虎威通痹湯對佐劑關節(jié)炎大鼠IL-23/IL-17炎癥軸的影響

袁 慧，吳 茜，楚 曼，徐軍建，白艷榮

(陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712021)

類風濕性關節(jié)炎 (Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性關節(jié)炎為特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病與機體獲得性免疫反應失衡及多種炎癥因子大量釋放有關[1]。大量研究表明，IL-23/IL-17炎癥軸在RA的發(fā)病過程中起重要作用，白介素-23(Interleukin-23，IL-23)作用于Th17細胞，刺激其釋放白介素-17(Interleukin-17，IL-17)， IL-17 募集并激活中性粒細胞，促使 T 細胞活化，并刺激成纖維細胞、巨噬細胞和上皮細胞，促進白細胞介素-6(Interleukin，IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促炎癥因子的分泌，從而誘發(fā)局部炎癥，且IL-17、TNF-α、IL-6共同參與骨和軟骨的降解過程[2-3]?；⑼ū詼店兾髦嗅t(yī)藥大學附屬醫(yī)院風濕免疫血液科徐軍建教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結、創(chuàng)立的院內(nèi)制劑，在臨床治療RA方面療效較好、不良反應少，且患者依從性好，但其具體作用機制尚不明確。本研究建立大鼠佐劑性關節(jié)炎模型，以足跖腫脹程度、關節(jié)組織病理學形態(tài)、血清IL-23、IL-17、IL-6及TNF-α為觀察指標，初步探討虎威通痹湯對佐劑關節(jié)炎大鼠IL-23/IL-17炎癥軸的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性健康SD大鼠40只，平均體重(120±20)g，由西安交通大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為SCXK(陜)2018-001。

1.1.2 主要試劑與儀器：甲氨蝶呤片(國藥準字H22022674)；0.9%氯化鈉溶液(國藥準字H20044024)；IL-17ELISA試劑盒(批號H30018353，武漢華美生物工程有限公司)；IL-23ELISA試劑盒(批號I11018354，武漢華美生物工程有限公司)；TNF-α、IL-6ELISA試劑盒 (批號p001643、p001867，美國eBioscience公司)；完全弗氏佐劑(批號SLBW7430，美國Sigma公司)；蘇木素-伊紅(HE) 染色試劑(批號2017010301、2017040601，北京雷根生物技術有限公司)；高效液相色譜儀(Prominence型，日本島津公司)；足趾容積測量儀(PV200型，成都泰盟科技有限公司)；高速離心機(ZX6006型，法國Jouan公司)；超薄切片機(EMUC7型，德國徠卡公司)；光學顯微鏡(XSP-C204型，武漢光電儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 虎威通痹湯：由薏苡仁20 g，青風藤、龍須藤、忍冬藤、防己、土茯苓、萆薢、桑枝、川牛膝各15 g，山梔子、連翹、威靈仙、虎杖、防風、莪術各10 g，甘草6 g組成。以上中藥由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.2.2 建模、分組與給藥：將40只SPF級雄性健康SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、虎威通痹湯組、甲氨蝶呤組，每組10只。除對照組10只外，其余三組大鼠均予右后足墊一次性皮內(nèi)注射0.1 ml完全弗氏佐劑誘導類風濕關節(jié)炎大鼠模型[4-5]。造模14 d后開始給藥，根據(jù)動物體重計算給藥劑量[6]。甲氨蝶呤組大鼠予1 mg/kg的甲氨蝶呤灌胃，1次/周；虎威通痹湯組大鼠予16 g/kg(折合生藥)的虎威通痹湯灌胃，1次/d；對照組、模型組大鼠于每日同時間給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠足跖腫脹度：采用容積法測量并記錄各組大鼠造模前后及給藥后1、7、14、21、28 d的足容積，并計算足跖腫脹度，腫脹度為治療前后足跖容積的差值。

1.3.2 HE染色：末次給藥后次日麻醉并處死大鼠，取左后肢膝關節(jié)滑膜組織于10%甲醛溶液中固定，將固定好的滑膜組織放入石蠟包埋盒中，標注時間及組別，95%乙醇脫水過夜，切片進行HE染色，通過光學顯微鏡觀察關節(jié)滑膜組織病理學形態(tài)。

1.3.3 血清IL-6、TNF-α、IL-23、IL-17水平：末次給藥后次日麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置，3000 r/min,離心15 min，分離血清，采用ELISA法測定各組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-23、IL-17水平，所有步驟均按照試劑盒說明書規(guī)范操作。

2 結 果

2.1 各組大鼠足跖腫脹度比較 見表1。與對照組比較，造模后模型組大鼠足跖腫脹度高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，甲氨蝶呤組大鼠足跖腫脹度給藥后14 d降低，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度給藥后21 d降低，給藥后28 d足趾腫脹度最低。給藥后28 d，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度低于甲氨蝶呤組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠足跖腫脹度比較(mm)

2.2 各組大鼠滑膜組織HE染色 對照組大鼠滑膜組織相對完整，炎癥細胞浸潤不明顯；模型組大鼠滑膜組織水腫、增生，可見較多炎性細胞浸潤；虎威通痹湯組、甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織受損情況及炎性細胞浸潤情況均較模型組改善，且虎威通痹湯組優(yōu)于甲氨蝶呤組(圖1)。

圖1 各組大鼠滑膜組織病理學形態(tài)(HE染色，×10)

2.3 各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α表達比較 見表2。與對照組比較，模型組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α水平均高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與模型組比較，虎威通痹湯、甲氨蝶呤組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α均低，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與甲氨蝶呤組比較，虎威通痹湯組大鼠血清IL-23、IL-6均低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α表達比較

3 討 論

RA是臨床常見的致殘性疾病，且易合并腦卒中、心肌梗死、肺間質(zhì)纖維化等疾病，給患者家庭和社會帶來嚴重負擔[7-8]。雖然現(xiàn)代醫(yī)學可通過生物制劑、物理治療等手段穩(wěn)定RA患者病情，但僅延緩病情進展，且治療成本較高，不良反應較多，因此尋找價廉效優(yōu)的治療方案有重要意義。

虎威通痹湯在臨床上多用于關節(jié)炎患者伴肌肉或關節(jié)紅腫熱痛、有沉重感、步履艱難等病癥的治療。本方立足于“風寒濕雜至，合而為痹”的基本理論，選用虎杖、威靈仙共為君藥，虎杖活血散瘀止痛，威靈仙辛散溫通，性猛善走，通行十二經(jīng)，既能袪風濕，又能通絡止痛，為治風濕痹痛要藥，兩藥相合，共成祛風除濕、活血散瘀止痛之功[9]?！侗静菥V目》云：“藤類藥物以其輕靈,易通利關節(jié)而達四肢”。中醫(yī)學認為藤類條達，可舒筋活絡，故方中以青風藤、龍須藤、忍冬藤為臣，起疏利關節(jié)之功，正如《本草便讀》云：“凡藤蔓之屬，皆可通經(jīng)入絡。此物善治風疾，故一切歷節(jié)麻痹皆治之”[10]。風為百病之長，佐以防風、桑枝疏風解表，加強威靈仙之功。久病多瘀，佐以牛膝、莪術以逐瘀通經(jīng)，加強虎杖散瘀定痛之功。濕熱為發(fā)病之根本，佐以土茯苓、萆薢、薏苡仁、防己利水滲濕、除痹散結；連翹、山梔子清熱散結止痛。甘草為中州之藥，能補能和為使，使?jié)袢ザ敛粋?，致于和平也。全方共奏祛風、清熱、除濕，活血定痛之功。

IL-23/IL-17炎癥軸在多種自身免疫性疾病中起著關鍵作用。有研究表明，IL-6、IL-17的高表達與RA并發(fā)動脈粥樣硬化密切相關，是RA合并腦卒中、心肌梗死等的危險因素[11]。動物研究證實，阻斷了IL-23/IL-17炎癥通路，可減輕RA的滑膜炎癥，且大量研究表明IL-17、TNF-α在滑膜炎、骨侵蝕發(fā)揮重要作用，IL-6、TNF-α與RA活動程度呈正相關[12-14]。

大鼠佐劑關節(jié)炎模型是典型的免疫性炎癥模型，是目前最經(jīng)典、應用最廣泛的RA模型建立方法。故本實驗選擇大鼠為實驗對象，建立大鼠佐劑關節(jié)炎模型，建模后，模型組大鼠足跖腫脹度高于對照組，HE染色可見大鼠滑膜組織水腫、增生，提示造模成功。與模型組比較，甲氨蝶呤組大鼠足跖腫脹度給藥后14 d降低，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度給藥后21 d降低，給藥后28 d顯著降低。給藥后28 d，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度低于甲氨蝶呤組?；⑼ū詼M和甲氨蝶呤組病理結果均提示：滑膜組織受損情況以及炎癥細胞浸潤情況較模型組明顯改善，說明虎威通痹湯對RA大鼠關節(jié)炎有一定的治療作用，且呈時間依賴性，其療效可能與虎威通痹湯中虎杖[15]、威靈仙[16-17]、土茯苓[18]、連翹[19]等抗炎、鎮(zhèn)痛作用相關。本研究結果表明，虎威通痹湯可降低大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α的表達水平，提示虎威通痹湯治療RA的機制可能與下調(diào)細胞因子IL-6、IL-23、 TNF-α、IL-17分泌有關。與甲氨蝶呤組比較，虎威通痹湯血清IL-23、IL-6水平降低，提示虎威通痹湯可能通過抑制IL-23/IL-17炎癥軸發(fā)揮治療作用。

綜上所述，虎威通痹湯可改善類風濕關節(jié)炎大鼠足跖腫脹程度，減輕滑膜增生，其作用機制可能與抑制IL-23/IL-17炎癥通路有關。本研究結果未進行細胞、分子水平相關驗證，有待今后進一步深入研究。