèi)水分的蒸發(fā)。敲除OsmiR166后，水稻發(fā)生了形態(tài)變化，從而一定程度獲得抗旱性。Xia 等［28］通過研究發(fā)現(xiàn)，作為水稻生長素受體OsTIR1和OsAFB2可以被OsmiR393靶向調(diào)節(jié)。過表達OsmiR393后，水稻植株的抗旱性降低。Fang 等［29］在研究中發(fā)現(xiàn)，OsmiR164靶向的NAC基因是水稻抗旱性的負調(diào)控因子，在水稻中有6 個OsmiR164靶向的NAC基因（OMTN1至OMTN6），OMTN2、OMTN3、OMTN4、OMTN6過表達對生殖期抗旱性有負向影響。Tian 等［30］則證明了OsmiR162b通過調(diào)節(jié)其靶標基因OsTRE1的表達增加了水稻的抗旱性。

3.2 miRNA 對水稻應對冷脅迫的調(diào)控

環(huán)境條件對植物的生長發(fā)育有重要影響。除了干旱條件之外，冷脅迫同樣是阻礙作物生長和導致減產(chǎn)的環(huán)境脅迫之一。

Xu 等［31］在對水稻的低溫脅迫中通過用富氫水預處理，模擬冷脅迫時內(nèi)源H2產(chǎn)生的生理誘導，而H2的耐冷能力與miRNA（包括OsmiR398和OsmiR319）及其靶基因（包括CSD1、CSD2、PCF5和PCF8）表達水平的變化有部分關系。Tang等［32］發(fā)現(xiàn)，水稻中轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控許多與植物耐低溫相關的應激反應相關。OsmiR528通過靶向OsMYB30 的正調(diào)節(jié)蛋白基因（Os06g06050）的F-box區(qū)域，降低了轉(zhuǎn)錄因子OsMYB30的表達。在OsmiR528轉(zhuǎn)基因水稻中，OsMYB30 表達降低導致 OsBMY2、OsBMY6 和 OsBMY10 表達增加，提示OsmiR528通過調(diào)節(jié)應激反應相關轉(zhuǎn)錄因子的表達來提高低溫耐受性。

3.3 miRNA 對水稻應對鎘污染的調(diào)控

有毒重金屬由于其不可降解的性質(zhì)，可以在植物中積累，最終影響人體健康。作為一種非必需的的重金屬，鎘污染是造成食物鏈污染的最重要因素之一，且鎘對植物有著很高的毒性。

為了研究miRNA 在鎘脅迫下的響應功能，Ding等［33］使用微陣列分析了miRNA 在鎘脅迫水稻中的表達情況。在對miRNA 在水稻中鎘調(diào)控的研究中，Ding 等［34］發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫下，水稻中OsmiR192過表達抑制了種子萌發(fā)和幼苗生長。OsmiR390的表達水平在鎘脅迫下顯著下調(diào)。因此作為OsmiR390的靶基因，OsSRK在鎘脅迫下表達水平上升。與野生型水稻相比，過表達OsmiR390的轉(zhuǎn)基因水稻對鎘的耐受性降低，積累的鎘量增加。與此同時，OsSRK在過表達OsmiR390植物中的表達較野生型少。這些結果證明，OsmiR390是水稻抗鎘脅迫的負調(diào)控因子［35］。2017 年，Ding 等［36］又通過研究發(fā)現(xiàn)了Os?miR268在水稻鎘脅迫中的作用。在鎘脅迫下，水稻中OsmiR268的表達明顯受到影響。鎘處理下的植株中OsmiR268靶基因NRAMP3的表達顯著降低。OsmiR268的過表達則使水稻幼苗在鎘脅迫下的生長被抑制。過表達OsmiR268的植株葉片中過氧化氫和丙二醛含量增加，幼苗累積的鎘含量增加。這些結果表明，OsmiR268是水稻抗鎘的負調(diào)控因子。2018 年，Ding 等［37］通過研究發(fā)現(xiàn)OsmiR166在水稻鎘積累及抗性中的作用。OsmiR166靶向編碼Ⅲ類同源結構域-亮氨酸拉鏈（HD-Zip）家族蛋白的基因，過表達OsmiR166增強了水稻對鎘的抗性。在鎘處理條件下，編碼HD-Zip 蛋白的OsHB4基因出現(xiàn)上調(diào)，而在過表達OsmiR166的轉(zhuǎn)基因水稻植株中該基因則出現(xiàn)下調(diào)。過表達OsHB4使得轉(zhuǎn)基因水稻葉片和子粒對鎘的敏感性增強以及鎘積累增加。

3.4 miRNA 對水稻應對砷污染的調(diào)控

作為廣泛存在于自然界的環(huán)境類金屬，砷對生物有極高的毒性。在水稻中，已有數(shù)十種miRNA 被證實對砷脅迫具有響應性。Liu 等［38］發(fā)現(xiàn)，過表達OsmiR528（Ubi：：OsmiR528）的轉(zhuǎn)基因植株對砷的敏感度高于野生型（WT）水稻。在砷脅迫條件下，Os?miR528-5p和OsmiR528-3p的表達量在植物的根和葉中均顯著上調(diào)。與野生型植株相比，Ubi：：Os?miR528植株在砷暴露后產(chǎn)生過度的氧化應激反應和顯著的根、葉氨基酸含量變化。在砷脅迫的條件下，水稻中OsmiR172c會下調(diào)表達，從而引起AP2的上升表達，而AP2作為一個與花發(fā)育相關的基因，其上升表達會引起水稻從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變［39］。

3.5 miRNA 對水稻應對鹽脅迫的調(diào)控

植物會受到鹽的特異性影響，細胞內(nèi)Na+或Cl-濃度過高會導致毒性。面對鹽脅迫時，通過調(diào)控其靶基因，miRNA 可以介導水稻的鹽脅迫反應。

OsmiR319是植物中最早被鑒定和保存的mi?croRNA 家族之一，OsmiR319的表達受環(huán)境刺激的調(diào)控，提示其參與植物應激反應，Zhou 等［40］發(fā)現(xiàn)，過表達OsmiR319a的轉(zhuǎn)基因植株會表現(xiàn)出形態(tài)變化，同時表現(xiàn)出更強的耐鹽性?；虮磉_分析表明，在過表達OsmiR319a時，至少有 4 個OsmiR319靶基因，即AsPCF5、AsPCF6、AsPCF8 和AsTCP14，以及水稻NAC 域基因AsNAC60的同源基因下調(diào)。結果證明OsmiR319控制了植物對干旱和鹽堿脅迫的反應。水稻的非生物抗逆性增強與OsmiR319靶基因的顯著下調(diào)有關。Yang 等［41］通過研究發(fā)現(xiàn)，由 T-DNA插入引起的水稻dh 突變體OsmiR171c過表達顯著降低了水稻的耐鹽性。與野生型（WT）相比，dh 突變型降低游離脯氨酸含量，提高了鹽處理后的失水率，葉片表皮氣孔密度也增加。在鹽脅迫下，dh突變體的幾個應激反應基因較野生型明顯下調(diào)。這些結果表明，OsmiR171c有助于水稻耐鹽。除此之外，Xia等［28］發(fā)現(xiàn)，過表達OsmiR393的水稻植株耐鹽性降低。

作為2 種對鹽度有反應的基因，AsAAO和COP?PER ION BINDING PROTEIN1的 表 達 量 在Os?miR528過表達植株中顯著下調(diào)，OsmiR528過表達水稻提高了植物對鹽的耐受性。Yuan 等［42］試驗證明，OsmiR528在調(diào)節(jié)植物對鹽分響應方面發(fā)揮關鍵作用，并表明了操縱OsmiR528可以提高植物非生物抗逆性的潛力。

在OsmiR396對水稻鹽脅迫調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達OsmiR396c的水稻植株對鹽脅迫耐受性降低。在相同的處理條件下，過表達OsmiR396a/b的轉(zhuǎn)基因植株對鹽的耐受性呈上升趨勢，這暗示miR?NA 同一家族不同成員在脅迫抗性中可能發(fā)揮不同作用［43］。

4 miRNA 對水稻產(chǎn)量的影響

大量的研究結果證明，miRNA 對水稻產(chǎn)量具有十分重要的影響。在水稻中，由于miRNA 對靶基因有負調(diào)控作用，因此在水稻的調(diào)控網(wǎng)絡中占據(jù)十分重要的地位。

2010 年，Jiao 等［44］發(fā)現(xiàn)，IPA1 數(shù)量性狀位點編碼OsSPL14、OsSPL14在體內(nèi)則是由OsmiR156調(diào)控表達。OsmiR156能夠通過切割編碼OsSPL14的mRNA 負調(diào)控其表達。通過研究，他們發(fā)現(xiàn)在對Os?SPL14進行點突變后，干擾了OsmiR156對OsSPL14的調(diào)控，從而產(chǎn)生一個理想的水稻植株。該植株增加了水稻的抗倒伏性，提高了水稻產(chǎn)量。隨后Wang等［45］發(fā)現(xiàn)，OsmiR156不僅調(diào)控OsSPL14，同時會調(diào)控OsSPL16，過表達OsmiR156會抑制OsSPL16的表達，導致種子出現(xiàn)細長的表型，從而影響水稻子粒大小，并進一步影響產(chǎn)量。Si 等［46］發(fā)現(xiàn)OsmiR156也會調(diào)控OsSPL13，而OsSPL13是由一個主要的數(shù)量性狀位點GLW7 編碼，并且正向調(diào)節(jié)細胞大小，從而提高水稻的谷粒長度，并進一步增加水稻產(chǎn)量。在對OsmiR172的研究進程中，早在 2009 年，Zhu 等［47］就發(fā)現(xiàn)過量表達OsmiR172可以延緩水稻的小穗分生組織向小花分生組織轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)變會導致水稻花和種子發(fā)育缺陷，產(chǎn)生的這些缺陷會進一步導致水稻產(chǎn)量降低。2014 年，Lee 等［48］發(fā)現(xiàn)OsmiR172的過表達會顯著縮短開花時間，這意味著OsmiR172具有誘導作用。而研究進一步證明OsmiR172的水平隨著植物的衰老而增加。

除此之外，OsmiR396、OsmiR397及OsmiR398均會對水稻產(chǎn)量產(chǎn)生影響。2015 年，Che 等［49］、Duan等［50］、Gao 等［51］都證明OsmiR396調(diào)控 GRF 家族的不同成員從而影響水稻產(chǎn)量。OsmiR397是水稻內(nèi)源性miRNA，作為一個在幼穗和子粒中高表達的基因，當過表達OsmiR397時，水稻的子粒大小會增加，同時促進穗分枝，最終使水稻產(chǎn)量增加25%，這一結果是通過OsmiR397下調(diào)其靶點OsLAC所實現(xiàn)的等［52］。在對OsmiR398的研究中，Zhang 等［53］在 2017年通過試驗證明，抑制OsmiR398的表達會導致水稻高度明顯短于野生型，除此之外，穗長變短、種子數(shù)量減少，且開花時間與野生型相比短2 周時間。更重要的是，在粒長與粒寬的比較中，抑制OsmiR398表達的植株表現(xiàn)出明顯的減少，進一步導致千粒重降低，進而影響水稻產(chǎn)量。

在水稻分蘗數(shù)的研究中，肖之源等［54］發(fā)現(xiàn)在過表達OsmiR444.b.2 之后，水稻分蘗增加。利用STTM技術，35 個水稻miRNA 家族的表達水平被降低后，Zhang 等［53］發(fā)現(xiàn) miRNA 參與調(diào)控水稻分蘗數(shù)。封潔瓊等［55］發(fā)現(xiàn)，OsmiR156過表達會導致水稻植株出現(xiàn)矮化，并且分蘗增多。而吳美婷［56］研究表明，突變OsmiR390會導致水稻分蘗數(shù)增多，同時種子變長。韋懿等［57］則發(fā)現(xiàn)超量表達OsmiR167a后，植株表現(xiàn)分蘗數(shù)減少。

5 展望

作為最大的基因家族之一，在真核生物中，miRNA占整個基因組的1%左右。盡管近年來許多研究揭示了miRNA 在調(diào)控植物生長發(fā)育以及環(huán)境適應性方面發(fā)揮廣泛且關鍵的作用，但依舊有許多miRNA的作用機制尚不清晰［58］。通過綜合利用轉(zhuǎn)基因技術、生物信息學技術及高通量測序等技術，可以對miRNA 在水稻中的調(diào)控網(wǎng)絡中具體發(fā)揮的作用進行深層次的分析及驗證。隨著miRNA 的研究不斷深入，提高水稻產(chǎn)量及水稻抗逆性的調(diào)控網(wǎng)絡也會被進一步完善，并為水稻遺傳育種提供新的思路。