云南邊境地區(qū)3種外來動物疫病流行情況及病原特性研究

趙文華，李富祥，尹 偉，楊仕標*

(1.云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室/云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南昆明 650224； 2.嵩明縣楊橋街道農(nóng)業(yè)綜合服務中心，云南楊橋 651705)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的以感染動物發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為臨床表現(xiàn)特征的一種急性或亞急性傳染病。該病因快速傳播和較高的病死率而被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物疫病，在我國也將其列為為一類動物疫病[1-2]。目前，PPR主要在非洲和亞洲流行，主要流行毒株為譜系Ⅳ型，每年影響全球3 000萬頭動物,估計每年造成12億～17億美元的經(jīng)濟損失[3]。我國于2007年7月在西藏阿里地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)小反芻獸疫疫情[4]，因疫情發(fā)現(xiàn)早，處置果斷，僅限于局部。2013年底，PPR再次沿河西走廊從新疆向全國范圍快速暴發(fā)，至今仍有零星散發(fā)[5-6]，嚴重威脅我國畜牧業(yè)的生產(chǎn)安全。

裂谷熱(Rift Valley fever,RVF)是一種由蚊子傳播的人獸共患疫病，其病原體是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)，該病嚴重威脅人類和牲畜健康[1,7]。 易感動物是綿羊、山羊、黃牛、水牛及一些野生動物。RVF最早于20世紀30年代初在肯尼亞東部裂谷省因?qū)е赂腥狙虻母吡鳟a(chǎn)率而被發(fā)現(xiàn)報道。近年來已有30多個國家發(fā)現(xiàn)RVF，其中絕大部分位于非洲[8-9]。該病毒具有跨境傳播潛力。中國于2016年6月確診了首例RVFV輸入性人感染病例，該病通過入境人員、合法或者非法貿(mào)易活體動物及其產(chǎn)品，邊境地區(qū)蟲媒等因素傳入我國的風險極大，存在著潛在的威脅[10]。目前尚未見有動物感染的報道。OIE將RVF列為必須報告的動物傳染病。

施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)是一種正布尼亞病毒，于2011年11月在德國通過宏基因組檢測首次被發(fā)現(xiàn)并報道，此后在歐洲多地確診存在該病[11-12]。SBV主要是由庫蠓傳播，多種家畜和野生動物均易感染；感染牛、綿羊和山羊，引起短暫發(fā)熱、腹瀉、奶牛產(chǎn)奶量減少，更嚴重的是懷孕動物流產(chǎn)或后代畸形，可造成相當大的經(jīng)濟損失。至2013年9月下旬，共有27個歐洲國家存在SBV感染區(qū)；2016年-2017年，英國和法國暴發(fā)該病。目前我國尚無該病的報道。

云南省地處我國西南邊陲，與東南亞多國接壤或者相鄰，地理位置特殊。 PPRV、RVFV及SBV等3種重要的外來動物疫病通過人員往來、活體動物及其產(chǎn)品貿(mào)易、蟲媒等因素傳入云南邊境地區(qū)的風險極高。為了有效地防控該3種外來動物疫病入侵，在邊境地區(qū)外來動物疫病日常監(jiān)測、海關進口活體牛、羊等及其制品檢驗檢疫中需要對該3種病原實施檢測。此外，是否存在PPR無臨床癥狀帶毒羊，一直是學者和獸醫(yī)行業(yè)主管部門關注的問題。為了了解上述3種重要外來動物疫病在云南邊境地區(qū)的流行情況，2019年11月，對昆明轄區(qū)內(nèi)某大型牲畜交易市場及某規(guī)?；膛：献魃珉S機采取綿羊、山羊、牛、馬及驢等不同動物(包含境外動物)鼻拭子樣本及血液樣本進行病原核酸檢測，并對檢測陽性病原進行了病原學特性研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 對云南昆明轄區(qū)內(nèi)某大型牲畜交易市場及某奶牛規(guī)模化合作社采集不同動物鼻拭子樣本或血液樣本，樣本情況詳見表1。

表1 樣品信息表

1.1.2 試劑、耗材及儀器設備 采集用一次性無菌拭子，揚州洋生醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；一次性負壓血樣采集器及采集針，山東天愛醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；8.5 mg/mL無菌生理鹽水，實驗室配制，用于采集鼻拭子樣本及樣本浸泡；TaKaRa MiniBest Viral RNA/DNA Extraction kit用于病毒核酸(DNA/RNA)的抽提， TaKaRa MiniBest Plasmid Purification Kit(9760)用于質(zhì)粒樣品的抽提，TaKaRa ExTaq(RR001A)用于普通PCR擴增， TaKaRa One Step RNA PCR Kit(RR024A)用于普通RT-PCR擴增，One Step PrimeScriptTMRT-PCR(Perfect Real Time,RR064A) 用于實時熒光定量RT-PCR，TaKaRa MiniBest Agarose Gel DNA Extraction Kit(9762)用于DNA膠回收，pMDTM18-T Vector Cloning Kit(6011)用于T載體構(gòu)建；DNA標準DL 2 000、Goldview核酸染色劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；GeneAmp PCR SYSTEM 9700普通PCR儀、ABI 7500 Fast 熒光定量PCR儀及熒光定量PCR反應管，ABI公司產(chǎn)品；Nanovue Plus微量分光光度儀，GE公司產(chǎn)品；Blowest Agarose，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇、無水乙醇等其他試劑，均為分析純試劑。

1.1.3 引物 根據(jù)參考文獻[14-15]及GenBank相關序列，設計相關檢測用引物及探針，詳見表2。合成位于PPRV M基因位置的探針引物，用“Cy5-BHQ2”標記；合成位于RVFV NS基因位置的探針引物，用“FAM-TAMRA”標記；合成位于SBV NP基因位置的探針引物，用“VIC-BHQ1”標記；組成PPRV/RVFV/SBV三重實時熒光RT-PCR檢測體系。PPRV FHF/FHR引物對位于PPRV基因組的F基因與H基因接頭位置，用于陽性PPRV樣本的普通RT-PCR鑒定。TaqMan探針及引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成，級別均為HPLC級。將合成的引物/探針干粉用無RNAase酶的PCR級水進行溶解，引物/探針貯存濃度為100 pmol/μL，引物工作濃度為20 pmol/μL，探針工作濃度為10 pmol/μL。

表2 檢測用探針引物

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理 在云南昆明轄區(qū)內(nèi)某大型牲畜交易市場和某規(guī)?；膛觯膊杉?58份不同來源的樣品，其中，鼻拭子樣品180份，包括羊89份、牛53份、馬33份和驢5份鼻拭子樣品；血凝塊樣本78份，包括牛68份、馬5份和驢5份血凝塊樣品(表1)。鼻拭子樣本于5 mL 8.5 g/L生理鹽水中浸泡過夜后，每5個樣品做成一個池樣品抽提RNA，共計有36個池樣品；血凝塊樣品研磨后亦每5個做成一個池樣品抽提RNA，共計有14個池樣品。檢測結(jié)果為陽性的池樣品再逐一抽提組成其每個單樣品的RNA。

1.2.2 病毒基因組RNA提取 采集的鼻拭子樣本加入5 mL生理鹽水浸泡過夜，各取200 μL待用，采集的血液樣本，取凝結(jié)后的血塊加適量生理鹽水研磨好各取200 μL待用。然后按照提取試劑盒說明書操作， 簡述如下：待測樣品各取200 μL，加入1.5 mL離心管中，然后加入200 μL的Solution A，室溫放置5 min，再加入75 μL的Solution B，混勻后，12 000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的2.0 mL收集管中，加入250 μL含10 mg/mL冰乙酸的異丙醇，混勻，再將上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液。將500 μL的Rinse A加入至吸附柱中，室溫靜置1 min，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；再將800 μL的Rinse B加入至吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液，再次12 000 r/min離心1 min。最后將吸附柱安置于一新的1.5 mL的離心管上，在吸附柱膜的中央處加入50 μL的含20 mg/mL RNase Inhibitor的Elution buffer，室溫靜置3 min～ 5min，然后12 000 r/min離心洗脫DNA。棄去吸附柱， 將收集有RNA液體的離心管， 貯存于-70℃冰箱備用。

1.2.3 反應體系及反應程序 PPRV/RVFV/SBV三重實時熒光定量RT-PCR反應液配制，反應體系20 μL：2×One Step RT-PCR buffer Ⅲ 10.0 μL，TaKaRa ExTaqHS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，Rox Ⅱ 0.4 μL，Primer PPRV-M-tryF1 0.2 μL，Primer PPRV-M-tryR1 0.2 μL，PPRV-Probe-M 0.4 μL，Primer RVFV-tryF1 0.2 μL，Primer RVFV-tryR1 0.2 μL，RVFV-Probe1 0.4 μL， Primer SBV-tryF1 0.2 μL，Primer SBV-tryR1 0.2 μL,SBV-Probe1 0.4 μL,樣品RNA 6.0 μL(或PPRV/RVFV/SBV陽性對照質(zhì)粒DNA各2.0 μL、陰性對照H2O 6.0 μL)，H2O 0.4 μL。反應液混勻后置7500 Fast熒光定量PCR儀上進行反應和熒光信號的檢測，反應程序為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,共43個循環(huán)。熒光信號檢測在每個循環(huán)反應的60 ℃進行。

陽性PPRV樣品RT-PCR反應液配制，反應體系為50 μL：10×One Step RNA PCR buffer 5.0 μL，MgCI210.0 μL，dNTP Mixture 5.0 μL，RNase Inhibitor 1.0 μL,AMV Reverse Transcriptase XL 1.0 μL,AMV-OptimizedTaq1.0 μL,Primer PPR-FHF 1.0 μL，Primer PPRV-FHR 1.0 μL， Sample RNA(或陽性對照RNA、陰性對照H2O )2.0 μL，H2O 23.0 μL。反應各組分加入混勻后置ABI 9700普通PCR儀進行反應，反應程序為：42 ℃ 30 min； 95℃ 2 min；94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應完畢，用20 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下檢測擴增結(jié)果。

1.2.4 PPRV陽性樣品的膠回收、克隆及序列測定分析 將擴增出的PPRV陽性樣本F-H基因接頭部位片段首先進行膠回收純化，然后克隆連接至pMD-18T Vector，對獲得的陽性克隆進行序列測定和分析，具體詳細操作步驟參見相關的參考文獻[16-17]。用DNA Star軟件對所測序列數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品PPRV/RVFV/SBV三重熒光實時定量RT-PCR檢測結(jié)果

用本實驗室已經(jīng)建立的PPRV/RVFV/SBV三重熒光實時定量RT-PCR方法對1.2.1所述50個池樣品進行檢測，在陰性和陽性對照都成立的情況下，檢測到PPRV陽性池樣品1個(圖1)，通過進一步對該陽性池樣品每個組成單樣品的檢測，最后確定采集自大型牲畜交易市場的32號藏牦羊鼻拭子樣本為PPRV核酸陽性。而所有的樣品池中，在綿羊、山羊、奶牛、馬及驢中均未檢測到RVFV及SBV核酸陽性樣本。

2.2 PPRV陽性樣本F-H基因接頭部位RT-PCR擴增及核苷酸序列測定

用表2所設計的PPRV-FHF/ PPRV-FHR引物對對三重熒光定量RT-PCR檢出的PPRV陽性32號鼻拭子RNA樣本進行常規(guī)PPRV RT-PCR擴增，有739 bp預期大小片段擴出(圖2)。將陽性片段膠回收純化、克隆至pMD18T-Vector進行序列測定，測得的核苷酸序列已遞交GenBank，序列號(accession №)為MT109378。

1.PPRV陽性對照；2.RVFV陽性對照；3.SBV陽性對照；4.PPRV陽性樣本；5.陰性對照及陰性樣本

M.DNA 標準DL 2 000;1.32號樣本；2.陽性對照；3.陰性對照

2.3 序列遺傳進化分析

序列測定所檢測出的32號羊鼻拭子F-H基因接頭部位核苷酸序列通過與PPRV各基因型參考毒株序列比對，發(fā)現(xiàn)其屬于基因譜系Ⅳ型(圖3)；與各基因型參考序列同源性在85%～99.2%之間(圖4)，與2013年在新疆伊犁山羊中檢測到的毒株(KM091959)及2014年在吉林家養(yǎng)山羊檢測到的毒株(KM816619)核苷酸同源性最高，為99.2%。遺傳進化樹構(gòu)建及同源性比對所用的PPRV參考毒株情況詳見表3。

表3 PPRV參考毒株情況表

圖3 32號鼻拭子樣品與PPRV參考毒株F-H接頭部位核苷酸序列遺傳進化樹

圖4 32號鼻拭子樣品與PPRV參考序列F-H接頭部位核苷酸同源性比對

3 討論

PPR、SBV和RVF是3種重要的外來動物疫病，均具有跨境傳播的特征，其中，RVF為非常嚴重的人畜共患病，公共衛(wèi)生意義特別重大。雖然，自2014年以來，PPR已經(jīng)在我國流行，但目前我國依然按照外來動物疫病管理。云南地處我國西南邊陲，與東南亞多個國家接壤或者相鄰，與南亞多國相近，是多種跨境動物疫病傳入我國的主要門戶。PPR、SBV和RVF等3種外來動物疫病，通過人員往來、合法和非法的活體動物及其產(chǎn)品貿(mào)易、生物媒介等傳入云南邊境地區(qū)的風險極大，對其實施檢測和監(jiān)測具有重要的意義。

為評估上述3種外來動物疫病傳入云南邊境地區(qū)的風險，在云南昆明轄區(qū)內(nèi)某大牲畜交易市場和某規(guī)?；膛觯膊杉匝?、牛、馬和驢等4種不同動物總計258份樣品進行核酸檢測。檢測結(jié)果表明，在昆明交易羊中仍存在PPRV，通過基因測序比對，確認為目前流行基因譜系Ⅳ型。本次檢測未檢測到RVFV和SBV核酸陽性樣品，表明在有限的采樣范圍內(nèi)，目前云南羊、牛、馬和驢等4種家畜尚未有該兩類病毒。

本次檢測到的PPRV核酸陽性樣本，應用普通RT-PCR擴增F-H基因接頭位置序列，并進一步完成了核苷酸序列測序比對，確定其為PPRV譜系Ⅳ型毒株，與2013年新疆伊犁山羊毒株(KM091959)及2014年吉林家養(yǎng)山羊毒株(KM816619)核苷酸同源性最高，達到99.2%。該項結(jié)果提示，云南邊境地區(qū)交易的臨床健康山羊中存在攜帶PPRV的情況。PPR無癥狀感染一直為行業(yè)學者和動物衛(wèi)生管理部門所關注，應該引起足夠的重視。本次檢測的毒株尚未完成全基因組測序比對和致病性研究，待實驗室條件成熟，以及動物衛(wèi)生管理部門審批后進一步完成。

本研究中所檢測的258份樣本中均未檢測到RVFV和SBV核酸陽性樣本。在云南邊境地區(qū)，人員往來、合法和非法的活體動物及其產(chǎn)品貿(mào)易、生物媒介等RVFV和SBV傳播因素是存在的；而且，云南熱帶亞熱帶氣候條件特別適合該2種病原的生態(tài)條件，該2種外來動物疫病傳入云南邊境地區(qū)的風險很大，應時刻保持警惕，加強監(jiān)測預警。