大血藤總酚酸調(diào)控微小RNA-155對缺氧復(fù)氧心肌細胞的細胞活性凋亡及氧化應(yīng)激的影響

于夢，宋欣麗，孫麗，梁芳，魯衛(wèi)星

研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方及中藥有效提取物，能有效地抑制氧自由基的形成，控制炎癥反應(yīng)，從而達到保護損傷心肌的目的，在治療心肌缺血再灌注損傷中具有廣闊的應(yīng)用前景。大血藤是我國特有植物，又名紅藤、血藤，主要化學(xué)成分有酚酸類；藥理作用有鎮(zhèn)痛，消炎，抗腫瘤、抗氧化等。研究表明大血藤總酚酸可通過保護腦組織免受炎癥因子損傷，減少神經(jīng)細胞凋亡等減少腦缺血再灌注損傷，起到對腦組織的保護作用。大血藤總酚酸還通過抗氧化與改善腦組織能量代謝保護大鼠腦缺血再灌注損傷。且有研究發(fā)現(xiàn)大血藤多米糖具有抗心肌缺血的作用。然而大血藤總酚酸是否對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用及其機制尚不清楚。研究報道病毒性心肌炎患兒外周血中高表達的miR-155 能夠抑制Treg 免疫并加重心肌損傷。缺氧/復(fù)氧大鼠H9C2 心肌細胞中miR-155 高表達，下調(diào)miR-155 可促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，減輕心肌缺氧/復(fù)氧損傷。抑制miR-155 可通過有針對性地調(diào)節(jié)大鼠HIF-1α 來預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷。表明抑制miR-155 具有保護心肌缺血/再灌注損傷的作用，因此，本實驗旨在研究大血藤總酚酸是否對心肌缺血再灌注損傷的影響及其機制是否與miR-155有關(guān)，研究起止時間為2019年12月至2020年8月。

1 材料與方法

1.1 材料

心肌細胞H9C2（貨號6200，上海中喬新舟生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（貨號A19008，上海傳秋生物科技有限公司）；實時熒光定量PCR 試劑盒（貨號Qiagen204143，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司）；噻唑藍（MTT）試劑盒（貨號8028，上海美軒生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒（貨號K201-25，上海齊一生物科技有限公司）；RIPA 蛋白裂解液（貨號N653，上海恒渡生物科技有限公司）；肌酸激酶試劑盒（貨號1534651026）、LDH試劑盒（貨號1531916014）、丙二醛試劑盒（貨號1534619774）（上海江萊生物科技有限公司）。大血藤總酚酸由河南中醫(yī)學(xué)院化學(xué)室提供。

1.2 缺氧復(fù)氧模型的建立

取對數(shù)生長期心肌細胞H9C2 接種于24 孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于含95% 氮氣和5% 二氧化碳混合氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后換成正常培養(yǎng)基在含95% 氮氣和5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.3 實驗分組

將心肌細胞H9C2使用隨機數(shù)字表法隨機分為以下幾組：對照組：用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組：缺氧4 h，復(fù)氧12 h，具體方法參考“1.2”；大血藤總酚酸低、中、高濃度組：造模前分別用12.5、25.0、50.0 mg/L 大血藤總酚酸培養(yǎng)2 h，然后進行缺氧復(fù)氧處理；大血藤總酚酸-H+NC 組：將miR-155 模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染至H9C2 中再用50.0 mg/L 大血藤總酚酸培養(yǎng)，最后進行缺氧復(fù)氧處理；大血藤總酚酸-H+miR-155 mimic 組：將miR-155 模擬物轉(zhuǎn)染至H9C2中再用50.0 mg/L 大血藤總酚酸培養(yǎng)，最后進行缺氧復(fù)氧處理。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-155表達水平

提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA），按試劑盒說明進行PCR，相對表達量采用2法計算。miR-155 正向引物序列：5'-CTCTAATGGTGGCACAAA-3'，反向引物序列：5'-TGATAAAAACAAACATGGGCTTGAC-3'；U6 正向引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-AAAATATGGAACGCTTCACGA-3'。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖

各組細胞培養(yǎng)48 h 后每孔加20 μL 的MTT 溶液，培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液，加150 μL二甲基亞砜（DMSO），充分振蕩反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

各組細胞培養(yǎng)48 h 后用胰酶消化細胞，制成細胞懸液，洗滌細胞后分別加Annexin V-FITC 和PI各5 μL 混勻，常溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白，定量后取適量蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，加入稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫搖床孵育2 h，化學(xué)發(fā)光試劑ECL 顯色，暗室下顯影、定影。Quantity-One分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.8 試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量

各組細胞培養(yǎng)48 h 后，取心肌細胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒方法操作，用分光光度法檢測。

2 結(jié)果

2.1 大血藤總酚酸對缺氧復(fù)氧心肌細胞的細胞活性及miR-155 表達的影響

與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細胞中miR-155 表達水平升高，細胞吸光度降低（

P

＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧組相比，大血藤總酚酸中、高濃度組miR-155表達水平降低，細胞吸光度升高，且呈濃度依賴性（

P

＜0.05），而大血藤總酚酸低濃度組miR-155 表達水平和細胞吸光度無明顯變化。見表1。

表1 大血藤總酚酸對細胞活性和miR-155表達的影響/±s

2.2 大血藤總酚酸對缺氧復(fù)氧心肌細胞凋亡的影響

與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細胞凋亡率升高，活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）表達水平升高，胱天蛋白酶-3 前體（pro-caspase-3）表達水平降低（

P

＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧組相比，大血藤總酚酸中、高濃度組心肌細胞凋亡率降低，cleaved-caspase-3 表達水平降低，pro-caspase-3 表達水平升高，且呈濃度依賴性（

P

＜0.05），而大血藤總酚酸低濃度組細胞凋亡率和相關(guān)蛋白表達水平無明顯變化。見圖1、表2。

圖1 大血藤總酚酸對凋亡蛋白表達的影響

表2 大血藤總酚酸對凋亡率和凋亡蛋白表達的影響/±s

2.3 大血藤總酚酸對缺氧復(fù)氧心肌細胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影響

與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量升高（

P

＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧組相比，大血藤總酚酸中、高濃度組心肌細胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量降低，且呈濃度依賴性（

P

＜0.05），而大血藤總酚酸低濃度組肌酸激酶、LDH、丙二醛含量無明顯變化。見表3。

表3 大血藤總酚酸對肌酸激酶、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛含量的影響/±s

2.4 過表達miR-155 對大血藤總酚酸處理的缺氧復(fù)氧心肌細胞的細胞活性及凋亡的影響

與大血藤總酚酸-H+NC 組相比，大血藤總酚酸-H+miR-155 mimic 組細胞吸光度降低，心肌細胞凋亡率升高，cleaved-caspase-3 表達水平升高，pro-caspase-3 表達水平降低（

P

＜0.05）。見圖2、表4。

表4 過表達miR-155可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對細胞活性和凋亡的影響/±s

圖2 過表達miR-155可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對凋亡蛋白表達的影響

2.5 過表達miR-155 對大血藤總酚酸處理的缺氧復(fù)氧心肌細胞肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影響

與大血藤總酚酸-H+NC組相比，大血藤總酚酸-H+miR-155 mimic 組肌酸激酶、LDH、丙二醛含量升高（

P

＜0.05）。見表5。

表5 過表達miR-155可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對肌酸激酶、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛含量的影響/±s

3 討論

心肌缺血再灌注損傷機制復(fù)雜，心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥因子等均與其相關(guān)。因此，探索如何減少心肌缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時細胞內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，發(fā)生過氧化反應(yīng)；丙二醛是細胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，大量丙二醛可破壞細胞膜完整性，使細胞內(nèi)的乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶漏出細胞外；因此檢測肌酸激酶、LDH、丙二醛的含量可間接反應(yīng)細胞膜損傷程度。

研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥預(yù)處理對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護作用。研究報道大血藤不同極性部位對氧化應(yīng)激損傷成骨細胞具有保護作用。且有研究報道雞血藤提取物可通過影響心肌組織中LDH、肌酸激酶、超氧化物歧化酶（SOD）的活性從而對豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷起保護作用。本實驗用缺氧復(fù)氧處理心肌細胞模擬心肌缺血再灌注，不同濃度的大血藤總酚酸處理后，結(jié)果顯示，中、高濃度處理組細胞吸光度升高，心肌細胞凋亡率降低，cleaved-caspase-3 表達水平降低，pro-caspase-3 表達水平升高，心肌細胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量降低；表明中、高濃度的大血藤總酚酸可抑制心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，對缺氧復(fù)氧心肌細胞損傷有保護作用。

研究報道m(xù)iR-155 可參與調(diào)控心肌細胞凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)，如miR-155 的下調(diào)保護心肌細胞免于凋亡。 銀耳銀耳多糖可通過抑制miR-155 減輕巨噬細胞的氧化應(yīng)激和炎癥。本實驗結(jié)果顯示，大血藤總酚酸中、高濃度處理后缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中miR-155 表達水平降低；而過表達miR-155 可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞活性、凋亡和肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影響。提示，大血藤總酚酸可能通過調(diào)控miR-155影響缺氧復(fù)氧心肌細胞損傷。

綜上所述，大血藤總酚酸可能通過下調(diào)miR-155抑制缺氧復(fù)氧心肌細胞的凋亡及氧化應(yīng)激。