DBD低溫等離子體處理對(duì)多酚氧化酶活力及構(gòu)象的影響

成軍虎 汪慧芬 韓永旭

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.華南理工大學(xué) 現(xiàn)代食品工程研究中心，廣東 廣州 510006)

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)是酶促褐變中的一種主要內(nèi)源性酶，廣泛分布在微生物、動(dòng)物和植物體中，其活性位點(diǎn)包含雙核銅原子，其中一個(gè)銅原子與組氨酸相連，另一個(gè)銅原子與半胱氨酸相連。在植物體中，一般認(rèn)為PPO位于葉綠體中，能促進(jìn)光合作用，降解木質(zhì)素和促進(jìn)褐變反應(yīng)。褐變反應(yīng)發(fā)生在氧氣存在的條件下，PPO催化單酚發(fā)生羥基化反應(yīng)生成鄰苯二酚，鄰苯二酚被進(jìn)一步催化氧化生成鄰苯二醌，產(chǎn)物進(jìn)一步聚合成黑色或者褐色的物質(zhì)[1]。PPO催化的酶促褐變是新鮮果蔬及其制品品質(zhì)劣變的主要原因。這種褐變會(huì)引起果蔬色澤、風(fēng)味等感官品質(zhì)的劣變，同時(shí)降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，最終影響消費(fèi)者的購(gòu)買欲望，是果蔬加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中的一個(gè)難題[2]。開展降低PPO酶活的研究顯得尤為重要[3]。

目前控制PPO酶活的方式主要有物理和化學(xué)方法?；瘜W(xué)方法主要是指通過(guò)添加還原劑、螯合劑等抑制PPO的酶活，但有些化學(xué)試劑對(duì)人體健康有一定的影響且提取步驟復(fù)雜，因此目前更多的研究轉(zhuǎn)向了采用天然產(chǎn)物來(lái)對(duì)PPO的酶活進(jìn)行抑制。物理方法包括熱燙、超高壓、脈沖電場(chǎng)及超聲波處理等。熱燙會(huì)破壞蘋果汁中的熱敏性物質(zhì)如維生素C和黃酮等；超高壓處理在不同的參數(shù)設(shè)置和樣品條件下會(huì)呈現(xiàn)不同的效果；脈沖電場(chǎng)通常需要與熱處理結(jié)合才能達(dá)到理想的鈍酶效果；超聲波需要結(jié)合其他處理方式效果才更佳。而低溫等離子體作一種新型的非熱加工技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，由于其可以產(chǎn)生豐富的活性物質(zhì)，呈高氧化態(tài)，因此主要應(yīng)用于殺菌、降解食品表面污染物和生物大分子改性等方面，在果蔬加工及延長(zhǎng)貨架期等方面也具有很好的應(yīng)用前景。介質(zhì)阻擋放電(Dielectric Barrier Discharge，DBD)是等離子體的一種發(fā)生方式，由介電材料(如聚丙烯、玻璃和石英)覆蓋在一個(gè)或兩個(gè)金屬電極(如銅、鋁和黃銅)上，通過(guò)外部供給能源使電極間的氣體電離形成。相較于其余放電形式(輝光、脈沖、電暈等)，DBD形式的等離子體技術(shù)可在常溫、大氣壓下進(jìn)行操作，放電安全性高，處理范圍廣，操作溫度低，設(shè)備靈活性強(qiáng)，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。高振紅等[4]發(fā)現(xiàn)，等離子體對(duì)鮮榨獼猴桃汁中氯吡脲的降解率達(dá)87.5%；Chutia等[5]發(fā)現(xiàn)，等離子體可以延長(zhǎng)椰子汁的貨架期；Xu等[6]發(fā)現(xiàn)，借助DBD等離子體處理不會(huì)影響橙汁的糖度值；Illera等[7]利用等離子體在10.5 kV的電壓下對(duì)蘋果汁處理5 min，其中的PPO完全失活。但是，目前鮮見從分子水平上探究等離子體對(duì)PPO活性和結(jié)構(gòu)影響的研究。有鑒于此，文中以PPO為研究對(duì)象，采用操作空間靈活的DBD等離子體，探究等離子體對(duì)PPO分子構(gòu)象的影響及降低酶活的機(jī)制，以期為等離子體控制果蔬及其制品的酶促褐變提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

PPO，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；酪氨酸酶、L-左旋多巴，購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為分析純。

DBD- 50低溫等離子體設(shè)備，南京蘇曼等離子體技術(shù)有限公司生產(chǎn)；UV- 1800紫外分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn)；RF- 6000熒光分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn)；J- 810圓二色光譜儀，日本分光公司生產(chǎn)；Multimode 8原子力顯微鏡(AFM)，德國(guó)布魯克公司生產(chǎn)；FE28- Meter pH計(jì)，梅特勒-托利多(上海)有限公司生產(chǎn)；AL204 電子分析天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司生產(chǎn)；HH- 501恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的準(zhǔn)備與處理

取適量的屈臣氏雙蒸水配置pH=6.8的磷酸鹽緩沖(Phosphate Buffer Saline，PBS)溶液，將凍干、純凈的PPO溶于預(yù)冷(4 ℃)的PBS溶液中。吸取10 mL酶液，依次放入潔凈的培養(yǎng)皿(直徑3.5 mm)并做好標(biāo)記，然后進(jìn)行DBD低溫等離子體處理。研究中采用的DBD等離子體包括一個(gè)交流電源(CTP- 2000K)和一個(gè)DBD等離子體反應(yīng)器(DBD- 50)，其中5 mm厚的石英板材作為電介質(zhì)材料覆蓋在高壓電極上。工作電壓為0～30 kV，頻率為5～20 kHz。兩個(gè)平面電極之間的工作距離為5.0 mm，選擇周圍環(huán)境的空氣作為工作氣體。當(dāng)?shù)入x子體穩(wěn)定(即無(wú)明顯絲狀火花)時(shí)，啟動(dòng)定時(shí)器，設(shè)置處理時(shí)間分別為10、30、60、120、180 s，所有測(cè)試在24 h內(nèi)完成。

1.2.2 PPO相對(duì)殘余酶活的測(cè)定

根據(jù)Zhou等[8]的方法并做適當(dāng)修改，采用紫外分光光度法測(cè)定PPO的活性。反應(yīng)混合物包括 1 mL 的PBS(50 mmol/L，pH=6.8)和0.2 mL的L- 左旋多巴，在37 ℃下保溫后，加入0.2 mL的PPO溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，空白組則加入相同體積的緩沖溶液。記錄初始2 min內(nèi)420 nm波長(zhǎng)下吸光度的變化。所有測(cè)量重復(fù)3次。PPO的相對(duì)殘余酶活(RA)按下式計(jì)算：

(1)

式中，RA表示經(jīng)DBD低溫等離子體處理后PPO的相對(duì)殘余酶活(%)，At為DBD低溫等離子體處理后PPO的酶活，下標(biāo)t代表等離子體處理時(shí)間(s)，A0為未處理PPO的酶活。

1.2.3 PPO酶活的動(dòng)力學(xué)方程模擬

為進(jìn)一步了解DBD對(duì)PPO的抑制作用，建立一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和威布爾模型進(jìn)行曲線擬合[9]。

一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程公式為

RA=e-kt

(2)

式中的鈍化速率常數(shù)k通過(guò)最小二乘法非線性回歸得到。

威布爾模型的方程如下：

RA=e-(x/α)β

(3)

式中：x為等離子體處理的時(shí)間(s)；α為比例因子；β為無(wú)因次的形狀參數(shù)，代表模擬曲線的形狀。

1.2.4 圓二色光譜測(cè)定

室溫條件下，利用圓二色(CD)光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，掃描范圍為200～250 nm，掃描步長(zhǎng)和帶寬均設(shè)置為1 nm。以PBS為空白對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3次。采用Pro-data進(jìn)行光譜繪制，采用CDNN軟件計(jì)算二次結(jié)構(gòu)的比例。

1.2.5 熒光光譜測(cè)定

在室溫條件下，取適量處理前后的PPO溶液(0.12 g/L)，采用熒光分光光度法測(cè)定PPO的熒光發(fā)射光譜，其中激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均設(shè)為3 nm，掃描速度為600 nm/min。采集315～400 nm處的光譜，所有樣品均重復(fù)采集3次。

根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法并做稍微修改，在室溫條件下測(cè)定樣品的同步熒光光譜，Δλ分別設(shè)置為15和60 nm，所有樣品均重復(fù)采集3次。

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法并做稍微修改，在室溫條件下測(cè)定樣品的3D熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為200～350 nm，發(fā)射掃描波長(zhǎng)為280～450 nm，掃描速度為600 nm/min，所有樣品均重復(fù)采集3次。

1.2.6 AFM測(cè)定

在室溫條件下利用AFM在分子水平上捕獲PPO分子微觀結(jié)構(gòu)和形貌的圖像。依次取10 μL 等離子體處理和未處理的PPO溶液(40 mg/L)滴在潔凈的云母片表面，于通風(fēng)櫥中進(jìn)行風(fēng)干處理。樣品在輕敲模式下進(jìn)行掃描，掃描速率和步長(zhǎng)分別為0.997 Hz和2 μm，使用NanoScope Analysis 1.8對(duì)采集到的AFM圖像進(jìn)行處理和分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)量至少進(jìn)行3次。用OriginPro 9.1和Python 3.7進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖分析，采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析(ANOVA)。皮爾森相關(guān)系數(shù)采用Python 3.7進(jìn)行多重分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 等離子體處理后PPO的相對(duì)殘余酶活及動(dòng)力學(xué)模擬分析

如圖1所示，DBD低溫等離子體處理對(duì)PPO的活性產(chǎn)生了顯著的抑制作用。在最初的10 s內(nèi)，PPO的相對(duì)殘余酶活急劇下降為38%。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO酶活呈現(xiàn)平穩(wěn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到120和180 s時(shí)，幾乎檢測(cè)不到PPO的酶活力，這說(shuō)明DBD等離子體對(duì)PPO溶液產(chǎn)生的物理轟擊促進(jìn)了酶活力的降低[12]。為了進(jìn)一步研究低溫等離子體抑制PPO活力的機(jī)制，研究中采用一階動(dòng)力學(xué)和威布爾模型對(duì)PPO的失活進(jìn)行建模分析[9]。

(a)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合曲線

(b)威布爾模型擬合曲線

模型擬合結(jié)果如表1所示。本研究中，一階動(dòng)力學(xué)模型的均方根誤差(RMSE)偏高，說(shuō)明該模型在描述低溫等離子體對(duì)PPO的鈍化效果時(shí)并不理想。此外，圖1(a)中所示的失活過(guò)程近似分成兩段，這也暗示著DBD等離子體對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的PPO的抑制作用可能涉及不同的過(guò)程。威布爾模型則具有較高的相關(guān)系數(shù)(r2)和較低的RMSE，說(shuō)明擬合的效果較好。一般地，β=1表示數(shù)據(jù)模擬結(jié)果為一條直線，β>1表示數(shù)據(jù)模擬結(jié)果是一條向上凸起的曲線，β<1表示數(shù)據(jù)模擬結(jié)果是一條下凹的曲線。從圖1可以明顯地看出，威布爾模擬的結(jié)果為一條下凹的曲線，形狀參數(shù)β<1也證實(shí)了這一結(jié)果；此外，β<1還說(shuō)明了PPO對(duì)長(zhǎng)時(shí)間等離子體處理的抵抗性，這一現(xiàn)象得到了文獻(xiàn)[13]結(jié)果的支持。威布爾模型也被應(yīng)用在其他非熱加工技術(shù)抑制酶活的研究中。

表1 等離子體抑制PPO酶活的動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果

2.2 等離子體處理PPO的圓二色光譜分析

圓二色光譜可用于快速檢測(cè)天然蛋白質(zhì)在熱、超聲波和超高壓處理等物理過(guò)程中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，以及與變性劑結(jié)合的相互作用[14]。PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，可以通過(guò)測(cè)定其CD光譜計(jì)算得出。如圖2(b) 所示，未經(jīng)處理的PPO，其α-螺旋結(jié)構(gòu)(占比39.92%)為主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這與Zhou等[8]的研究結(jié)果一致。在起始的60 s內(nèi)，隨著等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng)，205～220 nm處的峰均向上逐漸移動(dòng)。當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至120和180 s時(shí)，可以看到峰的強(qiáng)度和形狀出現(xiàn)了顯著的變化(幾乎持平)，說(shuō)明PPO分子中不同形式的二級(jí)結(jié)構(gòu)之間發(fā)生了轉(zhuǎn)換。為了詳細(xì)地描述這種轉(zhuǎn)換，利用CDNN軟件定量計(jì)算了各二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比。經(jīng)過(guò)180 s的處理后，α-螺旋結(jié)構(gòu)大幅減少，占比從最初的39.92%下降到9.47%；β-折疊結(jié)構(gòu)占比則從15.32%上升到44.30%，同時(shí)伴隨著β-轉(zhuǎn)角的輕微降低；相反，無(wú)規(guī)則卷曲呈上升趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明，DBD等離子體對(duì)PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較強(qiáng)的破環(huán)作用，使得PPO構(gòu)象向無(wú)規(guī)則、不穩(wěn)定轉(zhuǎn)變。

(a)圓二色光譜

(b)二級(jí)結(jié)構(gòu)占比

2.3 等離子體處理PPO的熒光光譜分析

熒光光譜是一種簡(jiǎn)易、快捷的光譜診斷方式，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)微環(huán)境的變化可以通過(guò)熒光光譜進(jìn)行定性的分析[15]。一般來(lái)說(shuō)，熒光發(fā)射光譜揭示了蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光，熒光主要來(lái)源于芳香族氨基酸殘基(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)和肽鍵的變化，由于酪氨酸的熒光總是被附近的羧基或者別的氨基酸淬滅，而苯丙氨酸的熒光量子產(chǎn)率有限，因此，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來(lái)源于色氨酸[16]。如圖3(a)所示，隨等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO的熒光強(qiáng)度呈降低的趨勢(shì)。在熒光發(fā)射光譜中，PPO的熒光強(qiáng)度從未處理時(shí)的512.9下降到330.6，最大吸收峰的位置有1.75 nm的紅移。

同步熒光光譜在掃描過(guò)程中使激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間保持固定的差值Δλ，從而可以更加細(xì)致地展示芳香族氨基酸的變化。通常，當(dāng)Δλ設(shè)置為15 nm時(shí)，顯示的是酪氨酸殘基周圍微環(huán)境的變化；當(dāng)Δλ設(shè)置為60 nm時(shí)，顯示的是色氨酸附近微環(huán)境的變化；當(dāng)最大熒光吸收峰變化時(shí)，說(shuō)明色氨酸和酪氨酸周圍的微環(huán)境發(fā)生了變化。芳香族氨基酸因?yàn)橛休^大的疏水面積而被掩蓋在蛋白質(zhì)的核心部位，即在兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或子結(jié)構(gòu)的界面上，或者在寡聚蛋白組的亞界面上，當(dāng)吸收光子后，吲哚環(huán)上的電子重新排布而導(dǎo)致熒光吸收峰紅移[17]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，這些氨基酸側(cè)鏈就會(huì)暴露在極性環(huán)境中，從而引起熒光光譜的改變。在同步熒光光譜中，當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，PPO的熒光強(qiáng)度僅呈現(xiàn)較輕微的變化，從未處理時(shí)的190.8下降到118.2，但是最大吸收峰的位置有1 nm的藍(lán)移，說(shuō)明酪氨酸附近微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)進(jìn)一步折疊，熒光強(qiáng)度的下降說(shuō)明了等離子體的淬滅作用；當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，PPO的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)與熒光發(fā)射光譜近似的變化趨勢(shì)，暴露于DBD等離子體180 s后，熒光強(qiáng)度從最初的486.1下降到322.05，最大吸收峰呈現(xiàn)最大1 nm的紅移，這進(jìn)一步說(shuō)明色氨酸在內(nèi)源熒光發(fā)射光譜中起主要作用，經(jīng)過(guò)DBD低溫等離子體處理后，PPO分子中色氨酸周圍微環(huán)境的親水性增強(qiáng)，極性增大。以上結(jié)果表明，等離子體的作用位點(diǎn)更加靠近色氨酸所在的位置。Takai等[18]也報(bào)道了色氨酸受到的等離子體的修飾作用。

(a)熒光發(fā)射光譜

(b)Δλ=60 nm的同步熒光光譜

(c)Δλ=15 nm的同步熒光光譜

為了更加全面、詳細(xì)地解釋DBD等離子體對(duì)PPO構(gòu)象的影響，采用3D熒光光譜進(jìn)行監(jiān)測(cè)。3D熒光光譜被認(rèn)為和人的指紋圖譜一樣，能夠提供專一、特有的信息，因此被稱為“熒光指紋”[19]。它呈現(xiàn)的是熒光強(qiáng)度同時(shí)隨著激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)而變化的等高線圖，已逐漸成為一種可靠、完善的分析方法，能夠更加科學(xué)地揭示蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的特異性變化[11]。如圖4(a)所示，通過(guò)對(duì)PPO分子的3D光譜進(jìn)行處理，將拉曼峰和瑞利散射峰去除，未處理的PPO有兩個(gè)峰，峰1在λex=230 nm附近，峰2在λex=280 nm附近。隨著DBD低溫等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng)，峰1和峰2的強(qiáng)度均下降，可以明顯地看出，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到120 s時(shí)，峰1消失。王瑞[11]認(rèn)為，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為230和330 nm時(shí)，熒光峰代表了蛋白質(zhì)多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征吸收峰。以上結(jié)果表明，DBD處理對(duì)肽鏈骨架和芳香族氨基酸周圍的微環(huán)境造成了影響，對(duì)色氨酸和酪氨酸的內(nèi)源熒光產(chǎn)生了淬滅作用，這與前述報(bào)道一致——Takai等[18]的研究指出，等離子體影響二硫鍵和羰基的形成，以及對(duì)氨基酸殘基的修飾，從而影響蛋白質(zhì)多肽鏈骨架。

2.4 等離子體處理PPO的AFM結(jié)果分析

AFM結(jié)果可以表征PPO分子的顆粒形態(tài)、大小和高度。圖5所示為DBD低溫等離子體處理前后PPO的AFM圖像。使用NanoScope Analysis軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析可知：未經(jīng)處理PPO分子的平均直徑為109.64 nm，平均高度為3.251 nm；經(jīng)等離子體處理后，PPO分子的平均高度和粒徑隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降(處理10 s的除外)；在最初10 s的處理時(shí)間內(nèi)，PPO分子的平均高度下降了0.52 nm，平均粒徑上升了25.29 nm；處理時(shí)間延長(zhǎng)到30 s，PPO分子的平均高度上升了0.13 nm，平均粒徑下降了27.80 nm，說(shuō)明在較短時(shí)間(30 s)的等離子體處理?xiàng)l件下，PPO分子發(fā)生了聚集作用。從圖5(b)和5(c)可以看出，PPO分子形成較大且變形的顆粒，這可能是因?yàn)樵诘入x子體高能粒子的轟炸及活性氧、活性氮的作用下，PPO蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生了化學(xué)鍵的斷裂與重組，巰基被氧化[16]，使得蛋白分子團(tuán)進(jìn)一步變大。但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，持續(xù)的高強(qiáng)度轟炸以及活性成分的持續(xù)氧化，會(huì)使PPO分子團(tuán)發(fā)生解聚作用，PPO分子逐漸變小。通過(guò)計(jì)算得到，當(dāng)處理時(shí)間增加到60、120和180 s時(shí)，PPO分子的平均高度依次下降到2.362、1.462和1.390 nm，平均粒徑依次下降到75.659、65.840和66.792 nm。

(a)處理0 s

(b)處理10 s

(c)處理30 s

(d)處理60 s

(e)處理120 s

(f)處理180 s

3 結(jié)論

文中研究了DBD低溫等離子體處理對(duì)PPO活力及構(gòu)象的影響，得到以下結(jié)論：

1)PPO活力隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且在處理120 s時(shí)幾乎檢測(cè)不到其酶活，說(shuō)明DBD等離子體對(duì)PPO產(chǎn)生的物理轟擊降低了PPO的酶活；

2)DBD低溫等離子體處理對(duì)PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞程度較大，處理180 s后，PPO的α-螺旋結(jié)構(gòu)占比從最初的39.92%下降到9.74%，β-折疊結(jié)構(gòu)占比從最初的15.32%上升到44.30%；

3)隨著等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO的內(nèi)源熒光強(qiáng)度和同步熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，3D熒光光譜顯示，無(wú)論是芳香氨基酸還是肽鏈骨架，都受到了等離子體的修飾作用，特別是當(dāng)處理時(shí)間達(dá)180 s時(shí)，PPO多肽鏈骨架的3D熒光吸收峰消失；

4)AFM結(jié)果顯示，PPO分子的平均高度和大小隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降(處理10 s時(shí)的除外)，顆粒形態(tài)呈現(xiàn)先聚集再解聚的現(xiàn)象，等離子體處理破壞了PPO分子的聚集狀態(tài)，活性中心完全暴露在活性成分中，從而引起PPO活性的喪失。