酸漿苦味素B在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及組織分布研究

王 勇,張炯怡,謝明軍,宋曉寧,馬 瑩 ,張志勇

(1.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州貴陽(yáng) 550004；2.貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州貴陽(yáng) 550004；3.貴州省藥品監(jiān)督管理局，貴州貴陽(yáng) 550004)

在新藥的研究與開(kāi)發(fā)過(guò)程中，臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究具有重要的意義，良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和較低毒副作用是藥物通過(guò)臨床試驗(yàn)的關(guān)鍵，也是先導(dǎo)物篩選、結(jié)構(gòu)優(yōu)化的重要參考依據(jù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，藥物研究過(guò)程中，由于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)不理想而淘汰的藥物，占到新藥開(kāi)發(fā)的50%。因此，在藥物研發(fā)早期進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，可更快捷地獲得安全有效的活性藥物，并通過(guò)藥物在體內(nèi)的吸收、分布及消除特點(diǎn)，為活性藥物的結(jié)構(gòu)改造提供科學(xué)依據(jù)。

酸漿屬茄科酸漿屬植物PhysalisalkekengiL.var.franchetii，又名紅姑娘、 掛金燈、 燈籠草等[1]。酸漿性寒味苦，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿通淋等功效，常用于咽痛音啞、痰熱咳嗽、小便不利、熱淋澀痛、天皰瘡和濕疹治療[2]。我國(guó)酸漿的野生資源豐富，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，北方較多，吉林、河北、新疆等地為主要產(chǎn)區(qū)[3]。據(jù)研究報(bào)道，錦燈籠具有抗炎、抗菌、利尿、抗癌等多種藥理作用[1]。酸漿的化學(xué)成分早期已被廣泛報(bào)道[4-5]，目前為止，從酸漿中已經(jīng)分離出120多種成分[6]，包括生物堿、甾體、黃酮和苯丙素類等。其中，甾體(主要為酸堿苦味素類)被廣泛認(rèn)為是酸漿的特征活性物質(zhì)。

本課題組長(zhǎng)期致力于研究酸漿在治療胃潰瘍方面的應(yīng)用，前期結(jié)果顯示，酸漿超微粉以及酸漿乙酸乙酯萃取部位均具有顯著的抗炎和抗胃潰瘍活性，而且對(duì)幽門螺桿菌(Hp)具有一定抑制活性[7-8]。通過(guò)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)酸漿苦味素B是酸漿抗胃潰瘍活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有顯著的體內(nèi)抗胃潰瘍活性[9]，有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。為了進(jìn)一步了解酸漿苦味素B在體內(nèi)的吸收和分布規(guī)律，本研究對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及組織分布進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和試劑 酸漿苦味素B，貴州省食品藥品檢驗(yàn)所科研室自制；安西萘德(批號(hào)：510020-201401，純度為99.5%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；甲酸(色譜純)和羧甲基纖維素鈉(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乙酸乙酯(色譜純)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)，德國(guó)默克股份兩合公司產(chǎn)品；氯化鈉(優(yōu)級(jí)純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠(180 g～220 g)，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(證書(shū)編號(hào)：SCXK 2002-0001，中國(guó)貴陽(yáng))。試驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境3 d，在相對(duì)溫度25 ℃±2 ℃和相對(duì)濕度50%±5%，12 h光照與12 h黑暗的標(biāo)準(zhǔn)條件下用聚丙烯鼠籠分開(kāi)飼養(yǎng)。動(dòng)物試驗(yàn)方法經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)認(rèn)可。試驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.1.3 儀器設(shè)備 液質(zhì)聯(lián)用儀(UPLC-MS，型號(hào)：Xevo TQ，MassLynx V4.1工作站)，沃特世科技有限公司產(chǎn)品；電子天平(XS105DU)、精密度酸度計(jì)(SevenExcellence)，梅特勒-托利多國(guó)際有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(RPM/RCFX1000)，丹麥ScanSpeed公司產(chǎn)品；渦旋混合器(Stander vortex mixer)，美國(guó)Talboys公司產(chǎn)品；超聲波清洗儀(KQ500DE)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9240MBE)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；純水-超純水一體機(jī)系統(tǒng)(明澈D24UA)，德國(guó)默克密理博公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分析條件的建立

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；檢測(cè)方式：正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；選擇監(jiān)測(cè)離子對(duì)：酸漿苦味素B為m/z 493.33/475.255，安西奈德為m/z 338.9/321；毛細(xì)管電壓：4 000 V；錐孔電壓：酸漿苦味素B為28 V，安西奈德為20 V；去溶劑溫度：500 ℃；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/Hr；反吹氣流量：50 L/Hr；碰撞能量：493.33為16 V，475.255為18 V，338.9為10 V，321為10 V。

1.2.2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.2.2.1 內(nèi)標(biāo)的選擇 在進(jìn)行液相質(zhì)譜分析時(shí)，對(duì)于理想內(nèi)標(biāo)物的選擇，應(yīng)具有穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)與待測(cè)物相似、質(zhì)量數(shù)差別不大、色譜行為也能接近，如保留時(shí)間應(yīng)盡量接近待測(cè)物等特征，其中待測(cè)物的同位素普遍認(rèn)為是最理想的內(nèi)標(biāo)物，但本研究中酸漿苦味素B的氘代物難以制備。因此，通過(guò)對(duì)與酸漿苦味素B結(jié)構(gòu)相似的41種糖皮質(zhì)激素類甾體化合物進(jìn)行篩選，以尋找最佳的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

1.2.2.2 溶液的配制 酸漿苦味素B標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取10.4 mg酸漿苦味素B，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得1.04 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密取適量?jī)?chǔ)備液，用甲醇稀釋得5 200、2 600、520、260、52、26、5.2 ng/mL濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置-20 ℃保存。

安西萘德內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取10.9 mg酸漿苦味素B，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得1.09 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL，置于100 mL容量瓶中，甲醇稀釋得1.09 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置-20 ℃保存。

1.2.2.3 生物樣品的采集與制備

(1)給藥方案 藥代動(dòng)力學(xué)研究：取SD大鼠15只，雌雄各半，體重180 g～230 g，分為高、中、低3個(gè)劑量組，每組5只，試驗(yàn)前禁食1 d，自由飲水。試驗(yàn)時(shí)，3組給藥劑量分別為4.968、9.935、19.87 mg/kg。

組織分布研究：取SD大鼠18只，雌雄各半，體重180 g～230 g，分為3組，每組6只，試驗(yàn)前禁食1 d，自由飲水。 試驗(yàn)時(shí)， 3組給藥劑量均為19.87 mg/kg。

(2)血漿的采集與制備 每個(gè)劑量組在灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)分別于尾靜脈取血，收集于含肝素鈉的玻璃離心管，3 000 r/min離心10 min，分離得上清即為血漿，置-80 ℃保存。

(3)組織的采集與勻漿液的制備 經(jīng)給藥后不同時(shí)間點(diǎn)，分別處死一組大鼠，立即取腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、卵巢、脂肪和肌肉組織各2 g，表面用生理鹽水將血液清洗干凈后，用濾紙吸干水分，稱重，至于玻璃勻漿管中，加入3倍生理鹽水進(jìn)行研磨勻漿，即得各組織勻漿液，置-80 ℃保存。

1.2.2.4 大鼠血漿與組織樣品的預(yù)處理 取血漿或組織勻漿液300 μL于1.5 mL EP管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液400 μL，渦旋2 min，加入800 μL乙酸乙酯，渦旋2 min，超聲提取10 min，12 000 r/min離心5 min，精密吸取400 μL上層乙酸乙酯提取液，至新的EP離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，殘留物?00 μL 500 mL/L甲醇水溶液復(fù)溶，12 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，裝進(jìn)樣小瓶，備用。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證 本研究的分析方法通過(guò)歐洲藥品管理局(European Medicine Agency,EMA)關(guān)于生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)方針進(jìn)行驗(yàn)證[1]，依次考察方法的專屬性、線性范圍、檢出限、定量限、日內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。

1.2.3.1 方法的專屬性 取大鼠空白血漿或空白組織勻漿液200 μL，除內(nèi)標(biāo)安西奈德用200 μL甲醇代替外，氮?dú)獯蹈珊蟀础把獫{與組織樣品的預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣5 μL，得色譜圖；取200 μL一定濃度的酸漿苦味素B和安西奈德內(nèi)標(biāo)混合溶液，氮?dú)獯蹈珊?，加?00 μL空白血漿或空白組織液，依同法操作，得色譜圖；取大鼠口服灌胃酸漿苦味素B后的血漿樣品或組織勻漿液，加入200 μL內(nèi)標(biāo)溶液，同法操作，得色譜圖。通過(guò)分析比較，考察酸漿苦味素B和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的專屬性。

1.2.3.2 線性范圍、檢出限和定量下限 分別取400 μL系列濃度對(duì)照品溶液，按“血漿與組織樣品的預(yù)處理”項(xiàng)處理，配制成相當(dāng)于酸漿苦味素B血漿、腦勻漿液、心勻漿液、肝勻漿液、脾勻漿液、肺勻漿液、腎勻漿液、小腸勻漿液、大腸勻漿液、直腸勻漿液、卵巢勻漿液、脂肪勻漿液和肌肉勻漿液質(zhì)量濃度分別為1.3、6.5、13、65、130、650、1 300 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液， 以及相當(dāng)于酸漿苦味素B胃勻漿液和十二指腸勻漿液質(zhì)量濃度分別為1.3、6.5、13、65、130、650、1 300、6 500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，12 000 r/min離心10 min，上清過(guò)0.22 μm的濾膜，取5 μL進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。按色譜峰信噪比約等于3∶1時(shí)酸漿苦味素B的濃度為最低檢出限，信噪比約等于10∶1時(shí)酸漿苦味素B的濃度為定量限。

1.2.3.3 精密度與準(zhǔn)確度 取空白血漿和空白組織勻漿液300 μL按上述“血漿與組織樣品的預(yù)處理”制備低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，濃度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)即為精密度，準(zhǔn)確度則通過(guò)相對(duì)誤差表示(RE)，即(實(shí)測(cè)濃度-加入標(biāo)準(zhǔn)濃度)/加入標(biāo)準(zhǔn)濃度×100%，準(zhǔn)確度應(yīng)在±15% 范圍內(nèi)，日內(nèi)精密度和日間精密度不能超過(guò)15%，定量限附近的RSD和RE應(yīng)小于20%。

1.2.3.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取高、中、低3個(gè)濃度對(duì)照各400 μL，按“血漿與組織樣品的預(yù)處理”操作制備不同濃度的血漿和組織樣品，進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積A2。同時(shí)另取大鼠空白血漿或空白組織勻漿液各300 μL，除不加系列濃度對(duì)照和內(nèi)標(biāo)混合溶液外，按“血漿或組織樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下操作，在獲得的400 μL空白血漿或空白組織勻漿液的乙酸乙酯萃取液中加入200 μL高、中、低濃度的對(duì)照和內(nèi)標(biāo)混合溶液，氮?dú)獯蹈?，殘留物?00 μL 500 mL/L甲醇水溶液復(fù)溶，取5 μL進(jìn)樣分析，記錄峰面積A3。取高、中、低3個(gè)濃度對(duì)照各200 μL，置于1.5 mL離心管，氮?dú)獯蹈珊笾苯佑?00 μL 500 mL/L甲醇水溶液復(fù)溶，記錄分析得峰面積為A1。各濃度制備平行樣5份。計(jì)算公式為：

提取回收率=(A2/A3)×100%

基質(zhì)效應(yīng)=(A3/A1)×100%

1.2.3.5 穩(wěn)定性 取相應(yīng)濃度對(duì)照溶液400 μL，按“血漿與組織樣品的預(yù)處理”制備高、中、低3個(gè)濃度血漿和組織勻漿液樣品各5份。用于考察含藥血漿或組織樣品處理好后溶液中分析物在自動(dòng)進(jìn)樣器放置12 h、室溫放置12 h、-20 ℃儲(chǔ)存4周和反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。以測(cè)得值占QC樣品已知濃度的百分率表示待測(cè)物的穩(wěn)定性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用藥代動(dòng)力學(xué)處理軟件DAS2.0非房室模型法，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，運(yùn)用SPSS對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇

選擇內(nèi)標(biāo)時(shí)，先后考察了41種糖皮質(zhì)激素類甾體化合物，其中安西奈德與酸漿苦味素B結(jié)構(gòu)相似、分子質(zhì)量相近、具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)、峰形和出峰時(shí)間相接近且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并且其在后續(xù)各基質(zhì)中的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)較一致，綜合考慮，選擇安西奈德作為本研究的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 專屬性 采用上述試驗(yàn)所優(yōu)化的LC-MS/MS條件，酸漿苦味素B和安西奈德的保留時(shí)間分別為3.96 min和4.32 min。如圖1和圖2所示，酸漿苦味素B和內(nèi)標(biāo)安西奈德互不干擾，空白血漿和空白組織液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，鋒形良好，無(wú)雜峰，基線平穩(wěn)，說(shuō)明該方法具有良好的專屬性。

A.空白大鼠血漿；B.空白大鼠血漿加入酸漿苦味素B和安西奈德；C.大鼠灌胃給藥后的血漿樣品

2.2.2 線性范圍、檢出限和定量下限 以對(duì)照峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)y，酸漿苦味素B血漿或組織勻漿液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，采用最小加權(quán)二乘法(W=1/X2)進(jìn)行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：y=ax+b。結(jié)果表明，酸漿苦味素B血漿樣品及各組織樣品在1.3 ng/mL～1 300 ng/mL和1.3 ng/mL～6 500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。同時(shí)，定量限均為1.3 ng/mL，檢出限均為0.325 ng/mL。

2.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 3個(gè)不同濃度質(zhì)控樣的日內(nèi)精密度，日間精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果顯示，酸漿苦味素B日內(nèi)精密度的RSD范圍是0.68%～12.42%，日間精密度的RSD范圍是2.89%～12.31%，且準(zhǔn)確度的相對(duì)誤差范圍在-8.34%～+9.41%之間，說(shuō)明所使用的方法對(duì)于血漿和組織勻漿液中酸漿苦味素B的測(cè)定是準(zhǔn)確和可重復(fù)的，符合生物樣品分析方法的要求。

A.空白大鼠胃組織勻漿液；B.空白大鼠胃組織勻漿液加入酸漿苦味素B和安西奈德； C.大鼠灌胃給藥后的胃組織勻漿液樣品

2.2.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，高、中、低3個(gè)濃度血漿和組織勻漿液樣品提取回收率范圍為91.7%～112.22%，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)安西奈德在各基質(zhì)的提取回收率為94.17%～118.77%，RSD<15%。同時(shí)，3個(gè)濃度LC-MS/MS基質(zhì)效應(yīng)范圍為91.68%～109.70%，內(nèi)標(biāo)安西奈德在各基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)為93.50%～106.03%。說(shuō)明血漿或不同組織勻漿液樣品中酸漿苦味素B和安西奈德的測(cè)定沒(méi)有顯著的基質(zhì)效應(yīng)，符合生物樣品分析方法的要求。

2.2.5 穩(wěn)定性 血漿和組織液樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器放置12 h、室溫放置12 h、-20 ℃儲(chǔ)存4周和反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)顯示，RSD均在14.19%以內(nèi)，說(shuō)明各化合物的穩(wěn)定性良好。

2.3 血藥濃度數(shù)據(jù)的測(cè)定及濃度時(shí)間曲線

大鼠口服灌胃4.968、9.935、19.87 mg/kg 3個(gè)劑量酸漿苦味素B后，于不同時(shí)間點(diǎn)采集大鼠血液，運(yùn)用經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證后的UPLC-MS/MS方法對(duì)收集的血漿進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的血藥濃度，繪制濃度時(shí)間曲線(圖3)。

圖3 口服灌胃各劑量組酸漿苦味素B后大鼠血漿中的藥物濃度-時(shí)間曲線(n=6)

2.4 酸漿苦味素B在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

本研究運(yùn)用DAS2.0軟件，通過(guò)非房室模型對(duì)酸漿苦味素B在大鼠體內(nèi)的血藥濃度進(jìn)行擬合，求算其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。由分析結(jié)果可知，3個(gè)劑量組的平均血藥濃度峰值Cmax分別為(169.086±6.641)μg/L、(247.513±23.434)μg/L和(619.567±28.201)μg/L，達(dá)峰時(shí)間Tmax均為0.667 h，終末半衰期t1/2z分別為(8.975±2.966)h、(10.022±3.196)h和(5.912 h±2.271)h，清除率CLz/F分別為(5.722±0.796)L/h·kg、(7.001 7±1.196)和(6.277±0.693)L/h/kg，藥時(shí)曲線下峰面積AUC(0-24)分別為(748.735±47.13)μg/L·h、 (1 189.897±100.436)μg/L·h和(2 963.312±176.7)μg/L·h，表觀分布容積Vz/F分別為(71.599±17.172)L/kg、(97.046±21.549)L/kg和(51.917±15.641)L/kg，平均駐留時(shí)間MRT(0-24)分別為(6.811±0.372)h、(7.342±0.401)h和(6.304±0.381)h。結(jié)果顯示,酸漿苦味素B灌胃后在大鼠體內(nèi)吸收迅速，與之前文獻(xiàn)[5]報(bào)道的酸漿苦味素D、酸漿苦味素G和4,7-二脫氫新酸漿苦味素B的大鼠藥動(dòng)參數(shù)相似，這可能與酸漿苦味素B的結(jié)構(gòu)相關(guān)。

表1 3個(gè)劑量下酸漿苦味素B的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.5 酸漿苦味素B在大鼠體內(nèi)的組織分布情況

大鼠在20、50、180 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)以19.87 mg/kg劑量灌胃酸漿苦味素B后，在腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、卵巢、脂肪和肌肉14個(gè)組織中均有檢出相應(yīng)濃度，表明酸漿苦味素B經(jīng)灌胃后，可迅速分布于各組織中(表2)，分布順序如下，給藥20 min后：胃>十二指腸>肺>卵巢>脂肪>腎>肝>小腸>直腸>大腸>脾>心>肌肉>腦；給藥50 min后：胃>十二指腸>小腸>腎>脂肪>卵巢>肝>脾>直腸>心>肺>大腸>肌肉>腦；給藥180 min后：十二指腸>胃>肝>小腸>脂肪>大腸>直腸>肺>心>卵巢>肌肉>腎>脾>腦。由表中的數(shù)據(jù)可以看出，腦、心、肝、脂肪、肌肉和直腸中酸漿苦味素B的含量隨著時(shí)間的增加濃度逐漸增高；脾、腎、胃、十二指腸和小腸組織中酸漿苦味素B的濃度在50 min時(shí)達(dá)到峰值，180 min時(shí)濃度出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；卵巢中酸漿苦味素B的濃度隨時(shí)間的增加濃度逐漸降低；20 min時(shí)，肺、大腸和脂肪組織中酸漿苦味素B濃度高，50 min時(shí)濃度降低，180 min時(shí)有所增加；肺在20 min時(shí)濃度達(dá)到峰值，大腸在180 min時(shí)達(dá)到峰值。綜合各數(shù)據(jù)，酸漿苦味素B主要分布于胃、十二指腸和小腸組織，而腦中的含量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均最低。

表2 大鼠口服灌胃19.87 mg/kg酸漿苦味素B后不同時(shí)間點(diǎn)藥物在各組織中的分布情況

3 討論

液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)技術(shù)自20世紀(jì)70年代問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)過(guò)快速的發(fā)展和更新?lián)Q代，技術(shù)已趨于成熟[10]，目前被廣泛運(yùn)用于中藥的鑒別、質(zhì)控、篩選，以及藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究[11-12]。進(jìn)行藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究，是為了從具有復(fù)雜基質(zhì)的生物樣本中定量檢測(cè)出需要的微量目標(biāo)物，但由于生物樣品基質(zhì)復(fù)雜，待測(cè)物濃度較低，待測(cè)樣本數(shù)量大，因此在藥代動(dòng)力學(xué)研究中，建立準(zhǔn)確、快速、靈敏和高通量的生物樣品定量分析方法是關(guān)鍵點(diǎn)，而LC-MS/MS以其對(duì)多種藥物的通用性，檢測(cè)的專屬性，高靈敏度和快速的分析時(shí)間方面的優(yōu)勢(shì)，已迅速成為一種在藥代動(dòng)力學(xué)研究中不可或缺的測(cè)量工具[13-15]?，F(xiàn)已有關(guān)于源自酸漿的酸漿苦味素D、酸漿苦味素G和4,7-二脫氫新酸漿苦味素B在大鼠體內(nèi)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究的文獻(xiàn)報(bào)道[16]，但關(guān)于酸漿苦味素B的藥代動(dòng)力學(xué)考察，目前只有1篇靜脈注射給藥方式的相關(guān)研究[17]。對(duì)于口服給藥方式的研究，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究應(yīng)用DAS2.0軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行了一房室模型，二房室模型和非房室模型計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比較一房室模型和二房室模型，非房室模型的擬合值更接近于真實(shí)值，因此，本研究選擇非房室模型對(duì)測(cè)定血藥濃度時(shí)間值進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃不同劑量的酸漿苦味素B，血漿的含藥量隨給藥劑量的增加而增高，呈劑量依賴關(guān)系。對(duì)于AUC來(lái)說(shuō)，也呈現(xiàn)成比例的劑量依賴關(guān)系，劑量增長(zhǎng)比例為1.0∶2.0∶4.0時(shí)，AUC值的比例為1∶1.6∶4.0。藥物在血漿中的達(dá)峰時(shí)間均為0.667 h，一方面，表明藥物經(jīng)灌胃后吸收較快，另一方面，說(shuō)明達(dá)峰時(shí)間與用藥劑量無(wú)關(guān)。將3個(gè)劑量的半衰期進(jìn)行t檢驗(yàn)，低劑量與中劑量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，低劑量與高劑量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但中劑量與高劑量之間差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明藥物半衰期與劑量有關(guān)。酸漿苦味素B在體內(nèi)的半衰期 t1/2z較長(zhǎng)，表觀分布容積Vz/F較高，駐留時(shí)間MRT長(zhǎng)，說(shuō)明酸漿苦味素B存在組織器官蓄積的潛在可能，結(jié)合本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，酸漿苦味素B在灌胃24 h后造模，仍對(duì)胃潰瘍具有較好的保護(hù)作用，說(shuō)明酸漿苦味素B各劑量給藥后，作用于機(jī)體的時(shí)間較長(zhǎng)，體內(nèi)代謝較慢，能較好地發(fā)揮其抗胃潰瘍作用。

大鼠靜脈注射酸漿苦味素B(5 mg/kg)后，血藥濃度于給藥后5 min達(dá)到峰值[17]，本試驗(yàn)通過(guò)口服低濃度酸漿苦味素B(4.968 mg/kg)后，達(dá)峰時(shí)間為0.667 h，明顯慢于靜脈注射，半衰期t1/2z(8.975 h±2.966 h) 也明顯慢于靜脈給藥方式(321.2 min±29.5 min)，結(jié)果說(shuō)明，靜脈注射酸漿苦味素B的吸收速率明顯大于口服給藥，這可能是因?yàn)殪o脈注射給藥后，藥物可直接通過(guò)血液循環(huán)分布到各組織器官，而口服灌胃給藥時(shí)，藥物會(huì)受到各種酶的降解[18]、或者食物吸收的影響。

由于機(jī)體個(gè)體差異、各組織器官生理特征的差異以及藥物的理化性質(zhì)，致使藥物在體內(nèi)的分布具有一定的差異性。而這種差異性與藥物的療效和毒副作用相關(guān)，因此對(duì)藥物的組織分布進(jìn)行研究，尋找藥物的作用靶點(diǎn)具有重要意義。進(jìn)行酸漿苦味素B組織分布研究時(shí)，在藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定的基礎(chǔ)上，根據(jù)藥時(shí)曲線確定了20、50、180 min 3個(gè)分別代表分布相、平衡相和消除相的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行組織取樣測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)幾乎所有時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的組織濃度，此結(jié)果有助于理解前期的研究發(fā)現(xiàn)[9]，為何低血藥濃度酸漿苦味素B仍能發(fā)揮顯著的抗胃潰瘍作用。此外，從組織分布數(shù)據(jù)可以看出，胃、十二指腸和小腸含量明顯高于其他組織，其中胃組織中的含量在20 min和50 min時(shí)均高于其余組織，180 min時(shí)略低于十二指腸，說(shuō)明胃和十二指腸可能是酸漿苦味素B口服后的主要吸收部位，表明酸漿苦味素B在胃腸吸收較慢且不完全，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)酸漿苦味素B具有較顯著的抗胃潰瘍作用，推測(cè)胃和十二指腸可能是酸漿苦味素B作用的靶器官和組織，多次服用后導(dǎo)致藥物在胃和十二指腸中蓄積，增加藥物濃度，可能是酸漿苦味素B發(fā)揮藥效的一個(gè)重要原因。另外，大鼠體內(nèi)血流量較豐富的組織器官如腦、心、肝和腎，酸漿苦味素B濃度較低，幾乎與胃和十二指腸相差一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明組織血流量對(duì)藥物的分布影響不大，腦中的濃度最低，但仍有明顯分布，說(shuō)明藥物可能會(huì)透過(guò)血腦屏障，這與文獻(xiàn)[17]報(bào)道相吻合。這些都提示了酸漿苦味素B潛在的良好的藥物開(kāi)發(fā)前景，為藥物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了有價(jià)值的參考。