東鄉(xiāng)野生稻苗期響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

白李唯丹, 戴亮芳, 陳雅玲, 張帆濤, 謝建坤, 羅向東

東鄉(xiāng)野生稻苗期響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

白李唯丹, 戴亮芳, 陳雅玲, 張帆濤, 謝建坤, 羅向東*

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022)

為了解東鄉(xiāng)野生稻()對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)苗期的RNA-seq轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,與對(duì)照相比，共檢測(cè)到10 200個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中5 201個(gè)上調(diào)表達(dá)，4 999個(gè)下調(diào)表達(dá)，其中有426個(gè)DEGs位于已報(bào)道的水稻耐冷QTL區(qū)間，且37個(gè)為耐冷調(diào)控相關(guān)的家族基因。GO功能分類和KEGG代謝路徑分析表明，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、氨基酸生物合成以及光合作用代謝等均參與響應(yīng)低溫脅迫過程。實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，ABA響應(yīng)蛋白基因、MYB轉(zhuǎn)錄因子和40S核糖體蛋白SA基因等12個(gè)可能與低溫脅迫響應(yīng)相關(guān)的DEGs表達(dá)模式與RNA-seq的一致?？梢?，植物激素傳導(dǎo)途徑和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)調(diào)控基因在東鄉(xiāng)野生稻苗期響應(yīng)低溫脅迫過程中起重要作用。

東鄉(xiāng)野生稻；低溫脅迫；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；耐冷基因

水稻()是最重要的糧食作物，其產(chǎn)量約占世界糧食總產(chǎn)量的1/3[1]。然而，隨著全球氣候變暖，極端天氣發(fā)生日趨頻繁，低溫冷害已成為限制水稻安全生產(chǎn)的主要因子[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有1.50×107hm2的水稻在不同生長(zhǎng)時(shí)期遭受寒害或冷害，輕者導(dǎo)致秧苗黃化，生長(zhǎng)遲鈍；重者出現(xiàn)爛秧、爛芽或死苗，甚至顆粒無(wú)收[3]。我國(guó)每年因低溫冷害導(dǎo)致水稻減產(chǎn)5.0×109～1.00× 1010kg[2]。因此，研究水稻耐冷機(jī)制，挖掘水稻遺傳潛能，培育水稻耐冷新品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。

東鄉(xiāng)野生稻()是全球分布最北的普通野生稻，蘊(yùn)藏著強(qiáng)耐冷、抗旱和高產(chǎn)等優(yōu)異基因。強(qiáng)耐冷性是其最顯著的特點(diǎn)，苗期和抽穗期的耐冷性均強(qiáng)于粳稻，地下莖能耐受–12.8℃而安全越冬[4–5]。因此研究和利用東鄉(xiāng)野生稻的強(qiáng)耐冷性受到廣泛關(guān)注。前人在東鄉(xiāng)野生稻的耐冷性鑒定評(píng)價(jià)、數(shù)量性狀基因位點(diǎn)(quantitative trait locus, QTL)分析和差異表達(dá)譜等方面已做了大量工作[5–7]，然而，東鄉(xiāng)野生稻的耐冷性遺傳機(jī)理非常復(fù)雜，不同研究群體和不同鑒定方法所檢測(cè)的耐冷QTL數(shù)目、染色體區(qū)域和效應(yīng)大小有較大差異，可比性較低，東鄉(xiāng)野生稻耐冷的分子調(diào)控機(jī)制仍然難以琢磨[8–9]。因此，進(jìn)一步全面深入探討東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因的調(diào)控網(wǎng)路及分子機(jī)制，具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是生物體很重要的一種調(diào)控方式，與基因組學(xué)相比具有針對(duì)性強(qiáng)、研究范圍小的優(yōu)點(diǎn)且被認(rèn)為是一種在轉(zhuǎn)錄水平上更精準(zhǔn)的分析方法，鑒于此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[10],利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)分析其東鄉(xiāng)野生稻低溫脅迫下和常溫培養(yǎng)條件下的基因表達(dá)譜特征，獲取差異表達(dá)基因信息數(shù)據(jù)。采用qRT-PCR方法分析、驗(yàn)證差異表達(dá)基因的表達(dá)特性。將轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)與報(bào)道的水稻耐冷相關(guān)的QTL結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，為挖掘東鄉(xiāng)野生稻耐冷相關(guān)基因、闡明東鄉(xiāng)野生稻響應(yīng)低溫脅迫的應(yīng)答機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為中國(guó)江西省東鄉(xiāng)縣的東鄉(xiāng)野生稻()。將種子置于50℃烘箱中干燥3 d，挑選50粒成熟飽滿的種子用3% NaClO消毒15 min,清洗3遍，于28℃浸種3 d催芽，將露白種子均勻播種于墊有濾紙的90 mm×10 mm培養(yǎng)皿中，待胚芽長(zhǎng)至8～12 mm后置于28℃、44.9mol/(m2·s)、光照14 h/d的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入MS營(yíng)養(yǎng)液, 每隔5 d更換1次。待苗長(zhǎng)至3葉1心，除去弱苗，記錄每皿中成苗數(shù)。將幼苗分成兩組，一組為對(duì)照(DY1、DY2和DY3)置于28℃下正常培養(yǎng)；另一組為處理組(DYL1、DYL2和DYL3)置于8℃冷脅迫處理72 h，每組均3次生物學(xué)重復(fù)。處理結(jié)束后,取葉片于液氮中凍存，置于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建 采用Thermo Fisher Scientific公司的Trizol試劑盒，參照Qiao等[9]的方法提取東鄉(xiāng)野生稻幼苗的RNA，用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性和純凈度，委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成RNA的質(zhì)控，建庫(kù)合格后上機(jī)(Illumina HiSeq)進(jìn)行測(cè)序工作。

測(cè)序數(shù)據(jù)分析 測(cè)序片段經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為Fastq格式序列數(shù)據(jù)(Reads)，其中包含測(cè)序片段的序列信息和其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除接頭、含N、低質(zhì)量Reads后得到Clean reads，然后計(jì)算Q20、Q30和GC含量。從基因組網(wǎng)站下載基因模型注釋文件和參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)，構(gòu)建參考基因組的索引，將Clean reads與參照基因組比對(duì)。采用String Tie拼接出轉(zhuǎn)錄本后，利用Feature Counts計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù)，然后根據(jù)基因的長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM和映射到該基因的讀數(shù)，利用DESeq2分析兩組處理間的差異表達(dá)。本試驗(yàn)以<0.05以及|log2FoldChange|>1作為差異表達(dá)基因的篩選閾值。通過clusterProfiler R軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集。

差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證 參照Luo等[11]的方法，用Trizol試劑提取RNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒First-Strand Synthesis of cDNA Kit (普洛麥格生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，根據(jù)CDS (編碼序列)設(shè)計(jì)后續(xù)qRT-PCR的特異引物，所有引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(附表)，按照SYBR Premix ExII (2×)(TaKaRa北京生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書，在熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scien- tific公司)檢測(cè)12個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)情況, 以作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系總體積為20L，其中聚合酶10L, 上、下游引物各0.4L，模板2L，滅菌水7.2L，每個(gè)樣品均3次重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，然后95℃ 30 s，65℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，相對(duì)表達(dá)量以2–ΔΔCT計(jì)算。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和質(zhì)控分析

對(duì)東鄉(xiāng)野生稻幼苗提取RNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 獲得樣品原始數(shù)據(jù)序列Reads；舍棄低質(zhì)量數(shù)據(jù), 經(jīng)序列拼接，最后獲得Clean reads為47 041 126～51 358 394，占總數(shù)的93%～97%，錯(cuò)誤率僅為0.03, Q20均高于95%，Q30均高于89%，GC含量約為52% (表1)，表明東鄉(xiāng)野生稻幼苗葉片的轉(zhuǎn)錄測(cè)序質(zhì)量良好。

2.2 差異表達(dá)基因的表達(dá)譜分析

低溫脅迫下對(duì)低溫敏感的基因會(huì)發(fā)生表達(dá)變化，表達(dá)差異程度可以反映其在低溫脅迫過程中的活躍度。對(duì)差異表達(dá)基因(differentially expressedgene, DEG)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明(圖1)，與DY相比，DYL中<0.05、相對(duì)表達(dá)水平絕對(duì)值|log2FoldChange|>1，即表達(dá)差異|log2FC|大于2倍的DEGs有10 200個(gè)，上調(diào)表達(dá)的有5 201個(gè)，占50.99%，下調(diào)表達(dá)的有4 999個(gè)，占49.01%。這些基因表達(dá)差異幅度較大, |log2FC|主要集中在10以內(nèi)，占比90.18%; |log2FC|>10的DEGs有24個(gè),其中21個(gè)上調(diào)表達(dá), 3個(gè)下調(diào)表達(dá), 分布在1號(hào)染色體上的有2個(gè)，3號(hào)染色體有6個(gè)，4號(hào)染色體有2個(gè)，5號(hào)染色體有4個(gè)，11號(hào)染色體有5個(gè), 第2、6、8、10、12號(hào)染色體各1個(gè)。從表2可以看出，表達(dá)上調(diào)的基因主要與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(脫落酸ABA、乙烯ETH、漆酶LAC)、膜蛋白等相關(guān)，下調(diào)的基因與乙醛脫氫、甲基轉(zhuǎn)移、稻谷粒長(zhǎng)相關(guān)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)

圖1 基因表達(dá)火山圖

2.3 差異表達(dá)基因與耐冷QTL區(qū)間的聯(lián)合分析

為進(jìn)一步分析與耐冷相關(guān)的差異基因，將|log2FC|>1的DEGs與已知耐冷QTL進(jìn)行聯(lián)合匹配分析，結(jié)果表明，共有426個(gè)DEGs可以map到2個(gè)以上研究者報(bào)道的QTL區(qū)間，其中1號(hào)染色體上有61個(gè)，3號(hào)染色體有36個(gè)，4號(hào)染色體有50個(gè)，5號(hào)染色體有156個(gè)，6號(hào)染色體有21個(gè), 7號(hào)染色體有69個(gè)，8號(hào)染色體有33個(gè)。

研究表明WRKY、AP2/ERF、MYB、bZIP、HSF等家族基因在調(diào)控水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和耐逆性中起著重要作用[12–15]。本研究結(jié)果表明，位于耐冷QTL區(qū)間內(nèi)的426個(gè)DEGs中，有37個(gè)為耐冷調(diào)控相關(guān)的家族基因(表3)。在經(jīng)過低溫脅迫后, WRKY、AP2/ERF、PP2C、bZIP、HSP70、HSF家族基因和低溫調(diào)節(jié)蛋白基因的DEGs都上調(diào)表達(dá), 而ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因則下調(diào)表達(dá)，其余家族基因均有上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因(表3)；還有89個(gè)包括AOX、petidase-S8、p450等與植物耐逆性相關(guān)的其他家族基因。此外，還檢測(cè)到1個(gè)|log2FC|>10且功能尚未報(bào)道的DEG (Os04g0121800)。

表2 |log2FC|>10的顯著差異表達(dá)基因

2.4 差異表達(dá)基因GO功能分類分析

GO分析表明(表4)，|log2FC|>1的DEGs富集到896條GO注釋中，其中生物過程(biological process, BP)占48.19%，細(xì)胞組分(cellular component, CC)占12.72%,分子功能(molecular function, MF)占39.07%,說(shuō)明大多數(shù)差異表達(dá)基因與一些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。BP中主要富集在有機(jī)氮化合物生物合成過程(GO: 1901566，251個(gè))、碳水化合物代謝過程(GO: 0005975, 217個(gè))、小分子代謝過程(GO: 0044281, 194個(gè))和細(xì)胞酰胺代謝過程(GO: 0043603, 188個(gè))等4個(gè)方面；在CC中主要富集在細(xì)胞質(zhì)(GO: 0005737, 272個(gè))、胞質(zhì)部分(GO: 0044444, 228個(gè))和無(wú)膜細(xì)胞器(GO: 0043228, 168個(gè))等3個(gè)方面; 在MF中主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)(GO: 0022857, 197個(gè))、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(GO: 0001071, 190個(gè))等2個(gè)方面。這表明在低溫脅迫下，東鄉(xiāng)野生稻進(jìn)行著十分復(fù)雜的新陳代謝，涉及有機(jī)氮化合物生物合成、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)部分和碳水化合物代謝等生物學(xué)功能方面的基因較為活躍。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG代謝路徑分析

為探索低溫脅迫下東鄉(xiāng)野生稻代謝途徑的變化，揭示DEGs的生物學(xué)功能，對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG 代謝途徑富集分析表明(圖3)，DEGs共富集到113條信號(hào)通路上，主要富集在核糖體(ribosome, dosa 03010)、真核生物的核糖體生物發(fā)生(ribosome bio- genesis in eukaryotes, dosa03008)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids, dosa01230)、光合作用(photosynthesis, dosa00195)等通路上, 其中核糖體通路富集的DEGs最多。前3條通路都與蛋白質(zhì)的合成相關(guān)，且大部分DEGs都上調(diào)。核糖體通路中167個(gè)DEGs上調(diào)；真核生物中核糖體生物發(fā)生通路中有58個(gè)DEGs上調(diào)；氨基酸的生物合成通路中有78個(gè)DEGs上調(diào)。這表明低溫脅迫下, 東鄉(xiāng)野生稻蛋白質(zhì)的合成大幅提高，在響應(yīng)低溫時(shí)可能發(fā)揮著重要作用。

表3 耐冷QTL區(qū)間內(nèi)的家族基因

2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為了挖掘與驗(yàn)證東鄉(xiāng)野生稻響應(yīng)低溫脅迫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因，本文隨機(jī)選取了包括ABA響應(yīng)蛋白基因、MYB轉(zhuǎn)錄因子和40S核糖體蛋白基因等可能參與響應(yīng)低溫脅迫的12個(gè)DEGs，對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖4)，絕大部分基因的qRT-PCR表達(dá)水平表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)錄組RNA- Seq相同的變化趨勢(shì)，其中9個(gè)DEGs的qRT-PCR和RNA-Seq表達(dá)水平為上調(diào)，分別是Os01g0951200 (尿苷-磷酸合成酶基因)、Os04g0497000 (NADPH氧化還原酶基因)Os07g0616600 (40S核糖體蛋白基因)、Os12g0478200 (ABA響應(yīng)蛋白基因)、Os06g 0714500(假定spastin蛋白基因)、Os12g0145700 (丙酮酸激酶基因)、Os01g0783500 (結(jié)構(gòu)域蛋白基因)、Os12g0147800 (植物磺肽激素基因)和Os12g0564100(MYB轉(zhuǎn)錄因子)。有3個(gè)DEGs的qRT-PCR和RNA- Seq表達(dá)水平都下調(diào)，分別是Os03g0843800 (硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因)、Os07g0619400 (結(jié)構(gòu)域蛋白基因)和Os11g0147800 (特異性莖蛋白基因)。從圖5可見，DEGs的qRT-PCR和RNA-Seq表達(dá)差異倍數(shù)不同但表達(dá)趨勢(shì)相同，這表明qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。這些基因在低溫脅迫下發(fā)生表達(dá)變化, 預(yù)示其在東鄉(xiāng)野生稻耐低溫脅迫中可能發(fā)揮著重要作用。

表4 差異表達(dá)基因的GO注釋

3 結(jié)論和討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠全面且高效分析植物組織或細(xì)胞在物種、品種、發(fā)育階段和環(huán)境下，全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的類別、結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平的變化，揭示特定生物學(xué)過程的分子調(diào)控機(jī)制[15]。目前植物的耐冷研究中，許多研究者利用該技術(shù)鑒定并成功揭示了包括擬南芥()、水稻、小麥()等幾十種重要作物的耐冷關(guān)鍵基因和復(fù)雜的低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制[18]，為作物的分子育種奠定了重要基礎(chǔ)。

本研究采用RNA-seq技術(shù)對(duì)東鄉(xiāng)野生稻苗期葉片在常溫與低溫誘導(dǎo)下的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較了兩者完整的差異基因表達(dá)譜。結(jié)果表明，與常溫相比，東鄉(xiāng)野生稻苗期葉片經(jīng)低溫誘導(dǎo)后，上調(diào)表達(dá)的DEGs有5 201個(gè)，比下調(diào)表達(dá)的多1.98%; GO功能分類和KEGG Pathway通路分析表明，DEGs主要富集在核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、氨基酸的生物合成和光合作用等代謝過程中，這表明東鄉(xiāng)野生稻在面臨低溫時(shí)植物體內(nèi)時(shí)刻發(fā)生著復(fù)雜的新陳代謝變化，通過改變次級(jí)代謝物合成、環(huán)境應(yīng)激來(lái)響應(yīng)低溫脅迫，這與前人[19–21]對(duì)水稻苗期耐冷品種的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果類似。

圖2 DEGs的KEGG通路富集散點(diǎn)圖

圖3 部分DEGs的RNA-Seq和qRT-PCR的表達(dá)模式比較

圖4 DEGs基因的RNA-Seq和qRT-PCR表達(dá)相關(guān)性

眾多研究表明，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(生長(zhǎng)素IAA、脫落酸ABA、乙烯ETH等激素)對(duì)水稻苗期低溫耐受性調(diào)控起重要作用[22–23]。很多研究表明, IAA反應(yīng)因子(ARF)、ABA激活蛋白激酶、ETH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在水稻中過度表達(dá)可以提高低溫耐受力[24–25]。低溫脅迫下，水稻內(nèi)源ABA升高，其受體PYP/PYL/RCAR蛋白與ABA結(jié)合并與蛋白激酶PP2C互作，抑制蛋白激酶SnRK2與PP2C結(jié)合, SnRK2便能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化后的轉(zhuǎn)錄因子激活A(yù)BA響應(yīng)基因，進(jìn)而提高對(duì)低溫的耐受性[26]。本研究檢測(cè)到了3個(gè)ETH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(AP2/ERF家族基因)以及16個(gè)與ABA相關(guān)的基因(蛋白激酶Pkinase家族基因11個(gè)、蛋白磷酸酶PP2C家族基因4個(gè)上調(diào)表達(dá)、ABA響應(yīng)蛋白1個(gè))和1個(gè)IAA反應(yīng)因子(ARF家族基因Os06g0702600)，這些基因位于前人耐冷QTL區(qū)間內(nèi)，并且在遭受低溫脅迫后大量誘導(dǎo)表達(dá)，促使體內(nèi)生理生化發(fā)生改變，幫助水稻抵抗寒冷，除此之外，我們還檢測(cè)到2個(gè)ETH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(ERF1和OsERF09), 前人也有研究報(bào)道。ABA響應(yīng)蛋白(Os12g0478200)在qRT- PCR驗(yàn)證后表明，qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA-seq的表達(dá)水平一致，暗示著這些植物激素信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)基因可能在東鄉(xiāng)野生稻響應(yīng)低溫脅迫的過程中發(fā)揮著重要的作用。

有研究也表明，轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)的調(diào)控基因?qū)χ参锏哪秃灾陵P(guān)重要，它可以調(diào)控酶、蛋白和代謝物[27–30]。目前已有8類轉(zhuǎn)錄因子家族(鋅指b- ZIP、MYB、AP2/ERF、BHLH、NAC、Bzip、WRKY和HSF)的轉(zhuǎn)錄因子基因被識(shí)別，低溫誘導(dǎo)的最大轉(zhuǎn)錄因子家族組屬于鋅指家族[12–15]。鋅指蛋白基因表達(dá)增強(qiáng)可提高作物對(duì)低溫的耐受能力[31–32]，水稻鋅指蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草均可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株耐受低溫脅迫的能力[33]，許多WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子影響著水稻的低溫耐受性，過表達(dá)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因水稻株系對(duì)冷脅迫的抗性顯著增強(qiáng)[34–35],MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的低溫響應(yīng)調(diào)控過程, 但是，不同的MYB成員所起的作用并不相同。本研究檢測(cè)到1個(gè)b-ZIP、5個(gè)MYB_DNA-binding、3個(gè)WRKY和1個(gè)HSF家族基因及3個(gè)鋅指蛋白基因，且這些基因都位于耐冷QTL區(qū)間內(nèi)，此外，還檢測(cè)到5個(gè)b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子和16個(gè)WRKY家族基因, 也與前人研究結(jié)果一致。這些轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的調(diào)控基因不僅位于耐冷QTL區(qū)間內(nèi)而且屬于耐冷調(diào)控相關(guān)的家族，極有可能參與了應(yīng)答低溫脅迫的信號(hào)刺激。qRT-PCR驗(yàn)證表明MYB轉(zhuǎn)錄因子(Os01g0867300)在冷脅迫后上調(diào)表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。這表明轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的調(diào)控基因極有可能參與了應(yīng)答低溫環(huán)境的信號(hào)刺激,被誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而提高水稻的抗逆能力。

水稻在遇到低溫脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生一系列生理生化和分子機(jī)制的變化，以響應(yīng)、適應(yīng)環(huán)境溫度的變化，來(lái)增強(qiáng)自身的耐冷性，維持并穩(wěn)定生長(zhǎng)。本研究以水稻耐冷品種東鄉(xiāng)野生稻為材料，對(duì)低溫脅迫下葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，獲得了較為完善的轉(zhuǎn)錄本信息。GO和KEGG分析表明，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、氨基酸生物合成和光合作用代謝等均參與響應(yīng)低溫脅迫過程。同時(shí)，也檢測(cè)到植物激素信號(hào)傳導(dǎo)基因和轉(zhuǎn)錄因子。此外，ABA響應(yīng)蛋白和MYB轉(zhuǎn)錄因子的qRT-PCR表達(dá)譜和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的表達(dá)變化一致，是否可以推測(cè)在東鄉(xiāng)野生稻苗期遭受低溫信號(hào)刺激時(shí)，植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)調(diào)控基因被上調(diào)誘導(dǎo)表達(dá)，從而提高了東鄉(xiāng)野生稻的抗寒能力，在其響應(yīng)低溫脅迫的過程中起著關(guān)鍵作用。

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Transcriptome Analysis of Response to Low Temperature Stress in Dongxiang Wild Rice at Seedling Stage

BAI Liweidan, DAI Liangfang, CHEN Yaling, ZHANG Fantao, XIE Jiankun, LUO Xiangdong*

(College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

In order to study the response mechanism of Dongxiang wild rice () to low temperature stress, its RNA-Seq transcriptional expression profile at seedling stage was studied. The results showed that a total of 10 200 differentially expressed genes (DEGs) under low temperature stress were detected compared with control under normal temperature, among which 5 201 DEGs were up-regulated and 4 999 were down-regulated. There were 426 DEGs located in the reported QTL interval of cold tolerance in rice, and 37 of them were family genes related to cold tolerance regulation. Go functional classification and KEGG metabolic pathway analysis of DEGs indicated that nucleic acid binding transcription factor activity, amino acid biosynthesis and photosynthetic metabolism were involved in the response to low temperature stress. The expression patterns of 12 DEGs, including ABA response protein gene, MYB transcription factor and 40S ribosomal protein SA gene, might be related to low temperature stress response by real-time fluorescence quantitative PCR analysis were consistent with those of RNA-Seq. So, it was suggested that plant hormone transduction pathways and transcription factor-related regulatory genes could play an important role in response to low temperature stress in Dongxiang wild rice seedling stage.

Dongxiang wild rice; Low temperature stress; Transcriptome; Cold tolerance gene

10.11926/jtsb.4387

2021-01-22

2021-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660384,32060074)；江西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20202ACB205001)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(20204BCJ22024)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31660384, 32060074), the Key Project of Natural Science of Jiangxi (Grant No. 20202ACB205001), and the Project for Major Academic and Technical Leader Training of Jiangxi (Grant No. 20204BCJ22024).

白李唯丹(1995～ )，女，碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: bailiweidan@163.com

通信作者Corresponding author. E-mail: xdluolf@163.com