《整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠》標(biāo)準(zhǔn)中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法研究

于浩　姜愛莉　李敏　付步芳　王召旭

[摘要]目的：建立整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0962-2014《整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠》的修訂提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用酸解法處理樣品，考察了酸的種類、酸解時(shí)間等影響因素，用0.5mol/L硫酸溶液且在（95±5）℃恒溫干燥箱45min中將樣品完全溶解，利用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合顯色的原理，以牛血清白蛋白為對(duì)照品，采用分光光度法在波長(zhǎng)595nm處測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量，且委托第三方三所實(shí)驗(yàn)室對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行雙因子方差分析。結(jié)果：該方法專屬性較高，蛋白濃度在2～10μg/ml，回歸方程y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），校正曲線的線性關(guān)系良好，樣品測(cè)定重復(fù)性RSD均值為3.19%，回收率結(jié)果98.70%，檢出限為0.96μg/ml，四所實(shí)驗(yàn)室對(duì)同批次樣品進(jìn)行測(cè)定，采用雙因子方差分析，得到P值為0.253>0.05，認(rèn)為不同實(shí)驗(yàn)室采用同一方法對(duì)同批次樣品的蛋白測(cè)定結(jié)果不存在顯著性差異。結(jié)論：該方法是一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確測(cè)定整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品中蛋白含量的檢測(cè)方法。

[關(guān)鍵詞]交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠;考馬斯亮藍(lán)法;蛋白質(zhì)含量;注射整形;質(zhì)量控制

[中圖分類號(hào)]R318? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）10-0006-04

Study on the Detection Method of Protein Content in the Standard of Cross-linked Sodium Hyaluronate Gel for Plastic Surgery

YU Hao1，2，JIANG Ai-li1，LI Min1，2，F(xiàn)U Bu-fang2，WANG Zhao-xu2

（1.Yantai University，Yantai 264000，Shandong，China;2.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 102629，China）

Abstract： Objective? To establish a standard detection method for protein content in cross-linked sodium hyaluronate gel products for plastic surgery， and to provide experimental basis for the revision of industry standard YY/T 0962-2014 Cross-linked sodium hyaluronate gel for plastic surgery. Methods? The sample was treated by acid hydrolysis method， and the influencing factors such as the type of acid and acid hydrolysis time were investigated. The sample was completely dissolved in a 0.5mol/L sulfuric acid solution and （95±5）℃ constant temperature oven for 45min. The principle of blue G-250 combined with protein for color development， used bovine serum albumin as a control， used spectrophotometry to determine the protein content in the sample at a wavelength of 595nm， and entrusted three laboratories to the method perform verification and perform two-way ANOVA on the data results. Results? The method has high specificity， protein concentration in the range of 2-10μg/ml， regression equation y=0.0125x-0.0033（r=0.9997）， the linear relationship of the calibration curve is good， and the average RSD of the sample measurement repeatability was 3.19%， the recovery rate was 98.70%， and the detection limit was 0.96μg/ml. The four laboratories measured the same batch of samples and used a two-factor analysis of variance to obtain P= 0.253>0.05. It was considered that there was no significant difference in the protein determination results of the same batch of samples by the same method in different laboratories. Conclusion? This method is a simple， rapid and accurate method for determining the protein content of cross-linked sodium hyaluronate gel products for plastic surgery.

Key words： cross-linked sodium hyaluronate gel; coomassie brilliant blue method; protein content; injection plastic; quality control

透明質(zhì)酸（Hyaluronan，Hyaluronic acid，HA）是一種廣泛分布在軟結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)中的線狀聚陰離子酸性黏多糖，具有維持皮膚穩(wěn)定以及保持皮膚彈性的功能[1]。1995年，HA類皮膚填充劑通過歐盟批準(zhǔn)首次進(jìn)入歐洲市場(chǎng)，2003年，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）正式批準(zhǔn)用于整形美容行業(yè)，一般用于修復(fù)皮膚褶皺，通過外部充填而達(dá)到理想的美容效果[2]。通常選擇交聯(lián)技術(shù)，使產(chǎn)品具有更強(qiáng)的抗酶解性能和良好的流變學(xué)性能等，以達(dá)到理想的使用周期[3]。該類產(chǎn)品具有生物相容性較好、安全性較高以及應(yīng)用多樣化等優(yōu)勢(shì)，受到整形美容行業(yè)青睞[4]。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站中可查詢到進(jìn)口的注射用交聯(lián)/修飾透明質(zhì)酸鈉凝膠的注冊(cè)證共23個(gè)。

現(xiàn)行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0962-2014《整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠》于2014年發(fā)布，2015年開始實(shí)施。隨著技術(shù)的發(fā)展，目前該標(biāo)準(zhǔn)的部分內(nèi)容和指標(biāo)已經(jīng)不能適應(yīng)行業(yè)的進(jìn)步與發(fā)展。例如，HA中蛋白質(zhì)含量是必須嚴(yán)格控制的，蛋白質(zhì)含量高于1%時(shí)，機(jī)體易產(chǎn)生抗原反應(yīng)，往往會(huì)出現(xiàn)過敏現(xiàn)象[5]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)HA原料中的蛋白含量有所要求（不得高于0.1%），未對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中的蛋白含量進(jìn)行控制。在由HA到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的生產(chǎn)過程中，還需要堿化、透析等多步工藝，過程繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，有可能接觸新的蛋白質(zhì)污染源，從而使產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量發(fā)生改變，因此不能簡(jiǎn)單的用原料中的蛋白質(zhì)含量來推算產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量。筆者建立了交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，采用酸解工藝對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行處理，并探索出合適的酸解條件，如所用酸的種類，酸解時(shí)間等，然后采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1? 資料和方法

1.1 儀器和試劑：數(shù)控超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司，型號(hào)：VGT-2120QTD，頻率：40kHz）;電子分析天平（深圳市盛美儀器有限公司，型號(hào)：XSE205DU）;紫外-可見分光光度計(jì)（日本日立公司，型號(hào)：日立U-3310）。

交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品（樣品1批號(hào)：H181217A11C;樣品2批號(hào)：36923128;樣品3批號(hào)：20190102;樣品4批號(hào)：H190123B11A;樣品5批號(hào)：H181219A11A）;磷酸（≥85%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20181019，分析純）;95%乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170103，分析純）;鹽酸（36%～38%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20181009，分析純）;硫酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150429，分析純）;考馬斯亮藍(lán)G250（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160114，分析純）;牛血清白蛋白（≥98%，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：B76636，分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：考馬斯亮藍(lán)法和福林酚法是兩種常見的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，考察了這兩種方法對(duì)本產(chǎn)品的適用性。

1.2.1 考馬斯亮藍(lán)法：在酸性環(huán)境中，考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（尤其是精氨酸和賴氨酸）以及芳香族氨基酸的殘基通過疏水力相結(jié)合，最大吸收峰由465nm變?yōu)?95nm[6]。蛋白質(zhì)濃度1～1 000μg/ml，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在595nm的吸光度與蛋白含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，原理如圖1。

1.2.1.1 溶液的配制：考馬斯亮藍(lán)染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg，加95%乙醇50ml，待考馬斯亮藍(lán)溶解后（可使用超聲），再加85%磷酸100ml，純化水定容至1 000ml，混勻，濾過，取濾液即得。本染色液應(yīng)置棕色瓶?jī)?nèi)，宜配制24h后使用。如有沉淀生成，使用前需經(jīng)濾過。

對(duì)照品溶液：稱取0.010g牛血清白蛋白于100ml容量瓶，稀釋10倍至濃度約10μg/ml。

0.5mol/L硫酸：加入適量純化水于1L容量瓶中，取硫酸27.2ml于容量瓶中，繼續(xù)加純化水定容混勻。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度溶液：準(zhǔn)備6只潔凈棕色具塞比色管，取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml于具塞比色管中，分別加1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml純化水，混勻得到系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.1.3 實(shí)驗(yàn)最佳條件的選擇：稱取交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠2.000g，置20ml頂空瓶中，加0.5mol/L硫酸溶液3.0ml，壓緊瓶蓋，置（95±5）℃恒溫干燥箱45min，使之完全溶解。冷卻至室溫后，將頂空瓶中溶液轉(zhuǎn)移至10ml棕色容量瓶，用3.0ml 1mol/L氫氧化鈉溶液潤(rùn)洗頂空瓶，將潤(rùn)洗液轉(zhuǎn)移至容量瓶，純化水定容至10.0ml，從中吸出1.0ml置棕色試管中，在標(biāo)準(zhǔn)液系列各試管和樣品試管中分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑5.0ml，小心渦旋混勻，室溫下反應(yīng)5min，以空白溶液作參比，595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

酸解時(shí)間：為考察酸解時(shí)間對(duì)樣品酸解效果的影響，分別設(shè)置30min、45min和60min的酸解時(shí)間點(diǎn)，其他操作按照1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

酸性環(huán)境：考馬斯亮藍(lán)G-250染料在試劑配制過程中需加入磷酸溶液，起到調(diào)節(jié)pH的作用，使考馬斯亮藍(lán)溶液呈酸性。后期測(cè)定之前可加入50μl磷酸以調(diào)節(jié)酸性環(huán)境，對(duì)是否補(bǔ)加磷酸做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，考察磷酸的影響，其他操作按照1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

酸的選擇：交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠酸解通常采用硫酸或鹽酸，分別考察了兩種酸的適用性，為驗(yàn)證蛋白質(zhì)在1mol/L鹽酸溶液和0.5mol/L硫酸溶液中95℃條件下是否被破壞，分別加入高中低三個(gè)濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行回收率試驗(yàn)的測(cè)定，其他操作按照1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.2.1.4 線性關(guān)系考察：以牛血清白蛋白對(duì)照品溶液的濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，在蛋白濃度2～10μg/ml范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

考馬斯亮藍(lán)法按如下公式計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中蛋白質(zhì)的含量：

E=（a×V）/m

1.2.1.5 精密度：取樣品1適量，按照1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法，連續(xù)進(jìn)行6次分析，記錄吸光度值，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation， RSD）。

1.2.1.6 穩(wěn)定性：取樣品2適量，按照1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法，每隔5min進(jìn)行一次檢測(cè)，30min內(nèi)進(jìn)行7次分析，記錄吸光度值，并計(jì)算RSD。

1.2.1.7 重復(fù)性：平行取樣品2、樣品3和樣品4適量，各6份，按照1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄吸光度值，計(jì)算含量及RSD。

1.2.1.8 加標(biāo)回收率：分別稱取3份2.000g樣品5置20ml頂空瓶中，加0.5mol/L硫酸溶液3.0ml，不加振蕩，分別加入40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0ml后，壓緊瓶蓋，置（95±5）℃恒溫干燥箱中45min，使之完全溶解。冷卻至室溫后，將頂空瓶中溶液轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶，用3.0ml 1mol/L氫氧化鈉溶液潤(rùn)洗頂空瓶，將潤(rùn)洗液轉(zhuǎn)移至容量瓶，最后純化水定容。平行制備3份，然后同1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算對(duì)應(yīng)的加標(biāo)回收率及RSD。

1.2.1.9 檢出限：連續(xù)進(jìn)行10次空白測(cè)試，按公式計(jì)算檢出限：

1.2.2 福林酚法：標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的配制和樣品的制備同考馬斯亮藍(lán)法，操作步驟按照2020版中國(guó)藥典中福林酚法的要求進(jìn)行[7]。

1.2.3 多所實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證：就起草驗(yàn)證工作進(jìn)行了安排和分工，就工作時(shí)間結(jié)點(diǎn)與驗(yàn)證工作組成員進(jìn)行了確認(rèn)，由本單位進(jìn)行方法建立，即中國(guó)食品藥品檢定研究院（實(shí)驗(yàn)室Z），組織國(guó)內(nèi)多所具有檢測(cè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，包括杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司（實(shí)驗(yàn)室X）、北京蒙博潤(rùn)生物科技有限公司（實(shí)驗(yàn)室M）以及愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司（實(shí)驗(yàn)室A），采用考馬斯亮藍(lán)法，按照1.2.1.3 的實(shí)驗(yàn)方法開展同一方法的驗(yàn)證工作，對(duì)同批次樣品1、樣品3進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，采用Minitab 16對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)其進(jìn)行雙因子方差分析。

2? 結(jié)果

2.1 考馬斯亮藍(lán)法

2.1.1 實(shí)驗(yàn)最佳條件的選擇

2.1.1.1 酸解時(shí)間：選擇30min、45min、60min三個(gè)樣品酸解時(shí)間。30min時(shí)，可以看到頂空瓶中有明顯顆粒，沒有酸解完全，未進(jìn)行下一步操作。加熱45min和60min后頂空瓶中的樣品完全酸解，未發(fā)現(xiàn)顆粒物質(zhì)，兩個(gè)加熱時(shí)間的蛋白含量測(cè)定結(jié)果分別是13.209μg/g、13.734μg/g，結(jié)果差距不大，且在45min時(shí)酸解效果已穩(wěn)定，故選擇45min為樣品的最終酸解時(shí)間。

2.1.1.2 酸性環(huán)境：在標(biāo)準(zhǔn)液系列各試管和供試品試管中分別加入50μl磷酸，再分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑5.0ml進(jìn)行蛋白含量測(cè)定時(shí)，回歸方程為：y=0.0079x-0.0014（r=0.9981），未補(bǔ)加磷酸的回歸方程為：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997）。由表1數(shù)據(jù)可知，補(bǔ)加磷酸后的方法線性相對(duì)較差且吸光度明顯變小，故選擇測(cè)定之前無(wú)需加入磷酸的方法。

2.1.1.3 酸的選擇：采用1mol/L鹽酸溶液對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品進(jìn)行消解后，回歸方程為：y=0.0104x-0.0090（r=0.9972），平均回收率為112.10%，RSD為6.74%，回收率偏高;采用0.5mol/L硫酸溶液的回歸方程為：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），平均回收率為98.70%，RSD為7.68%。并且考慮到鹽酸溶液存在揮發(fā)的可能，故將鹽酸溶液換成硫酸溶液。

2.1.2 線性關(guān)系考察：標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，回歸方程為：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），對(duì)照品含量在2～10μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，表明蛋白質(zhì)在此濃度范圍內(nèi)與吸光度之間符合Lamber-Beer定律。

2.1.3 精密度：連續(xù)進(jìn)行6次分析，吸光度值分別是0.030、0.030、0.031、0.029、0.030、0.031，RSD為2.50%，可知方法精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性：每隔5min進(jìn)行一次檢測(cè)，30min內(nèi)進(jìn)行7次分析，吸光度值分別是0.023、0.026、0.025、0.024、0.024、0.024、0.023，RSD為4.43%，可知該方法在30min內(nèi)樣品顯色穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性：對(duì)樣品2、樣品3、樣品4分別進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，由表2數(shù)據(jù)可知，RSD均值為3.19%，可知方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加標(biāo)回收率：設(shè)定3個(gè)加標(biāo)梯度，數(shù)據(jù)結(jié)果見表2～3，計(jì)算得出，該方法的平均回收率為98.70%，RSD為7.68%，表明方法測(cè)量準(zhǔn)確度良好。

2.1.7 檢出限：10次空白測(cè)定吸光度值分別為：0.078、0.074、0.083、0.072、0.077、0.083、0.078、0.080、0.079、0.072，空白測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0040，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為0.0125，根據(jù)公式計(jì)算檢出限，結(jié)果為0.96μg/ml。

2.2 福林酚法：采用福林酚法測(cè)定結(jié)果，回歸方程為：y=0.0120x-0.0138（r=0.9997），線性關(guān)系雖然良好，但該種方法樣品管加入顯色劑后，顏色有干擾。

2.3 多所實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證結(jié)果：四所實(shí)驗(yàn)室按照1.2.1.3的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品1、3進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，采用Minitab 16對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用雙因子方差分析，顯著水平P=0.253>0.05，因此得出多所實(shí)驗(yàn)室對(duì)樣品1、3的測(cè)定結(jié)果不存在顯著性差異，結(jié)果表明該方法測(cè)定整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量具有可行性和可靠性。見表4。

3? 討論

對(duì)考馬斯亮藍(lán)法和福林酚法的檢測(cè)結(jié)果和理論機(jī)制進(jìn)行分析，福林酚法的檢測(cè)結(jié)果明顯高于考馬斯亮藍(lán)法，考慮到前者的干擾因素很多，包括酚類、多肽、硫酸銨等，而交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品中存在除蛋白以外的多肽類雜質(zhì)，檢測(cè)過程中也會(huì)和福林酚發(fā)生反應(yīng)，造成結(jié)果偏高，認(rèn)為該方法不適用于整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠不溶于水，需要溶解后才能將交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中殘留的蛋白質(zhì)釋放出來，同時(shí)還需不影響蛋白質(zhì)的測(cè)定。酸水解不充分，凝膠中的蛋白質(zhì)不能完全溶出;水解過度可能會(huì)使樣品中的蛋白質(zhì)水解成單體氨基酸或低分子肽（考馬斯亮藍(lán)試劑不與單體氨基酸及相對(duì)分子量小于3kDa的多肽結(jié)合[8]），影響結(jié)果準(zhǔn)確性。采用考馬斯亮藍(lán)法，對(duì)酸解條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了酸的濃度以及酸解時(shí)間等因素，最終確定了0.5mol/L硫酸溶液3ml，在（95±5）℃恒溫干燥箱消解45min的酸解條件。該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，精密度和準(zhǔn)確度較高，且通過四所實(shí)驗(yàn)室開展同一方法的驗(yàn)證工作，對(duì)其檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因子方差分析，測(cè)定結(jié)果不存在顯著性差異，得出本次建立的整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法具有可行性和可靠性，可作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法推廣應(yīng)用。

在實(shí)驗(yàn)操作過程中忽視某些細(xì)節(jié)也會(huì)直接影響反應(yīng)結(jié)果，例如考馬斯亮藍(lán)G-250與石英比色皿（成分為二氧化硅）產(chǎn)生強(qiáng)烈的結(jié)合，因此本實(shí)驗(yàn)建議使用玻璃或塑料比色皿;考馬斯亮藍(lán)分子結(jié)構(gòu)對(duì)光照敏感，光照強(qiáng)烈會(huì)使顯色劑吸收光譜發(fā)生改變，造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大波動(dòng)，因此需采用棕色試劑瓶且避光測(cè)定[9];考馬斯亮藍(lán)染色液在配制時(shí)，應(yīng)先加入考馬斯亮藍(lán)G-250粉末和乙醇，必須保證考馬斯亮藍(lán)G-250溶解后再加磷酸（可使用超聲），最后用純化水定容在棕色容量瓶中，24h后使用效果更佳，使用前需過濾;稱取交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠時(shí)，需置于頂空瓶的底部，避免沾到瓶壁影響酸解，加入硫酸后，需輕拿輕放，勿搖晃頂空瓶;此外，在檢測(cè)時(shí)效上，時(shí)間因素對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響較為顯著，因此需兩人配合測(cè)定吸光度以加快速度，保證時(shí)間的一致性。

致謝：在此，十分感謝杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司、北京蒙博潤(rùn)生物科技有限公司、愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司以及相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍?duì)YY/T《整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的修訂內(nèi)容和補(bǔ)充驗(yàn)證情況做出的努力，對(duì)該行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

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[收稿日期]2020-08-20

本文引用格式：于浩，姜愛莉，李敏，等.《整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠》標(biāo)準(zhǔn)中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（10）：6-10.