補(bǔ)腎益髓方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型miRNA-155信號(hào)通路相關(guān)因子的影響

高延芳，查政，薛冰，李君玲，齊放，金良韻，張楠，樊永平，王蕾

補(bǔ)腎益髓方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型miRNA-155信號(hào)通路相關(guān)因子的影響

高延芳1，查政1，薛冰2，李君玲1，齊放1，金良韻2，張楠1，樊永平3，王蕾1

1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100070

觀察補(bǔ)腎益髓方藥物血清對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2神經(jīng)炎癥的影響，探討其可能的作用機(jī)制。1 μg/mL脂多糖（LPS）誘導(dǎo)建立BV2細(xì)胞炎癥模型，將BV2細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、LPS組、補(bǔ)腎益髓方藥物血清（5%、10%、20%）組和空白血清（5%、10%、20%）組，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；在此基礎(chǔ)上，將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組，免疫熒光法和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶-1（Arginase-1）蛋白表達(dá)，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA-155-5p表達(dá)；采用慢病毒轉(zhuǎn)染制備miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)模型，另設(shè)20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組、陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組，免疫熒光法和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)iNOS、Arginase-1及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）蛋白表達(dá)。與正常組比較，LPS組細(xì)胞活力顯著降低（＜0.01），iNOS和miRNA-155-5p水平顯著升高（＜0.01），Arginase-1表達(dá)顯著降低（＜0.05）；與LPS組比較，20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組細(xì)胞活力顯著升高（＜0.01），iNOS和miRNA-155-5p水平顯著降低（＜0.01），Arginase-1表達(dá)顯著升高（＜0.01）。與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較，miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組iNOS表達(dá)顯著升高（＜0.01），Arginase-1和C/EBPβ表達(dá)顯著降低（＜0.01）。補(bǔ)腎益髓方可抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制與提高細(xì)胞活力、上調(diào)Arginase-1表達(dá)、下調(diào)iNOS表達(dá)、抑制miRNA-155信號(hào)通路有關(guān)。

補(bǔ)腎益髓方；神經(jīng)炎癥；BV2細(xì)胞；脂多糖；miRNA-155信號(hào)通路

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種自身免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）慢性炎癥退行性疾病，以炎癥、脫髓鞘和軸突損傷為主要病理特征，臨床表現(xiàn)為肢體無(wú)力、麻木疼痛，視力下降等。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS的固有免疫細(xì)胞，參與MS病變形成的各個(gè)階段，是炎癥的驅(qū)動(dòng)因素。在炎癥病理情況下，病灶周圍區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞被不斷激活，極化為促炎型M1和抑炎型M2。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子和趨化因子，損傷髓鞘；M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎因子和營(yíng)養(yǎng)因子，吞噬消除病原體，并修復(fù)髓鞘[1-4]。在MS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)上調(diào)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸酶-1（Arginase-1）表達(dá)下調(diào)，同時(shí)分泌大量促炎因子，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變[5-6]，后期出現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知功能障礙等[7]。另有研究表明，miRNA-155及其下游靶基因CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT/enhancer-binding protein β，C/EBPβ）可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化，參與炎癥反應(yīng)[8]。

補(bǔ)腎益髓方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院樊永平教授研發(fā)的治療MS方劑，以補(bǔ)腎填精、化痰活血為主，療效顯著[9]。課題組前期實(shí)驗(yàn)顯示，補(bǔ)腎益髓方可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，促進(jìn)髓鞘再生[10-11]，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2建立神經(jīng)炎癥模型，觀察補(bǔ)腎益髓方是否通過(guò)miRNA-155信號(hào)通路介導(dǎo)BV2細(xì)胞向M2型極化，為明確補(bǔ)腎益髓方治療MS的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（280±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（京）2018-0003。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（AEEI-2018-137）。小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2，北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及制備

補(bǔ)腎益髓方（生地黃12 g，熟地黃12 g，制何首烏9 g，水蛭6 g，連翹9 g，全蝎6 g，浙貝母12 g，天麻9 g，益母草12 g，酒大黃6 g），飲片粉末購(gòu)自北京亞?wèn)|生物制藥有限公司，使用前用蒸餾水溶解，配制成原藥材濃度為1.46 g/mL藥液。LPS，貨號(hào)PB10443，美國(guó)Sigma公司，配制成濃度為1 mg/mL貯備液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，分裝后于-20 ℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)基稀釋，終濃度為1 μg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)10-013-CV）、青鏈霉素（貨號(hào)15140-122）、胎牛血清（貨號(hào)35-076-CV），美國(guó)Corning公司；小鼠抗iNOS一抗（貨號(hào)ab210823）、兔抗Arginase-1一抗（貨號(hào)ab91279）、兔抗C/EBPβ一抗（貨號(hào)ab32358），英國(guó)Abcam公司；小鼠抗β-tubulin一抗（貨號(hào)YM3030），美國(guó)Immunoway公司；慢病毒，上海漢恒生物科技有限公司。ESCD AC2-4S1超凈生物安全柜（美國(guó)Thermo公司），371型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），Primo Vert倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司），Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司），小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司），PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源（美國(guó)Bio-Rad公司），F(xiàn)usion FX6-XT化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（法國(guó)Vilber公司），SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司），CFX Connect熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 補(bǔ)腎益髓方藥物血清制備

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白血清組和補(bǔ)腎益髓方藥物血清組，每組15只。補(bǔ)腎益髓方藥物血清組大鼠參照文獻(xiàn)[12]予補(bǔ)腎益髓方藥液（11.7 g/kg）灌胃，空白血清組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)7 d，每日2次，間隔12 h。末次給藥前禁食12 h，末次給藥后2 h麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置4 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，合并同組血清，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 體外炎癥模型建立

取生長(zhǎng)良好的BV2細(xì)胞，加入1 μg/mL LPS誘導(dǎo)24 h，建立體外炎癥模型。

2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組，LPS組，5%、10%、20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組，5%、10%、20%空白血清組，每組5個(gè)復(fù)孔。24 h后各組棄去培養(yǎng)液，正常組加入新鮮培養(yǎng)液，其余各組加入LPS干預(yù)24 h。24 h后棄去培養(yǎng)液，正常組和LPS組加入新鮮培養(yǎng)液，各濃度血清組加入相應(yīng)濃度血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝實(shí)驗(yàn)組OD值÷正常組OD值×100%。

2.4 免疫熒光檢測(cè)BV2細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于24孔板，每孔500 μL，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組，每組3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下方法造模，24 h后棄去培養(yǎng)液，正常組和LPS組加入新鮮培養(yǎng)液，20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組加入相應(yīng)濃度血清培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，0.5%Triton X-100通透20 min，5%BSA封閉30 min。加入小鼠抗iNOS一抗（1∶200）和兔抗Arginase-1一抗（1∶200），4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。次日滴加相應(yīng)二抗（1∶200），室溫孵育2 h，滴加熒光染料DAPI，避光孵育5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，每孔選取3個(gè)視野拍照。應(yīng)用Image J 18.0軟件對(duì)圖片進(jìn)行半定量分析，測(cè)量平均熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 Western blot檢測(cè)BV2細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組，每組3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下方法造模，按“2.4”項(xiàng)下方法給藥。將6孔板置于冰上，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入60 μL蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液（1∶100）混合溶液，置于搖床上裂解30 min，將各組液體分別收集至EP管內(nèi)，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液至新EP管內(nèi)，BCA檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取各組蛋白樣品（20 μg）進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉，常溫?fù)u床封閉1 h。分別加入iNOS一抗（1∶500）、Arginase-1一抗（1∶500），4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。次日TBST清洗3次，每次5 min，滴加相應(yīng)二抗（1∶20 000），常溫?fù)u床孵育30 min，TBST清洗3次，每次5 min。將ECL發(fā)光試劑A液與B液等體積混勻后滴在PVDF膜上，并于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像。采用Image J 18.0軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-tubulin）條帶灰度值的比值表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)BV2細(xì)胞miRNA-155-5p表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為正常組、LPS組和20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組，每組3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下方法造模，并按“2.4”項(xiàng)下方法給藥。培養(yǎng)48 h后，PBS清洗3次，每次5 min，按細(xì)胞總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。Bestar?one step RT qPCR kit（SyBR Green）試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)定各組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p表達(dá)情況。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量。miRNA-155-5p和U6 snRNA（U6）引物由北京賽維爾生物公司合成，miRNA-155-5p引物設(shè)計(jì)采用莖環(huán)法，需要3種引物：反轉(zhuǎn)錄引物用于延長(zhǎng)miRNA-155-5p、RT-qPCR上游引物、RT-qPCR下游引物。U6作為miRNA-155-5p的內(nèi)源性對(duì)照。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長(zhǎng) 度/bp miRNA-155-5p 反轉(zhuǎn)錄：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TCAGTTGAGACCCCTAT F：ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT67 R：TGGTGTCGTGGAGTCG U6F：CTCGCTTCGGCAGCACA94 R：AACGCTTCACGAATTTGCGT

2.7 陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于24孔板，每孔500 μL，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。慢病毒轉(zhuǎn)染按漢恒生物操作手冊(cè)執(zhí)行。在冰上慢慢融化，吸去舊培養(yǎng)液，加入1/2體積新鮮培養(yǎng)液，根據(jù)摸索的感染復(fù)數(shù)（MOI）值，加入適量體積慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加入體積（μL）＝MOI×細(xì)胞數(shù)/病毒滴度（TU/mL）×1 000。根據(jù)漢恒生物測(cè)定的病毒滴度（108TU/mL）及前期摸索的MOI值（60）計(jì)算得出24孔板每孔加入病毒15 μL，慢病毒轉(zhuǎn)染4 h后補(bǔ)足至培養(yǎng)體積。轉(zhuǎn)染24 h后棄去含有慢病毒的培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后可通過(guò)熒光顯微鏡初步觀察帶有綠色熒光蛋白的BV2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后觀察到帶有綠色熒光蛋白的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的80%～90%，表明陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組制備成功。

2.8 免疫熒光檢測(cè)miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)BV2細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、精氨酸酶-1和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β表達(dá)

取正常BV2細(xì)胞及慢病毒轉(zhuǎn)染后的BV2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于24孔板，每孔500 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組、陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組，每組3個(gè)復(fù)孔。24 h后棄去培養(yǎng)液，各組加入LPS干預(yù)24 h，棄去含LPS的培養(yǎng)液，各組加入含20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。按“2.4”項(xiàng)下免疫熒光操作步驟，并在操作中補(bǔ)充兔抗C/EBPβ抗體（1∶200），檢測(cè)iNOS、Arginase-1、C/EBPβ蛋白表達(dá)。

2.9 Western blot檢測(cè)BV2細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、精氨酸酶-1和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常BV2細(xì)胞及慢病毒轉(zhuǎn)染后的BV2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組、陰性對(duì)照組和miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組，每組3個(gè)復(fù)孔。按“2.8”項(xiàng)下方法造模并給藥，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，并在操作中補(bǔ)充兔抗C/EBPβ抗體（1∶500），檢測(cè)iNOS、Arginase-1、C/EBPβ蛋白表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 補(bǔ)腎益髓方藥物血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，LPS組BV2細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；5%、10%、20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療48 h后，細(xì)胞活力顯著升高，與對(duì)應(yīng)空白血清組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），其中20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組效果最明顯，與5%、10%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見圖1。故選擇20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：與正常組比較，**P＜0.01；與同濃度空白血清組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與5%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較，▲▲P＜0.01；與10%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較，△△P＜0.01

4.2 補(bǔ)腎益髓方藥物血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1表達(dá)的影響

免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，LPS組BV2細(xì)胞iNOS表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.01），Arginase-1表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.05）；與LPS組比較，20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組BV2細(xì)胞iNOS表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01），Arginase-1表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.01）。見圖2、表2、圖3、表3。

圖2 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

表2 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1表達(dá)比較（±s，平均熒光強(qiáng)度）

注：與正常組比較，*＜0.05，**＜0.01；與LPS組比較，★★＜0.01

注：A.正常組；B. LPS組；C. 20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組

表3 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1蛋白表達(dá)比較（±s，相對(duì)表達(dá)量）

注：與正常組比較，*＜0.05，**＜0.01；與LPS組比較，★★＜0.01

4.3 補(bǔ)腎益髓方藥物血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平的影響

與正常組比較，LPS組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平顯著升高（＜0.01）；與LPS組比較，20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平顯著降低（＜0.01）。見表4。

表4 各組BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平比較（±s）

注：與正常組比較，**＜0.01；與LPS組比較，★★＜0.01

4.4 補(bǔ)腎益髓方藥物血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)BV2細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、精氨酸酶-1和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β表達(dá)的影響

免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較，miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組BV2細(xì)胞iNOS表達(dá)顯著升高（＜0.01），C/EBPβ、Arginase-1表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01）。見圖4、表5、圖5、表6。

圖4 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1、C/EBPβ陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

表5 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1、C/EBPβ表達(dá)比較（±s，平均熒光強(qiáng)度）

注：與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較，☆☆＜0.01

注：A. 20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組；B.陰性對(duì)照組；C. miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)組

表6 各組BV2細(xì)胞iNOS、Arginase-1、C/EBPβ蛋白表達(dá)比較（±s，相對(duì)表達(dá)量）

注：與20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清組比較，☆＜0.05，☆☆＜0.01

5 討論

大多數(shù)MS患者出現(xiàn)肢體筋脈弛緩、軟弱無(wú)力，不能隨意運(yùn)動(dòng)，或伴有肌肉萎縮，甚至癱瘓。根據(jù)臨床表現(xiàn)，MS可歸屬中醫(yī)學(xué)“痿證”范疇。目前臨床對(duì)MS急性期常采用糖皮質(zhì)激素治療，緩解期則使用疾病修正治療，但西醫(yī)治療方案對(duì)神經(jīng)再生治療效果欠理想[13-14]。近年來(lái)，中醫(yī)治療MS取得一定療效。MS病位在腦髓，腎主骨生髓，腎氣不足，髓海失養(yǎng)，筋骨失約，致機(jī)體不能隨意運(yùn)動(dòng)，最終導(dǎo)致痿證[15-16]。補(bǔ)腎益髓方由生地黃、熟地黃、酒大黃、益母草、浙貝母、水蛭、全蝎、天麻、連翹組成，其中生地黃和熟地黃補(bǔ)腎填精，充養(yǎng)腦髓，配伍浙貝母、益母草、水蛭、全蝎等化痰活血通絡(luò)，以利于腦髓的充養(yǎng)[9，17]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益髓方能抑制EAE小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)志物iNOS表達(dá)，提高M(jìn)2型標(biāo)志物Arginase-1表達(dá)[18]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，BV2細(xì)胞M1型細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β分泌增加，M2型細(xì)胞因子如IL-10分泌減少[19]。本實(shí)驗(yàn)選用1 μg/mL LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞24 h建立體外神經(jīng)炎癥模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS刺激后，BV2細(xì)胞活力明顯下降，且iNOS表達(dá)顯著上調(diào)，Arginase-1表達(dá)顯著下調(diào)，提示炎癥模型建立成功。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20]，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立了5%、10%、20%濃度的補(bǔ)腎益髓方藥物血清，利用CCK-8法篩選最佳血清濃度。結(jié)果表明，20%補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療48 h后，BV2細(xì)胞活力明顯升高，Arginase-1蛋白表達(dá)上調(diào)，iNOS蛋白表達(dá)下調(diào)，提示補(bǔ)腎益髓方含藥血清可促進(jìn)BV2細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，與前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[18]。

miRNAs作為非編碼小分子RNA，在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起著重要作用。一些miRNAs已成為炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的基因表達(dá)調(diào)控因子。miRNA-155是一種特異性miRNA，參與神經(jīng)退行性疾病炎癥反應(yīng)[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞向M1型極化，同時(shí)檢測(cè)到miRNA-155水平上調(diào)[23]，miRNA-155過(guò)表達(dá)可使BV2細(xì)胞吞噬活性降低，無(wú)法吞噬殘存的髓鞘碎片[24]，而miRNA-155敲減可促進(jìn)M2型細(xì)胞因子分泌，抑制M1型細(xì)胞因子分泌[25]。深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化調(diào)節(jié)EAE小鼠病程[26-27]。C/EBPβ是miRNA-155的下游靶基因，miRNA-155通過(guò)靶向C/EBPβ參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，miRNA-155過(guò)表達(dá)可抑制C/EBPβ活性及巨噬細(xì)胞向M2型極化[28]，而miRNA-155敲減可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化及C/EBPβ表達(dá)[29]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后，BV2細(xì)胞miRNA-155-5p水平顯著上調(diào)，提示炎癥與miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)有關(guān)，而經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療后，miRNA-155-5p水平明顯降低，說(shuō)明補(bǔ)腎益髓方減輕炎癥反應(yīng)與抑制miRNA-155-5p表達(dá)密切相關(guān)。進(jìn)一步采用慢病毒轉(zhuǎn)染制備miRNA-155-5p過(guò)表達(dá)模型，再經(jīng)補(bǔ)腎益髓方藥物血清治療48 h后抗炎作用不明顯，說(shuō)明補(bǔ)腎益髓方是通過(guò)miRNA-155介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，補(bǔ)腎益髓方對(duì)神經(jīng)炎癥有明顯抑制作用，其作用機(jī)制可能為抑制miRNA-155和調(diào)控其下游基因C/EBPβ表達(dá)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化。本研究可為明確補(bǔ)腎益髓方治療MS的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects ofPrescription for miRNA-155 Signaling Pathway Related Factors on Lipopolysaccharide-Induced Neuroinflammation in BV2 Cells

GAO Yanfang1, ZHA Zheng1, XUE Bing2, LI Junling1, QI Fang1, JIN Liangyun2,ZHANG Nan1, FAN Yongping3, WANG Lei1

To observe the effects ofPrescription-containing drug serum on the inflammation of BV2 microglial cells; To explore its possible mechanism against neuroinflammation.1 μg/mL LPS was used to induced BV2 cell inflammation model. The BV2 microglial cells were randomly divided into normal group, LPS group,Prescription-containing drug serum (5%, 10%, 20%) group and blank serum (5%, 10%, 20%) group, the cell viability was detected by CCK-8 assay. On the basis of experiments, the cells were divided into normal group, LPS group and 20%Prescription-containing drug serum group. The expressions of iNOS and Arginase-1 in cells were detected by immunofluorescence and Western blot, and the expression level of miRNA-155-5p in cells was measured by RT-qPCR. The miRNA-155-5p overexpression model were prepared by lentiviral transfection, the cells were divided into 20%Prescription-containing serum group, negative control group and miRNA-155-5p overexpression group, the expressions of iNOS, Arginase-1 and C/EBPβ in cells were detected by immunofluorescence and Western blot.Compared with the normal group, the cell viability of the LPS group was significantly reduced (<0.01), the levels of iNOS and miRNA-155-5p significantly increased, and the expression of Arginase-1 was significantly reduced (<0.05). Compared with the LPS group, the cell viability of the 20%Prescription-containing drug serum group significantly increased (<0.01), the levels of iNOS and miRNA-155-5p were significantly reduced (<0.01), and the expression of Arginase-1 significantly increased (<0.01). Compared with the 20%Prescription-containing drug serum group, the expression of iNOS in the miRNA-155-5p overexpression group was significantly increased (<0.01), and the expression of Arginase-1 and C/EBPβ was significantly decreased (<0.01).Prescription can inhibit LPS-induced inflammatory reaction in BV2 cells, and its mechanism of action is related to improving cell viability, up-regulating the expression of Arginase-1, down-regulating the expression of iNOS, and inhibiting the miRNA-155 signaling pathway.

Prescription; neuroinflammatory; BV2 microglial cells; lipopolysaccharide; miRNA-155 signaling pathway

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0061-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202105378

國(guó)家自然科學(xué)基金（81873252）

王蕾，E-mail：tmwangl@ccmu.edu.cn

（2021-05-23）

（修回日期：2021-06-16；編輯：鄭宏）