益智不同組織多糖含量及其生物合成途徑分析

俞振明, 趙聰慧, 張明澤, 何春梅, 司燦, 曾丹琦, 段俊

益智不同組織多糖含量及其生物合成途徑分析

俞振明, 趙聰慧, 張明澤, 何春梅, 司燦, 曾丹琦, 段俊*

(中國(guó)科學(xué)院華南植物園, 廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院華南農(nóng)業(yè)植物分子分析與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510650)

為了解益智()多糖生物合成途徑關(guān)鍵酶功能，對(duì)其莖、葉、果實(shí)中的多糖含量及其單糖組成進(jìn)行了研究，并采用Real-Time qPCR分析了益智多糖生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，益智多糖含量依次為果實(shí)>葉>莖，主要由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖組成；利用益智轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共獲得47 690條unigenes，其中31 892條在NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)獲得注釋，其中208個(gè)unigenes參與益智多糖的生物合成，涉及15個(gè)酶。表達(dá)分析表明，所篩選的18個(gè)基因在莖、葉、果實(shí)中均有表達(dá)，14個(gè)基因在果實(shí)中的表達(dá)量最高，以糖基轉(zhuǎn)移酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)量最高，且其表達(dá)模式與不同組織中葡萄糖含量的變化一致。

益智；多糖；轉(zhuǎn)錄組；糖基轉(zhuǎn)移酶

益智()為姜科(Zingiberaceae)多年生草本植物，是一味藥食同源的植物，其干燥成熟果實(shí)可入藥，主產(chǎn)于廣東、廣西、海南等地，與檳榔()、砂仁()、巴戟天()并稱為我國(guó)“四大南藥”。中醫(yī)認(rèn)為益智味辛、性溫，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等經(jīng)典專著中均有記載，具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾的功效[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，益智野生資源日趨減少，作為保健品和中成藥的主要原料不斷被采挖，還廣泛用于休閑食品(如蜜餞、涼果等)制作，優(yōu)質(zhì)益智種質(zhì)培育是益智產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵內(nèi)容。但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，益智品種培育滯后，優(yōu)良種質(zhì)不斷退化，嚴(yán)重阻礙了益智品質(zhì)的提升[2]。因此，為提升益智品質(zhì)，亟需開展益智有效成分合成途徑及調(diào)控機(jī)制的研究，進(jìn)而指導(dǎo)益智優(yōu)良品種選育和科學(xué)生產(chǎn)。

益智營(yíng)養(yǎng)豐富，主要含有倍半萜類和二苯基庚烷類揮發(fā)油、黃酮和多糖等活性物質(zhì)[3–5]，然而有關(guān)其多糖的研究尚不多見。多糖是益智仁中的一類重要活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)人體免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)等多種功效[6–8]。按照多糖中單糖的組成，可分為均一性多糖和不均一性多糖[9–10]。在多糖的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系的研究中，單糖組成分析是基礎(chǔ)性和關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)。盡管不同來(lái)源的多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,但都是由常見的單糖重復(fù)單元組成，它們的生物合成途徑相對(duì)一致，一般包括核苷酸糖合成與轉(zhuǎn)運(yùn)，以及由糖基轉(zhuǎn)移酶參與的多糖鏈的起始、延伸、聚合與終止[11–13]。作為影響益智品質(zhì)的關(guān)鍵成分，目前研究主要集中在益智果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分、化學(xué)成分、藥理活性等方面[3–5,14]，而對(duì)于活性物質(zhì)的生物合成途徑及其代謝關(guān)鍵酶基因的報(bào)道鮮少。因此，厘清益智多糖生物合成途徑將對(duì)益智品質(zhì)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也為深入挖掘多糖生物合成途徑的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

鑒于此，本研究以益智為研究材料，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，從分子水平上推斷益智多糖的生物合成途徑，重點(diǎn)挖掘參與益智多糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，及其在益智莖、葉和果實(shí)中的差異表達(dá)情況，為益智品質(zhì)遺傳工程改良和良種選育提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

益智()采集自廣東農(nóng)墾熱帶農(nóng)業(yè)研究院種植基地，于2020年6月采收，分開莖、葉和果實(shí)，用液氮速凍后，置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诙嗵巧锖铣赏緩疥P(guān)鍵酶基因的組織表達(dá)分析。以上材料由廣東農(nóng)墾熱帶農(nóng)業(yè)研究院梁秋玲提供。

1.2 多糖含量測(cè)定

將益智的莖、葉和果實(shí)分別洗凈、晾干，105℃殺青2 h，80℃烘干。取適量樣品粉碎后過(guò)50目篩,裝入自封袋并標(biāo)記信息，貯存于干燥器中。參照Yu等[15]的方法測(cè)定多糖含量，精確稱量樣品0.25 g,經(jīng)石油醚80℃回流2 h脫脂后，回收石油醚，殘?jiān)鼡]干溶劑加入50 mL蒸餾水，置沸水浴中提取4 h，冷卻至室溫后過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,定容，即為多糖待測(cè)液。精確量取100g/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入10 mL具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL, 混勻后加入新鮮配制的5%重蒸苯酚溶液1 mL，渦旋振蕩混勻，緩慢加入98.04%濃硫酸5 mL，蓋上玻璃塞，渦旋振蕩混勻后，置于沸水浴中反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，測(cè)定488 nm處的吸光值, 以吸光值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(=198.55+1.23,2=0.999 3)。精確量取0.2 mL多糖待測(cè)液，置于10 mL具塞試管中, 用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，按照繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測(cè)定488 nm處的吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出待測(cè)液中葡萄糖含量，計(jì)算益智多糖含量。

1.3 單糖組成分析

益智多糖中的單糖組成采用酸水解法[16]確定。精確量取4 mL多糖待測(cè)液，加入2 mol/mL三氟乙酸6 mL，110℃連續(xù)水解8 h，60℃濃縮至干，加入2 mL甲醇，再次蒸干除去多余的三氟乙酸，加入2 mL蒸餾水溶解，過(guò)0.22m親水性濾膜，得多糖水解液。精確量取0.4 mL多糖水解液，加入0.3 mol/mL的NaOH溶液和0.5 mol/mL的PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，M70800，購(gòu)自Sigma-Aldrich)甲醇溶液各0.4 mL，混勻，于70℃水浴反應(yīng)100 min。反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，加入0.3 mol/mL的HCl溶液0.5 mL,混勻，加入2 mL三氯甲烷洗滌，5 000×室溫離心,保留上層，棄下層三氯甲烷，重復(fù)3次，過(guò)0.22m有機(jī)濾膜，備用。

精確量取10L多糖水解液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。色譜柱為Ultimate?XB-C18(4.6 mm× 250 mm, 5m)。流動(dòng)相為乙腈(34998，購(gòu)自Sigma- Aldrich)和KH2PO4緩沖液(0.1 mol/mL, pH 6.8)= 16∶84，柱溫：30℃，波長(zhǎng)：210 nm，流速：1 mL/min。以對(duì)照品保留時(shí)間確定單糖，用峰面積歸一化法計(jì)算各單糖的含量。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

下載益智轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(NCBI登陸號(hào): PRJNA 559252)，剔除轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中含有接頭和低質(zhì)量的reads，獲得clean reads。采用Trinity軟件進(jìn)行益智轉(zhuǎn)錄本組裝和拼接，采用Swiss-Prot、COG、GO、KEGG、KOG、Pfam和NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行unigenes功能注釋，并對(duì)已注釋的unigenes進(jìn)行GO分類和富集分析、KEGG代謝通路富集分析。根據(jù)注釋信息，分析益智多糖生物合成途徑，挖掘多糖生物合成的關(guān)鍵酶基因。

1.5 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(0416-50,購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司)分別提取益智莖、葉和果實(shí)的總RNA[17]，用超微量紫外可見光分光光度計(jì)(Nano DropTM2000c，Thermo Scientific公司)測(cè)定總RNA的質(zhì)量和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄酶M- MLV試劑盒(M1701，購(gòu)自Promega公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所得的cDNA用于多糖生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的組織表達(dá)分析。

1.6 關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析

根據(jù)多糖生物合成途徑關(guān)鍵酶基因序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)。選擇益智延伸因子1-(elongation factor 1-alpha,)為內(nèi)參基因，將莖、葉、果實(shí)cDNA的質(zhì)量濃度定量為200 ng/L。熒光定量PCR儀為Roche Light Cycler 480，操作按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(北京諾禾致源生物科技有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為10L：包括SYBR Green PCR Master Mix 5L，上、下游引物各0.4L，cDNA模板1L, ddH2O 3.2L。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性1 min；然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。每反應(yīng)均3次生物學(xué)重復(fù)。利用2–??CT法[18]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，顯著性分析采用SPSS軟件的新復(fù)極差法(Duncan’s新負(fù)極差法)，繪圖采用Excel軟件。

2 結(jié)果和分析

2.1 多糖含量和單糖組成

采用苯酚-硫酸法比較了益智莖、葉和果實(shí)中的多糖含量，結(jié)果表明果實(shí)>葉>莖，果實(shí)多糖含量是莖的3.21倍、葉的2.22倍，且均達(dá)顯著差異(< 0.05)(表2)。

表1 PCR引物序列

利用柱前衍生化-HPLC法檢測(cè)益智多糖中的單糖含量，結(jié)果表明，益智不同組織中多糖的組成類似，主要由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖組成，以葡萄糖為主。果實(shí)中葡萄糖含量為70.04 mg/g，占79.72%，是莖的7.72倍、葉的4.46倍，表明益智多糖是以葡萄糖為主構(gòu)成的雜多糖。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)功能注釋

益智轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)Trinity軟件組裝和拼接后，共獲得23.88 Gb Clean Data，包含47 690條unigenes。用BLAST軟件將unigenes序列在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，有31 892條unigenes獲得功能注釋，占總序列的66.87%，說(shuō)明益智轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)相對(duì)可靠。

基于COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果，10 069條unigenes被注釋，涉及26個(gè)COG分類，其中注釋最多的5個(gè)分類為“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物起源”、“一般功能基因”、“轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白翻轉(zhuǎn)及伴隨蛋白”、“碳水化合物運(yùn)輸及代謝”和“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”(表3)。

表2 益智多糖和單糖含量

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Data followed different letters within column indicate significant difference at 0.05 level.

表3 所有序列COG分類和統(tǒng)計(jì)

基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)，將17 699個(gè)unigene注釋為生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能3類，分別有9 680、8 304和8 562個(gè)unigene?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)(表4), 12 524條序列獲得注釋，共映射到129條途徑，5個(gè)主要途徑分別為核糖體、碳素代謝、氨基酸生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的加工、植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別有833、468、406、382和366個(gè)unigene。

2.3 多糖合成途徑相關(guān)基因鑒定

益智多糖主要由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等單糖組成，并以葡萄糖為主(表2)。本研究挖掘得到果糖和甘露糖代謝(ko00051)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、半乳糖代謝(ko00052)、磷酸戊糖途徑(ko00030)、戊糖、氨基糖和核苷酸糖代謝(ko00520)等5條多糖相關(guān)代謝途徑，共有897個(gè)unigenes參與，其中208個(gè)unigenes編碼18個(gè)關(guān)鍵酶(包括核苷酸糖合成酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和多糖合成調(diào)節(jié)酶)，據(jù)此推斷益智多糖的生物合成途徑。由光合作用生成的蔗糖在蔗糖合成酶(SS)作用下催化生成果糖和第一類核苷酸糖UDP-葡萄糖。UDP-葡萄糖也可通過(guò)-呋喃果糖苷酶(sacA)、果糖激酶(scrK)、磷酸葡萄糖變位酶(PGM)及UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)連續(xù)催化而得。蔗糖在SS、己糖激酶(HK)、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(MPI)、磷酸甘露糖變位酶(PMM)和甘露糖焦磷酸化酶(GMP)果糖激酶(scrK)的共同作用下產(chǎn)生第二類核苷酸糖GDP-甘露糖。UDP-葡萄糖能在UDP-葡萄糖-差向異構(gòu)酶(UGE)的作用下生成第三類核苷酸糖UDP-半乳糖。UDP-葡萄糖還能在UDP-葡萄糖脫氫酶(UGDH)、UDP-芹菜糖/木糖合酶(AXS)的催化下形成第四類核苷酸糖UDP-木糖，并在UDP-阿拉伯糖差向異構(gòu)酶(UAE)的催化下形成第五類核苷酸糖UDP-阿拉伯糖。這些核苷酸糖在后續(xù)糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，進(jìn)而合成益智多糖(圖1)。

表4 KEGG分類(前20個(gè))

2.4 關(guān)鍵酶基因的表達(dá)

為明確多糖生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)特性，以延伸因子作為內(nèi)參基因，對(duì)18個(gè)關(guān)鍵酶基因在莖、葉、果實(shí)中的表達(dá)情況進(jìn)行Real- time qPCR檢測(cè)，結(jié)果表明，18個(gè)基因在莖、葉、果實(shí)中均有表達(dá), 且絕大多數(shù)基因(14/18)在果實(shí)中的表達(dá)量最高。參與葡萄糖代謝的c64270.graph_c0 (編碼蔗糖合成酶SS)、c77958.graph_c0 (編碼磷酸葡萄糖變位酶PGM)、c75380. graph_c0 (編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGP)和4個(gè)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(c85406.graph_c0、c58247.graph_c0、c96947.graph_c0、c83168.graph_c0)均在果實(shí)中高豐度表達(dá)，并以c75380. graph_c0和c85406.graph_c0的表達(dá)量最高，這可能與益智多糖主要為葡萄糖密切相關(guān)。此外，參與甘露糖代謝的c73719.graph_c0 (編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶MPI)、c71757.graph_c0 (編碼磷酸甘露糖變位酶PMM)、c94431.graph_c0 (編碼甘露糖焦磷酸化酶GMP)也均在果實(shí)中表達(dá)量較高(表5)。這表明多糖生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因在益智不同組織中普遍存在，為其功能研究提供依據(jù)。

3 結(jié)論和討論

益智作為藥食同源的補(bǔ)益品來(lái)源，有1 700多年的藥用歷史，具有減緩胃痛、腹瀉、潰瘍、多尿、延緩衰老、預(yù)防癡呆等作用[1,19–20]，已逐漸形成海南和廣東的特色道地藥用資源[21]。多糖是益智中的一類重要活性成分，益智多糖具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用[6–8]。本研究結(jié)果表明，益智莖、葉和果實(shí)中均含有多糖，以果實(shí)中多糖含量最高，達(dá)87.89 mg/g，表明果實(shí)是多糖的主要積累部位。牛晴等[22]的研究表明，益智果仁中總糖含量高于葉，葉高于莖，與本研究結(jié)果相似。海南五指山、澄邁、屯昌、廣東雷州半島、廣西南寧和安徽毫州的益智果實(shí)中的多糖含量為80.3～86.2 mg/g[23], 表明不同來(lái)源的益智果實(shí)中多糖含量差異不大。此外，對(duì)益智葉和莖多糖進(jìn)行研究不僅有利于其新資源的開發(fā)利用[24]，對(duì)促進(jìn)益智產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展也具有重要意義。

圖1 推斷的益智多糖生物合成途徑。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示基因數(shù)量。

表5 qPCR分析益智多糖生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Data followed different letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level.

雖然植物多糖已被廣泛發(fā)現(xiàn)，但仍有大部分植物多糖被證實(shí)本身不具有生物活性或只有很弱的生物活性。這是由于植物多糖結(jié)構(gòu)與其生物活性緊密相關(guān)，可以通過(guò)化學(xué)修飾改變?cè)薪Y(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)部分多糖的生物活性[25]。多糖是一種聚合糖高分子碳水化合物，而單糖是多糖的基礎(chǔ)組成部分，由不同單糖通過(guò)糖苷鍵連接、縮合、失水形成多糖[12–13]。對(duì)于益智多糖結(jié)構(gòu)的研究，單糖組成是最基本的研究對(duì)象。通過(guò)PMP柱前衍生-HPLC法分析表明, 益智果實(shí)中多糖由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖組成，以葡萄糖含量最高(表1)。趙祥升等[26]報(bào)道益智果實(shí)的多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和甘露糖組成。Shi等[10]報(bào)道益智果實(shí)多糖由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和甘露糖組成。Han等[27]報(bào)道益智果實(shí)多糖以葡萄糖為主要單糖，與本研究的結(jié)果相似。目前益智多糖的分子結(jié)構(gòu)已有報(bào)道，而益智多糖的生物合成途徑卻少有研究，因此，開展益智多糖合成途徑的分析具有重要意義。

通過(guò)對(duì)益智轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行功能注釋，獲得了47 690條unigenes，其中31 892條在NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)獲得注釋。通過(guò)基因GO分類，主要有生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能等3大功能，其中代謝過(guò)程、催化活性過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程等3個(gè)子分類注釋的基因數(shù)量較多?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)，挖掘得到果糖和甘露糖代謝(ko00051)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、半乳糖代謝(ko00052)、磷酸戊糖途徑(ko00030)、戊糖、氨基糖和核苷酸糖代謝(ko00520)等5條多糖相關(guān)代謝途徑，共有897個(gè)unigenes參與，其中208個(gè)unigenes編碼18個(gè)關(guān)鍵酶，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)的unigene最多，其次是蔗糖合成酶(SS)。根據(jù)挖掘得到的多糖合成途徑關(guān)鍵酶，結(jié)合其他植物中多糖生物合成途徑的相關(guān)報(bào)道[11–13,28–29]，推斷出益智多糖的生物合成途徑，這為深入開展益智品質(zhì)形成機(jī)理提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。

多糖生物合成途徑中的18個(gè)關(guān)鍵酶基因在益智莖、葉、果實(shí)中的表達(dá)存在差異，具有組織特異性，總體而言在果實(shí)中的表達(dá)量比莖、葉中高，推測(cè)多糖代謝物在果實(shí)中的合成量比其他組織中高。本研究結(jié)果表明，參與益智多糖中葡萄糖代謝的基因，如蔗糖合成酶基因、磷酸葡萄糖變位酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因均在果實(shí)中的表達(dá)量最高，尤其是糖基轉(zhuǎn)移酶基因(c85406.graph_c0)與UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(c75380.graph_c0)，這與益智不同組織中葡萄糖含量變化較為一致，推測(cè)為調(diào)控益智多糖生物合成的關(guān)鍵基因。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶是植物多糖合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，負(fù)責(zé)調(diào)控多糖合成的起始步驟[30]。糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于生物界，在糖基化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，催化活性糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到糖基受體，進(jìn)而催化糖苷鍵的形成，最終合成糖鏈[28–29,31]。這些為今后探究UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和糖基轉(zhuǎn)移酶在益智多糖代謝途徑中的功能奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)比較益智不同組織中的多糖含量, 并基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析益智多糖的生物合成途徑，從分子水平上揭示益智多糖生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的分子機(jī)制，將有助于開發(fā)和利用益智資源。

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People’s Republic of China, Volume II [M]. Beijing: China Medical Science Press, 2015: 291.

國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典, 第二部 [M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 291.

[2] YAN X X, WANG M Y, WANG J R, et al. Breeding of newvariety ‘Qiongzhong No. 1’ [J]. J Chin Mat Med, 2019, 42(6): 1211–1214. doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2019.06.001.

晏小霞, 王茂媛, 王建榮, 等. 益智新品種‘瓊中1號(hào)’的選育研究 [J]. 中藥材, 2019, 42(6): 1211–1214. doi: 10.13863/j.issn1001-4454. 2019.06.001.

[3] SUI J N, LI F C, GUO Y X, et al. Research progress on chemical constituents, pharmacological effects and quality markers of[J]. Drug Eval Res, 2020, 43(10): 2120–2126. doi: 10.7501/j. issn.1674-6376.2020.10.035.

隨家寧, 李芳嬋, 郭勇秀, 等. 益智仁化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量標(biāo)志物研究進(jìn)展 [J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2020, 43(10): 2120–2126. doi: 10. 7501/j.issn.1674-6376.2020.10.035.

[4] CHEN P, WANG P P, JIAO Z Z, et al. Research advance in chemical constituents in fruits ofand their pharmacological activities [J]. Drugs Clinic, 2013, 28(4): 617–623. doi: 10.7501/j.issn. 1674-5515.2013.04.039.

陳萍, 王培培, 焦?jié)烧? 等. 益智仁的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2013, 28(4): 617–623. doi: 10.7501/j.issn. 1674-5515.2013.04.039.

[5] ZHANG J Q, WANG Y, CHEN F, et al. Progress on chemical consti- tuents and pharmacological activities offructus [J]. Nat Prod Res Dev, 2013, 25(2): 280–287. doi: 10.16333/j.1001-6880. 2013.02.009.

張俊清, 王勇, 陳峰, 等. 益智的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(2): 280–287. doi: 10.16333/j.1001- 6880.2013.02.009.

[6] ZHENG Y, LI Y, WANG W D, et al. Optimizationpolysaccharides extraction by Box-Behnken design and its antioxidant activities [J]. Food Ferment Ind, 2013, 39(8): 245–249. doi: 10.13995/j. cnki.11-1802/ts.2013.08.007.

鄭義, 李勇, 王衛(wèi)東, 等. Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化益智仁多糖的提取及其抗氧化活性 [J]. 食品發(fā)酵與工業(yè), 2013, 39(8): 245–249. doi: 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2013.08.007.

[7] SHI W T, ZHONG J, ZHANG Q, et al. Structural characterization and antineuroinflammatory activity of a novel heteropolysaccharide obtained from the fruits of[J]. Carbohydr Polym, 2020, 229: 115405. doi: 10.1016/j.carbpol.2019.115405.

[8] YANG X, YANG Y H, CHEN H R C, et al. Extraction, isolation, immunoregulatory activity, and characterization offructus polysaccharides [J]. Int J Biol Macromol, 2020, 155: 927–937. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.11.051.

[9] LI C, WANG L X. Chemoenzymatic methods for the synthesis of glycoproteins [J]. Chem Rev, 2018, 118(17): 8359–8413. doi: 10.1021/ acs.chemrev.8b00238.

[10] SHI L. Bioactivities, isolation and purification methods of polysac- charides from natural products: A review [J]. Int J Biol Macromol, 2016, 92: 37–48. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2016.06.100.

[11] DOBLIN M S, PETTOLINO F, BACIC A. Plant cell walls: The skeleton of the plant world [J]. Funct Plant Biol, 2010, 37(5): 357–381. doi: 10.1071/FP09279.

[12] MEENTS M J, WATANABE Y, SAMUELS A L. The cell biology of secondary cell wall biosynthesis [J]. Ann Bot, 2018, 121(6): 1107–1125. doi: 10.1093/aob/mcy005.

[13] SCHEIBLE W R, PAULY M. Glycosyltransferases and cell wall biosynthesis: Novel players and insights [J]. Curr Opin Plant Biol, 2004, 7(3): 285–295. doi: 10.1016/j.pbi.2004.03.006.

[14] LI X T, PANG Y X, YANG Q, et al. Analysis on the resources and current situation of exploitation and utilization of four southern herbal medicines [J]. Mod Chin Med, 2015, 17(2): 99–104. doi: 10.13313/j. issn.1673-4890.2015.2.003.

李小婷, 龐玉新, 楊全, 等. 四大南藥資源開發(fā)利用現(xiàn)狀分析[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2015, 17(2): 99–104. doi: 10.13313/j.issn.1673-4890. 2015.2.003.

[15] YU Z M, HE C M, TEIXEIRA DA SILVA J A, et al. The GDP- mannose transporter gene () fromis critical for mannan biosynthesis in plant growth and development [J]. Plant Sci, 2018, 277: 43–54. doi: 10.1016/j.plantsci.2018.07.021.

[16] YU Z M, YANG Z Y, TEIXEIRA DA SILVA J A, et al. Influence of low temperature on physiology and bioactivity of postharveststems [J]. Postharvt Biol Technol, 2019, 148: 97–106. doi: 10.1016/j.postharvbio.2018.10.014.

[17] ZHAO C H, YU Z M, HE C M, et al. Comparison of several total RNA extraction methods from flowers of[J]. J Trop Subtrop Bot, 2020, 28(5): 479–486. doi: 10.11926/jtsb.4202.

趙聰慧, 俞振明, 何春梅, 等. 鐵皮石斛花總RNA提取方法的比較研究 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2020, 28(5): 479–486. doi: 10. 11926/jtsb.4202.

[18] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402–408. doi: 10.1006/meth.2001.1262.

[19] WANG H X, HU Y M, JIA Q, et al. Evaluation of antioxidant and antiproliferation activities of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant [J]. Sci Technol Food Ind, 2021, 42(8): 307–312. doi: 10. 13386/ j.issn1002-0306.2020050135.

萬(wàn)紅霞, 胡玉玫, 賈強(qiáng), 等. 10種廣東藥食兩用植物的抗氧化和抗增殖活性評(píng)價(jià) [J]. 食品工業(yè)科技, 2021, 42(8): 307–312. doi: 10. 13386/j. issn1002-0306.2020050135.

[20] ZHANG Q, ZHENG Y L, HU X J, et al. Ethnopharmacological uses, phytochemistry, biological activities, and therapeutic applications ofMiquel: A review [J]. J Ethnopharmacol, 2018, 224: 149–168. doi: 10.1016/j.jep.2018.05.002.

[21] YAN X X, REN B L, WANG M Y, et al. Present situation and develop- ment strategy of[J]. China J Chin Mat Med, 2019, 44(9): 1960–1964. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20190301.006.

晏小霞, 任保蘭, 王茂媛, 等. 益智產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2019, 44(9): 1960–1964. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.2019 0301.006.

[22] NIU Q, LIU P H, CAO M, et al. Analysis and evaluation of nutritional components in different parts ofMiq. [J]. Food Res Dev, 2018, 39(17): 160–167. doi: 10.3969/j.issn.1005-6521.2018.17.029.

牛晴, 劉平懷, 曹猛, 等. 益智不同部位營(yíng)養(yǎng)成分與質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 食品研究與開發(fā), 2018, 39(17): 160–167. doi: 10.3969/j.issn.1005- 6521.2018.17.029.

[23] WU D L, JIN C S, MA K, et al. Quantitative determination of the poly- saccharide content in fructus[J]. Anhui Med Pharm J,2007, 11(3): 218–219. doi: 10.3969/j.issn.1009-6469.2007.03.015.

吳德玲, 金傳山, 馬凱, 等. 益智仁中多糖的含量測(cè)定 [J]. 安徽醫(yī)藥, 2007, 11(3): 218–219. doi: 10.3969/j.issn.1009-6469.2007.03.015.

[24] GAO B M, WEI N, WANG Y, et al. Present situation and analysis of comprehensive utilization of waste of[J]. Lishizhen Med Mat Med Res, 2015, 26(6): 1473–1475. doi: 10.3969/j.issn.1008- 0805.2015.06.079.

高炳淼, 魏娜, 王勇, 等. 南藥益智廢棄物綜合利用現(xiàn)狀與分析 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2015, 26(6): 1473–1475. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805. 2015.06.079.

[25] BIAN L, CHEN H G, ZHOU X. Recent advances in understanding the antitumor activity of polysaccharides from plants [J]. Food Sci, 2020, 41(7): 275–282. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20190330-392.

邊亮, 陳華國(guó), 周欣. 植物多糖的抗腫瘤活性研究進(jìn)展 [J]. 食品科學(xué), 2020, 41(7): 275–282. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20190330-392.

[26] ZHAO X S, DONG N, FENG J D, et al. Determination of polysac- charides content in[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2013, 30(10): 1070–1074. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2015.06.079.

趙祥升, 董娜, 馮錦東, 等. 益智多糖含量測(cè)定 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2013, 30(10): 1070–1074. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2015. 06.079.

[27] HAN Y, WU J, LIU Y S, et al. Therapeutic effect and mechanism of polysaccharide fromfructus on urinary incon- tinence [J]. Int J Biol Macromol, 2019, 128: 804–413. doi: 10.1016/j. ijbiomac.2019.01.193.

[28] ZHONG R Q, CUI D T, YE Z H. Secondary cell wall biosynthesis [J]. New Phytol, 2019, 221(4): 1703–1723. doi: 10.1111/nph.15537.

[29] TYAGI A, NIGAM D, AMITHA MITHRA S V, et al. Genome-wide discovery of tissue-specific miRNAs in clusterbean () indicates their association with galactomannan biosynthesis [J]. Plant Biotechnol J, 2018, 16(6): 1241–1257. doi: 10.1111/pbi.12866.

[30] DECKER D, ?BERG C, KLECZKOWSKI L A. Identification and characterization of inhibitors of UDP-glucose and UDP-sugar pyropho- sphorylases forstudies [J]. Plant J, 2017, 90(6):1093–1107. doi: 10.1111/tpj.13531.

[31] FAIK A, HELD M. Review: Plant cell wall biochemical omics: The high-throughput biochemistry for polysaccharide biosynthesis [J]. Plant Sci, 2019, 286: 49–56. doi: 10.1016/j.plantsci.2019.04.025.

Analysis of Polysaccharide Content and Biosynthesis Pathway in Different Tissues of

YU Zhenming, ZHAO Conghui, ZHANG Mingze, HE Chunmei, SI Can, ZENG Danqi, DUAN Jun*

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

To understand the key enzyme functions of polysaccharide biosynthesis pathway in, the polysaccharides contents in stems, leaves and fruits and monosaccharide composition were studied, and the expression pattern of key enzyme genes involved in the biosynthetic pathway of polysaccharide was analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results showed that the polysaccharides contents in different tissues was in the order of fruit>leaf>stem. The polysaccharide was consist of glucose, xylose, mannose, galactose and arabinose. A total of 47 690 unigenes were obtained fromtranscriptome database, of which 31 892 were annotated in NR, Swiss-Prot, KEGG, COG, KOG, GO and Pfam databases. Among them, 208 of unigenes encoding 18 enzymes were involved in the biosynthesis ofpolysaccharide. Furthermore, all of 18 selected unigenes were expressed in stems, leaves and fruits, of which 14 unigenes showed the highest expression in fruit.Interestingly, two genes, encoding glycosyltransferase and UDP glucose pyrophosphorylase, exhibited the highest expression, and their expressions were consistent with the glucose content in different tissues of.

; Polysaccharide; Transcriptome; Glycosyltransferase

10.11926/jtsb.4374

2021-01-04

2021-03-04

廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃(2020B020221001); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32000257)資助

This work was supported by the Project for Key Research and Development in Guangdong (Grant No. 2020B020221001), and the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32000257).

俞振明(1988～ )，男，博士，主要從事藥用植物次生代謝調(diào)控研究。E-mail: zhenming311@scbg.ac.cn

通信作者 Corresponding author. E-mail:duanj@scib.ac.cn