PET 瓶無菌線培養(yǎng)基模擬灌裝的取樣數(shù)與污染率問題研究

陸健鋒 張琪 謝駿琦 周衛(wèi)林

無菌灌裝是指在無菌環(huán)境下，將滅菌后的液態(tài)物料及包裝材料完成灌裝和封口的過程。與高溫?zé)峁嘌b相比，無菌灌裝采用嚴(yán)格的過程控制，在可能會(huì)引起微生物污染的位置加強(qiáng)無菌狀態(tài)的保持，無需添加防腐劑，無需二次殺菌就可以達(dá)到商業(yè)無菌［1,2］，同時(shí)降低PET 的克重，并在瓶型設(shè)計(jì)方面具有更大的靈活性。培養(yǎng)基模擬灌裝是無菌驗(yàn)證的核心內(nèi)容，是指在無菌驗(yàn)證中，以培養(yǎng)基替代生產(chǎn)介質(zhì)，模擬實(shí)際產(chǎn)品生產(chǎn)過程，并通過培養(yǎng)基的最終染菌率來評(píng)估無菌保證能力。

無菌的概念

無菌是指不含任何微生物，從定義上來說，是一個(gè)絕對(duì)的概念。一旦將無菌定義為絕對(duì)無微生物污染，那么就無法用科學(xué)的方法來驗(yàn)證，從而無法建立起可以應(yīng)用的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，因此我們需要的無菌概念是科學(xué)的、安全的，最重要是可驗(yàn)證的。無菌產(chǎn)品的安全性要求設(shè)定相對(duì)的無菌標(biāo)準(zhǔn)。

物理或化學(xué)滅菌方法的殺滅曲線是遵循對(duì)數(shù)規(guī)則的，即意味著一批滅菌物品中可能有一定概率的活微生物未被殺滅或除去［3］，所以無菌性在概率意義上定義為污染低到可接受的程度，一般用無菌保證值SAL（Sterility Assurance Level）表示。USP24 版〈1211〉的滅菌及滅菌保證提到：最終滅菌產(chǎn)品的SAL 要求小于百萬分之一。無菌灌裝產(chǎn)品的 SAL 要求小于千分之一。飲料行業(yè)所說的無菌屬于“商業(yè)無菌”概念，商業(yè)無菌是指經(jīng)過適度的殺菌后，產(chǎn)品不含有致病性微生物，也不含有在通常溫度下能繁殖的非致病性微生物［4］。

灌裝取樣數(shù)

培養(yǎng)基灌裝是無菌檢查的一種特殊形式。灌裝數(shù)量可看作取樣數(shù)量，將直接影響無菌檢查的可信度。

在培養(yǎng)基灌裝檢查發(fā)現(xiàn)污染的概率公式：

Q=1-（1-p）n

Q—未通過無菌檢查的概率

n 取樣數(shù)

P 產(chǎn)品污染率（與生產(chǎn)工藝提供無菌保證的能力有關(guān)）通過兩項(xiàng)式展開法來評(píng)價(jià)產(chǎn)品污染率（%）和取樣數(shù)對(duì)無菌檢查污染率（%）的影響，見表1：

表1.

從計(jì)算可以看出，產(chǎn)品的污染率越低，通過無菌檢查判斷批產(chǎn)品無菌的可信度越差。如表1 所示，0.2%污染率的產(chǎn)品，當(dāng)取樣數(shù)為 100 時(shí)，誤將產(chǎn)品判為合格的概率為 81.9%。如圖1 所示，同樣的取樣數(shù)，污染率越低，誤將產(chǎn)品判為合格的概率越高。如圖2 所示，在對(duì)產(chǎn)品污染控制比較高的情況下，加大取樣數(shù)，提高的可信度也是微不足道的。增加取樣數(shù)時(shí)，無菌操作污染的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加，因此，過多地增加取樣數(shù)并不是保證產(chǎn)品無菌驗(yàn)證準(zhǔn)確性的合理路徑。

圖1

圖2

通常情況下，確定培養(yǎng)基的灌裝數(shù)量考慮以下兩個(gè)主要因素：一是應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，即在95%的置信區(qū)間，且至少能檢出千分之一的污染率［5］；二是被驗(yàn)證工藝過程覆蓋日常實(shí)際生產(chǎn)批量。因?yàn)閷?shí)際生產(chǎn)批量與無菌工藝操作所持續(xù)的時(shí)間和灌裝速度密切相關(guān)，而培養(yǎng)基灌裝的持續(xù)時(shí)間應(yīng)足以涵蓋實(shí)際生產(chǎn)條件下的全部操作，并且培養(yǎng)基的灌裝數(shù)量應(yīng)能反映出在等于或小于實(shí)際生產(chǎn)的灌裝速度下產(chǎn)品及容器所暴露時(shí)間的“最差狀況”［6,7］。飲料行業(yè)不同于制藥企業(yè)，灌裝設(shè)備無菌保持時(shí)間通常為72小時(shí)，以實(shí)際運(yùn)行產(chǎn)能24000 瓶/時(shí)的灌裝設(shè)備單批量計(jì)算達(dá)到1728000瓶。如果以該數(shù)量定為培養(yǎng)基模擬灌裝量，那么將大幅增加企業(yè)生產(chǎn)成本。因此，飲料行業(yè)在無菌驗(yàn)證時(shí)，培養(yǎng)基模擬灌裝取樣數(shù)通常為30000 瓶，并且分三輪，在生產(chǎn)初始、中間、末尾進(jìn)行灌裝取樣，目的是為了盡可能地覆蓋一個(gè)無菌周期。

污染概率

FDA 規(guī)定了無菌灌裝方法的無菌安全程度為10-3，因此，培養(yǎng)基灌裝污染率的極限值是0.1%。FDA 工業(yè)指南《用無菌工藝生產(chǎn)的無菌藥品—現(xiàn)行良好生產(chǎn)方法》有關(guān)無菌制劑工藝模擬驗(yàn)證合格標(biāo)準(zhǔn)如下：

1. 灌裝少于 5000 支時(shí)， 不應(yīng)檢出污染品

2. 灌裝在 5000 至 10000 時(shí)：

(1) 1 支污染需進(jìn)行調(diào)查， 并考慮重復(fù)培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)

(2) 2 支污染需進(jìn)行調(diào)查， 并可即視作再驗(yàn)證的理由

3. 灌裝超過 10000 支時(shí)：

(1) 1 支污染需進(jìn)行調(diào)查

(2) 2 支污染需進(jìn)行調(diào)查， 并可即視作再驗(yàn)證的理由

根據(jù)歐洲飲料機(jī)械工業(yè)協(xié)會(huì)（Association of the Beverage Machinery Industry）公布的無菌驗(yàn)證協(xié)議：低酸性產(chǎn)品的無菌驗(yàn)證分3 輪進(jìn)行，每輪10000 瓶，每輪≤1 瓶的染菌被視為無菌驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)基灌裝污染率是無菌檢查的一項(xiàng)重要參數(shù)，當(dāng)某一條無菌生產(chǎn)線通過培養(yǎng)基模擬灌裝測(cè)試，代表該生產(chǎn)線達(dá)到商業(yè)無菌［8］。

無論在醫(yī)藥還是食品行業(yè)，無菌技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)領(lǐng)域已有幾十年的歷史，隨著科技的飛速發(fā)展以及相關(guān)應(yīng)用技術(shù)不斷提高，無菌技術(shù)越來越成熟、可靠。同時(shí)，食品安全性和營(yíng)養(yǎng)功能性受到廣泛重視，低碳高效的無菌技術(shù)在未來具有廣闊的發(fā)展空間。