基于高通量測序技術(shù)比較雄性和雌性黑貉腸道菌群間的差異

朱宇航，朱言柱，司華哲，李 雪，姜恩澤，宋興超，賈 赟，徐 超*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130000；3.銅仁學(xué)院，貴州銅仁 554300；4.大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧大連 116000)

貉(Nyctereutesprocyonoides)屬于食肉目犬科，是一種重要的毛皮經(jīng)濟動物[1]。目前，對貉腸道微生物進行的研究不多，通過比較貉與藍(lán)狐(Alopexlagopus)的腸道菌群[2]，發(fā)現(xiàn)狐與貉的腸道菌群存在一定差異。在貉的日糧中添加益生菌，可改變腸道菌群組成和群落結(jié)構(gòu)，增加其體重[3]。腸道微生物是存在于哺乳動物胃腸道和附著在黏膜和表皮細(xì)胞等位置的微生物的總稱。研究表明，腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)及其功能與宿主的代謝[4]和免疫[5]密切相關(guān)，影響宿主的健康或疾病的發(fā)展。腸道微生物在宿主免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。通過與潛在的病原體爭奪營養(yǎng)和附著位點，腸道共生菌形成重要的屏障，阻止病原體在腸道定植[6]。盲腸和結(jié)腸微生物的主要功能是發(fā)酵膳食纖維并產(chǎn)生短鏈脂肪酸[7-8]，短鏈脂肪酸為微生物和腸道上皮細(xì)胞提供能量來源，維持腸道上皮的完整性[9]。除了正常菌群，腸道內(nèi)還定植著一些致病菌，如產(chǎn)氣莢膜菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌等[10]，損害宿主的健康。

日糧變化是腸道微生物變化的最大影響因素之一，在人類及小鼠已中發(fā)現(xiàn)日糧對腸道微生物的影響與宿主性別相關(guān)[11]。目前，已有許多研究關(guān)注性別對腸道微生物的影響[12-14]。在林麝(Moschusberezovskii)中[15]，雄性林麝菌群的多樣性和豐富度都高于雌性，但是差異并不顯著。崔磊[16]對雞腸道菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)公雞空腸內(nèi)容物中菌群多樣性低于母雞，但在十二指腸、回腸和盲腸高于母雞；公雞十二指腸和空腸菌群豐度低于母雞，但在回腸和盲腸高于母雞。在大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)中發(fā)現(xiàn)，性別在腸道菌群差異中的作用是與年齡相關(guān)的，亞成體及成體雌性熊貓的腸道微生物群落多樣性高于雄性，老年雌性熊貓的腸道微生物群落多樣性要低于雄性[17]。小鼠的腸道微生物某些類群的相對豐度與性別相關(guān)[18]。目前，對于貉腸道微生物在性別間的差異還未見報道。

本試驗對雄貉和雌貉的腸道微生物進行16S測序，分析冬毛期雌貉與雄貉腸道微生物菌群組成及結(jié)構(gòu)差異，并對菌群進行功能預(yù)測，從腸道微生物的角度評估是否需要對冬毛期不同性別貉進行差別飼養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 本試驗所用黑貉來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動物飼養(yǎng)基地，24只健康的成年黑貉(10月齡)，12只雄貉(M1～12，體重為7.55 kg±1.19 kg)，12只雌貉(F1～12，體重為6.67 kg±0.67 kg)。

1.1.2 所用飼料 該飼養(yǎng)場日常飼糧的成分及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.1.3 主要試劑 無水乙醇、氯仿、異戊醇、TE緩沖液，北京伊諾凱科技有限公司產(chǎn)品；高保真酶，TOYOBO公司產(chǎn)品；GeneJET膠回收試劑盒，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒，Illumina公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 高速冷凍離心機(1-2-204)，北京三聯(lián)順達(dá)商貿(mào)中心產(chǎn)品；梯度PCR儀(T100)，北京依珊匯通科技有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(DYY-8C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(JY04S-3C)，北京君意華鑫科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 于2020年2月10日，采集黑貉新鮮的糞便分裝至無菌采樣管，做好標(biāo)記，立即放入液氮中低溫保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)處理 使用Qiime 1.9.1對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制。通過(https://github.com/torognes/vsearch/[19]與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對，去除其中的嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。以97%的一致性將序列聚類成為分類操作單元(operation taxonomic units，OTU)，并對OTU序列進行物種注釋，設(shè)定閾值為0.8～1，獲得分類學(xué)信息并統(tǒng)計各樣本在各個分類水平的群落組成。

使用Qiime 1.9.1計算Observed-species、Chao 1、Shannon、Simpson、ace、Goods-coverage指數(shù)以及Unifrac距離。使用R 2.15.3繪制稀釋曲線、物種累積曲線和PCoA圖。提取KEGG數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組16S rRNA基因序列并利用Blastn算法將其比對到SILVA SSU Ref NR數(shù)據(jù)庫(Blast bitscore >1 500)建立相關(guān)矩陣，實現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫功能注釋。測序樣品以SILVA數(shù)據(jù)庫序列為參考序列聚類出OTU，進而獲取功能注釋信息?；跀?shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，同時做t檢驗差異分析。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，選用t檢驗進行組間差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。所有的結(jié)果都以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)總結(jié)及α多樣性分析

得到1 481 402個有效序列(雄貉759 021條，雌貉722 381)。單個樣品中，有效序列最少為53 598條，最多為68 452條。以97%的一致性進行OTU聚類，共得到18 178個OTUs。所有樣品的覆蓋率均超過99.8%。每個樣品的具體參數(shù)見表2。從稀釋曲線和物種累計曲線圖(圖1)可見，本試驗的樣品數(shù)量和測序深度都以足夠反映試驗貉腸道菌群的多樣性信息，滿足后續(xù)分析要求。根據(jù)樣本測序數(shù)據(jù)，雌貉與雄貉腸道菌群的觀測物種數(shù)差異顯著，Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)均無顯著差異。

圖1 稀釋曲線(A)和物種累計箱型圖(B)

表2 樣本測序數(shù)據(jù)分析

2.2 腸道菌群在門和屬水平上的分布

以進行物種注釋過的OTU為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)所有樣品中的細(xì)菌可歸屬24個菌門。其中優(yōu)勢菌門見圖2。在門的水平上，雌貉和雄貉的腸道菌群均以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)為主，3個菌門所占比例相加均超過98%。Firmicutes在雄貉和雌貉中所占比例分別為58.27%±8.00%和61.05%±13.59%，豐度最高。Bacteroidetes在雄貉和雌貉中所占比例分別為36.51%±9.44%和33.80%±14.76%，為第二優(yōu)勢菌門。Proteobacteria在雄貉和雌貉中所占比例分別為3.37%±2.01%和3.24%±2.46%，在各菌門中占比第三高。各菌門相對豐度在組間均沒有顯著差異。

圖2 腸道菌群門分類的相對豐度

在所有的樣品中，總共發(fā)現(xiàn)273個菌屬，優(yōu)勢菌屬見圖3。雄貉與雌貉腸道菌群的主要優(yōu)勢菌屬均為Streptococcus(雄貉8.15%±2.51%；雌貉7.91%±4.74%)、Bacteroides(雄貉4.05%±1.32%；雌貉4.17%±2.08%)、Phascolarctobacterium(雄貉 3.70%±0.84%；雌貉4.63%±1.19%)、Lactobacillus(雄貉2.82%±2.23%；雌貉1.85%±1.38%)、Blautia(雄貉3.43%±0.63%；雌貉3.28%±0.94%)和Alloprevotella(雄貉3.13%±0.66%；雌貉2.98%±0.80%)。各菌屬相對豐度在組間均無顯著差異。

圖3 腸道菌群屬分類的相對豐度

2.3 群落結(jié)構(gòu)與組成的差異分析

2.3.1 主成分分析及組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著性檢驗 用Unifrac weighted distance在屬水平上檢驗雌貉與雄貉腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的差異(圖4)。圖中每個點代表1個樣本，發(fā)現(xiàn)取自雄貉和雌貉的樣本分離并不顯著，使用Adonis方法檢驗組間群落結(jié)構(gòu)差異的顯著性，說明雌貉與雄貉腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)和組成差異不顯著(P>0.05)。

圖4 UniFrac加權(quán)主坐標(biāo)分析圖

2.3.2 功能預(yù)測 通過PICRUST功能預(yù)測，可以看到一些在雌貉和雄貉腸道菌群之間存在顯著差異(P<0.05)的功能。由圖5可知，雌貉菌群中一些二級KEGG途徑，如脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞運動、膜轉(zhuǎn)運和環(huán)境適應(yīng)等與雄貉相比顯著上調(diào)(P<0.05)，而雄貉腸道菌群中碳水化合物代謝、能量代謝、輔酶因子和酶家族等功能與雌貉相比顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖5 功能基因預(yù)測及差異分析

3 討論

本試驗基于高通量測序比較了人工養(yǎng)殖環(huán)境下雄貉與雌貉腸道微生物的差別。通過對黑貉腸道菌群進行多樣性分析可知，雌貉腸道微生物的物種數(shù)目顯著高于雄貉(P<0.05)，雖然雌貉與雄貉腸道菌群的ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)差異并不顯著(P>0.05)，但是雌貉腸道菌群ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)都高于雄貉，這說明雌貉腸道菌群的多樣性和豐富度都高于雄貉，性別對黑貉腸道菌群的多樣性和豐富度存在影響。這與在林麝、雞和大熊貓中的研究結(jié)果一致[15-17]。

研究發(fā)現(xiàn)，在貉、藍(lán)狐(Alopexlagopus)和銀狐(Vulpesvulpesfulva)的腸道菌群中，F(xiàn)irmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria均占據(jù)優(yōu)勢地位，3種菌門相對豐度比例相加均超過90%[2,20-21]。在本研究中，貉腸道菌群在門水平上同樣以Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria為主，3種菌門相對豐度比例相加在雄貉和雌貉中均超過97%，其中Firmicutes和Bacteroidetes相對豐度比例相加均超過94%。

在本試驗發(fā)現(xiàn)的6個優(yōu)勢菌屬中，Streptococcus、Phascolarctobacterium、Lactobacillus和Blautia屬于Firmicutes，Bacteroides和Alloprevotella屬于Bacteroidetes。在藍(lán)狐腸道菌群中，Streptococcus、Lactobacillus、Phascolarctobacterium、Bacteroides和Blautia也是優(yōu)勢菌屬[22]。在日糧組成完全為各種肉類的獰貓(Caracalcaracal)及日糧組成主要為各種竹子的大熊貓的腸道菌群中，Streptococcus均為優(yōu)勢菌屬[23-24]。在本試驗中，飼糧中粗蛋白的比例為23.74%。此外，飼糧中含有大量的豆類和玉米粉，豆類、玉米和竹子中都含有大量的纖維素，這說明Streptococcus在蛋白質(zhì)及纖維素代謝中發(fā)揮作用。在豬腸道菌群中Lactobacillus的數(shù)量與日糧中蛋白質(zhì)的水平正相關(guān)[25-26]。在本試驗及一項研究藍(lán)狐腸道微生物的試驗中，飼糧中粗蛋白質(zhì)的比例分別為23.74%和30.24%，此外，藍(lán)狐腸道菌群中Lactobacillus的比例為9.86%，高于本試驗中的2.82%±2.23%(雄貉)和1.85%±1.38%(雌貉)，這進一步驗證了Lactobacillus在蛋白質(zhì)代謝中的作用。此外，在飼糧中添加可溶性玉米纖維、高粱和麥片會增加Firmicutes中另外2個優(yōu)勢菌屬Phascolarctobacterium和Blautia的水平[27-28]。因此，本試驗中，F(xiàn)irmicutes中的優(yōu)勢均屬主要與纖維的發(fā)酵及碳水化合物的代謝相關(guān)。據(jù)報道Bacteroides主要降解蛋白質(zhì)和脂肪[29]，本試驗的飼糧組成中，粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的比例分別為23.74%和8.82%。Bacteroidetes中的另一優(yōu)勢菌屬Alloprevotella主要產(chǎn)生琥珀酸和醋酸，能夠改善腸道屏障發(fā)揮抗炎作用，是一種有益菌[30]。由此可見，黑貉腸道菌群的優(yōu)勢菌屬與其飼糧組成密切相關(guān)，體現(xiàn)了日糧對腸道微生物深刻的影響。

用Unifrac weighted distance進行Pcoa分析，發(fā)現(xiàn)取自雌貉與取自雄貉的樣品分離不顯著，Adonis檢驗發(fā)現(xiàn)組間群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(P>0.05)。這說明在本試驗條件下，雌貉與雄貉腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)差異不顯著。與此一致，雌貉與雄貉腸道菌群的各菌門和菌屬在組間差異均不顯著(P>0.05)。

根據(jù)PICRUST功能預(yù)測的結(jié)果，雌貉腸道菌群中脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞運動、膜轉(zhuǎn)運和環(huán)境適應(yīng)等與雄貉相比顯著上調(diào)(P<0.05)，而雄貉腸道菌群中碳水化合物代謝、能量代謝、輔酶因子和酶家族等功能顯著上調(diào)(P<0.05)。這可能是由于冬毛期貉的采食量降低，雌貉腸道菌群具有更強的環(huán)境適應(yīng)能力，可通過脂質(zhì)與氨基酸代謝提供能量。在冬眠的棕熊中，腸道微生物代謝脂質(zhì)的能力較夏季升高，通過脂質(zhì)代謝在冬眠期間為機體提供能量。雄貉菌群中碳水化合物代謝、能量代謝及酶家族等功能較雌貉顯著上調(diào)，這說明雄貉腸道菌群在冬毛期具有更強的從飼料中獲取能量的能力。

本試驗中，在飼養(yǎng)環(huán)境及飼糧組成相同的條件下，雖然雌貉腸道菌群的多樣性和豐富度都高于雄貉，但是二者之間的菌群結(jié)構(gòu)差異不顯著。功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)二者在碳水化合物代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝等方面差異顯著，為后期雌性與雄性貉的精細(xì)化飼養(yǎng)提供數(shù)據(jù)支撐。此外，本試驗中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌屬均與飼糧組成密切相關(guān)，進一步體現(xiàn)了日糧對腸道微生物深刻的影響作用。