非特異性過(guò)氧合酶GmaUPO的重組表達(dá)及生化表征

藍(lán)東明 乜曉爽 馬云建 王永華

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

非特異性過(guò)氧合酶(Unspecific Peroxygenase，UPO，EC 1.11.2.1)是一類可利用H2O2實(shí)現(xiàn)C—H鍵催化氧化官能化的血紅素氧化酶，其催化反應(yīng)類型包括羥基化、環(huán)氧化以及雜原子氧化等[1- 4]。具有同樣功能的P450單加氧酶，其催化過(guò)程中需要煙酰輔酶因子NAD(P)H作為電子供體，同時(shí)伴有輔因子再生系統(tǒng)，其復(fù)雜的電子傳遞鏈?zhǔn)沟梅磻?yīng)難以廣泛應(yīng)用[5]。而UPO能夠直接利用H2O2作為氧供體和電子受體，因而具有更高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[6- 11]。

Ullrich等[12]于2004年從茶樹(shù)菇(Agrocybeaegerita)中首次發(fā)現(xiàn)了將過(guò)氧化物的氧原子轉(zhuǎn)移到甲苯和萘等底物中的AaeUPO。隨后，具有類似催化功能的酶在雙核菌亞界(Dikarya)和高等真菌界的子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[1]。近年來(lái)，在遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)和已測(cè)序的基因組中已有數(shù)千個(gè)假定的UPO基因被發(fā)現(xiàn)[13]，對(duì)應(yīng)于近20個(gè)類群的子囊菌和擔(dān)子菌，以及十幾種真菌狀卵菌[14]。高效異源表達(dá)UPO基因及進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)表征，將有助于挖掘具有應(yīng)用潛力的候選加氧酶，同時(shí)是研究此類氧化酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的重要前提。然而，真菌來(lái)源的血紅素氧化酶的異源高效表達(dá)一直以來(lái)都是制約上述研究的瓶頸[13]。選擇適合的表達(dá)系統(tǒng)用于該類酶基因的重組表達(dá)十分關(guān)鍵。目前已被報(bào)道的可以異源表達(dá)UPO的表達(dá)系統(tǒng)包括畢赤酵母[15]、釀酒酵母[15]、米曲霉[16]及大腸桿菌[17]等。米曲霉高效表達(dá)系統(tǒng)是Novozymes公司的專利技術(shù)，因知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的原因，未公開(kāi)詳細(xì)的菌株、載體和發(fā)酵條件等信息。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)易形成包涵體，雖然可通過(guò)體外活化的方式進(jìn)行變復(fù)性，但針對(duì)UPO包涵體變復(fù)性的方案尚未有報(bào)道。酵母表達(dá)系統(tǒng)生長(zhǎng)快、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，并且具有類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾過(guò)程，其中，以甲醇誘導(dǎo)型為代表的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有高表達(dá)、可誘導(dǎo)、易純化分泌蛋白、易于實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)[18]。另外，由于含血紅素的酶在異源宿主胞內(nèi)分泌不足，合成效率過(guò)低，直接影響血紅素與新生重組蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致該類酶表達(dá)量不高。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件及血紅素前體氨基乙酰丙酸(δ-Aminolevulinic Acid，ALA)添加量，可提高含血紅素重組酶的產(chǎn)率[19]。

有鑒于此，本研究在NCBI上下載了來(lái)源于紋緣盔孢傘(Galerinamarginata)假定的UPO基因(GmaUPO)，通過(guò)序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該GmaUPO與報(bào)道中的AaeUPO具有67%的相似性，故選擇該基因在畢赤酵母中開(kāi)展了異源表達(dá)。隨后，優(yōu)化發(fā)酵條件，并進(jìn)行重組酶的酶學(xué)性質(zhì)及催化應(yīng)用的初步研究，旨在擴(kuò)大UPO生物酶的資源庫(kù)，同時(shí)為其催化應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢赤酵母菌株X- 33、質(zhì)粒pPICZαA均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于唯地生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI均購(gòu)自TaKaRa大連生物工程公司；無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自于中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Western blot的一抗為小鼠抗His-tag單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG(H & L)二抗(HRP標(biāo)記)，均購(gòu)自金瑞斯生物科技公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備如下：美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad公司產(chǎn)PCR儀(T100型)，德國(guó)HERMLE公司產(chǎn)Z216MK冷凍離心機(jī)，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)Infinite M NANO多功能酶標(biāo)儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)電泳儀(DYY- 8C型)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司產(chǎn)SW-CJ- 1F超凈工作臺(tái)，日本Hirayama公司產(chǎn)HVE- 50高壓滅菌鍋，上海申賢恒溫有限公司產(chǎn)恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1GmaUPO基因工程菌的構(gòu)建

來(lái)源于Galerinamarginata的UPO編碼序列(KDR72024.1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。應(yīng)用PCR擴(kuò)增獲得GmaUPO的目的基因片段(上游引物：5′-ATTATTCGAAACGAGGAATT CTTTCCAGCTTACGGATCACTA- 3′；下游引物：5′-AACTCAATGATGATGATGATGATGGTCGAC T TTGCCATAGGGAAAGACTTG- 3′)，擴(kuò)增條件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，共50個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72 ℃下保持5 min。將經(jīng)內(nèi)切酶EcoRI和SalI酶切后的pPICZαA載體與擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布至含有終質(zhì)量濃度為25 μg/mL博來(lái)霉素的LB固體平板上，于37 ℃下培養(yǎng)12～16 h，將單菌落挑至5 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)約12～16 h后，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒進(jìn)行全基因測(cè)序。

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pPICZαA進(jìn)行線性化，通過(guò)電擊穿法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X- 33感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含有終質(zhì)量濃度為100 μg/mL博來(lái)霉素的YPD固體平板上，于30 ℃下培養(yǎng)36～48 h。隨后，將重組子單菌落挑至5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min的條件下培養(yǎng)16～18 h，并利用PCR方法篩選陽(yáng)性重組菌。

1.3.2 重組蛋白GmaUPO的生物信息學(xué)分析

從NCBI下載GmaUPO蛋白質(zhì)FASTA序列。使用DNAMAN軟件將GmaUPO基因序列與其他一系列已報(bào)道的UPO基因序列進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)在Multalin網(wǎng)站對(duì)GmaUPO基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，隨后通過(guò)ESPript 3.0做圖。

此外，將GmaUPO氨基酸基因序列上傳到Swiss-Model官網(wǎng)中進(jìn)行基因序列識(shí)別，選擇與GmaUPO同源性最高的模板進(jìn)行同源建模；隨后，將Swiss-Model預(yù)測(cè)的模型以PBD的格式下載，最后通過(guò)PyMOL軟件獲得GmaUPO的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。

1.3.3 重組蛋白GmaUPO的表達(dá)

將陽(yáng)性單克隆接種至50 mL BMGY培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min的條件下培養(yǎng)至菌體吸光度為0.8～1.0，按10%的接種量接種至400 mL BMMY培養(yǎng)基中，同時(shí)添加終濃度為45 μmol/L的ALA，于22 ℃、250 r/min的條件下誘導(dǎo)96 h，每24 h添加甲醇(1%)進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)以不含目的基因的畢赤酵母菌株作為對(duì)照。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液用冷凍離心機(jī)在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)利用Western Blot檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，檢測(cè)的抗體為特異性His標(biāo)簽抗體。同時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵條件，包括誘導(dǎo)溫度(28、25、22 ℃)和ALA濃度(5、25、45、65、85 μmol/L)。

1.3.4GmaUPO的酶活力檢測(cè)

采用5-硝基- 1，3-苯并二惡唑(NBD)作為GmaUPO的酶活力檢測(cè)底物[19]。具體方法如下：在96孔板中加入100 μL磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L、pH 7.0)、30 μL NBD(6.6 mmol/L)、20 μL去離子水、30 μL酶液、20 μL H2O2(20 mmol/L)，在425 nm 下測(cè)定吸光度。所有實(shí)驗(yàn)平行3組，同時(shí)以高溫滅活的上清液作為對(duì)照。

酶活力單位定義為：每分鐘水解底物NBD生成1 μmol的4-硝基鄰苯二酚所需的酶量為1個(gè)活力單位(U)。

1.3.5GmaUPO的生化表征

(1)pH值對(duì)GmaUPO酶活力的影響

測(cè)定GmaUPO的最適pH值及pH耐受性。選擇pH值范圍為4.0～10.0的7種緩沖溶液對(duì)GmaUPO的活性變化進(jìn)行探討(pH=4.0，5.0時(shí)為100 mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液；pH=6.0，7.0，8.0時(shí)為100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液；pH=9.0，10.0時(shí)為100 mmol/L的Tri-Hcl緩沖液)。將最高酶活力定義為100%，其余以相對(duì)酶活力表示。進(jìn)一步研究了pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，將GmaUPO在不同pH值的緩沖溶液中于4 ℃下孵育2 h后，測(cè)定酶活力殘余值，檢測(cè)其pH值耐受性。將孵育前的酶活力定義為100%，其余以相對(duì)酶活力表示。

(2)溫度對(duì)GmaUPO活力的影響

測(cè)定GmaUPO的最適溫度及熱穩(wěn)定性。在最適pH值下，選擇不同溫度(20～45 ℃)研究GmaUPO酶液的活性變化，將最高酶活力定義為100%，其余以相對(duì)酶活力表示。進(jìn)一步研究溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，將適量的GmaUPO置于不同溫度下，每隔一定時(shí)間取樣進(jìn)行酶活力檢測(cè)，以測(cè)定其溫度耐受性。將熱處理前的酶活力定義為100%，其余以相對(duì)酶活力表示。

1.3.6GmaUPO的催化氧化特性研究

采用膽堿氧化酶催化氯化膽堿在線產(chǎn)生H2O2的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)體系[17]，對(duì)GmaUPO催化氧化乙基苯底物進(jìn)行研究。反應(yīng)產(chǎn)物利用三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析。具體催化反應(yīng)步驟如下：將400 μL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH=7.0)和100 μL氯化膽堿溶液(1 mol/L)加入反應(yīng)玻璃瓶中，充氧后，加入50 μL膽堿氧化酶(100 μmol/L，AnChOx)酶液、400 μLGmaUPO酶液和5 mmol/L底物，最后用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH=7.0)將反應(yīng)體積補(bǔ)足到1 mL。將該反應(yīng)體系置于恒溫油浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速500 r/min。反應(yīng)結(jié)束后，利用1 mL乙酸乙酯萃取，離心后取上層有機(jī)層進(jìn)行檢測(cè)。

三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS檢測(cè)條件：初始溫度50 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至190 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持6 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 GmaUPO的序列分析

經(jīng)ExPASy官網(wǎng)預(yù)測(cè)，假定非特異性過(guò)氧合酶GmaUPO成熟肽基因長(zhǎng)度為1 059 bp，編碼353個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為38.3 ku。為進(jìn)一步探究其序列特征，在MuLtalin網(wǎng)站上對(duì)GmaUPO序列與其他已報(bào)道的UPO進(jìn)行序列比對(duì)分析(見(jiàn)圖1)，同時(shí)使用ESPript做圖，結(jié)果顯示GmaUPO與目前報(bào)道的UPOs序列相似度在15.49%～67.23%范圍內(nèi)，且GmaUPO含有UPO特征的催化保守序列Pro60-Cys61-Pro62、Glu147-Gly148-Asp149和Arg190-Glu197(見(jiàn)圖1綠色框)。

為進(jìn)一步了解GmaUPO催化活性中心的結(jié)構(gòu)特征，將GmaUPO的成熟肽氨基酸序列上傳至Swiss-Model官網(wǎng)，選擇序列相似度高達(dá)67%的AaeUPO為模板(PDB ID：5YO2)，結(jié)果用PyMOL軟件顯示，如圖2(a)所示。在GmaUPO的催化活性口袋內(nèi)部，Pro60-Cys61-Pro62(PCP區(qū)域)中的半胱氨酸與血紅素形成共價(jià)鍵，起到穩(wěn)定血紅素的作用；Glu147-Gly148-Asp149(EGD區(qū)域)和Ser151-Met152-Thr153(SMT區(qū)域)起到穩(wěn)定血紅素和鎂離子的作用。另外，苯丙氨酸被認(rèn)為是組成血紅素口袋的關(guān)鍵氨基酸，與將底物引導(dǎo)至活性位點(diǎn)有關(guān)，對(duì)催化反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)鍵作用[16]。從圖2(b)可知，GmaUPO催化活性口袋周圍包含10個(gè)苯丙氨酸，這進(jìn)一步說(shuō)明，假定的GmaUPO具有UPO的催化特性。

2.2 GmaUPO的基因工程菌構(gòu)建及表達(dá)

為了驗(yàn)證GmaUPO的催化活性，將全基因合成的GmaUPO克隆到畢赤酵母表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化畢赤酵母。利用PCR技術(shù)驗(yàn)證篩選GmaUPO基因畢赤酵母陽(yáng)性重組子。隨后，將陽(yáng)性重組酵母菌株在甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，并利用組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析，結(jié)果如圖3所示。發(fā)酵上清樣品中有明顯的蛋白表達(dá)條帶，分子質(zhì)量約為40 ku，與預(yù)測(cè)的GmaUPO大小相一致。

上方序號(hào)代表氨基酸的位置；綠色框代表UPO催化活性中心保守序列

(a)GmaUPO催化中心結(jié)構(gòu)示意圖

(b)GmaUPO催化活性口袋周圍苯丙氨酸位置示意圖

M—蛋白Marker；1—工程菌發(fā)酵上清樣品

一般而言，低溫條件下新生蛋白在細(xì)胞內(nèi)更容易折疊，同時(shí)呈現(xiàn)出更高的生理活性。而高濃度的ALA會(huì)抑制細(xì)胞的繁殖，呈現(xiàn)一定的毒化作用。經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化可知(如圖4所示)：同條件下添加85 μmol/L 的ALA，GmaUPO酶活力僅為添加45 μmol/L ALA時(shí)的16%～53%；而在誘導(dǎo)溫度為22 ℃、ALA終濃度為45 μmol/L的條件下，發(fā)酵酶液的酶活力最佳，最高可達(dá)6 U/L，因此，優(yōu)選出最佳的ALA濃度對(duì)含血紅素蛋白酶的表達(dá)尤為重要。

圖4 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3 GmaUPO的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 pH值對(duì)GmaUPO酶活力的影響

以NBD為檢測(cè)底物，GmaUPO酶液的最適反應(yīng)pH值為9.0，溶液pH值為8.0和10.0時(shí)酶活力可維持在最高活力的60%左右，而在其他pH值緩沖液中酶活力均受到抑制。隨后，研究了GmaUPO在不同pH值緩沖液下孵育2 h的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5(b)所示。在pH=7.0以下的緩沖溶液中孵育后，GmaUPO的相對(duì)酶活力低于70%，而在pH為7.0～10.0的緩沖溶液中孵育后，GmaUPO的相對(duì)酶活力高于70%，說(shuō)明GmaUPO在堿性環(huán)境中的催化活性更佳。

(a)pH值對(duì)GmaUPO酶活力的影響

(b)pH值對(duì)GmaUPO酶活力穩(wěn)定性的影響

2.3.2 溫度對(duì)GmaUPO酶活力的影響

如圖6(a)所示，GmaUPO酶液催化NBD的最適溫度為35 ℃，而在其他溫度(20～40 ℃)下相對(duì)酶活力仍保持在60%以上。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GmaUPO在25和30 ℃的條件下，1 h內(nèi)可保持初始活力的80%，而3 h后其活力均低于初始活力的30%。45 ℃下孵育3 h后，GmaUPO酶活已基本無(wú)法檢出。

2.4 GmaUPO的催化應(yīng)用初探

β-苯乙醇作為香精香料可應(yīng)用于食品行業(yè)、藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域[6]。目前的制備方法主要是化學(xué)合成法，存在反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜、能耗高及環(huán)境不友好等問(wèn)題。因此，酶法催化合成是一個(gè)有前景的替代方法。為了驗(yàn)證GmaUPO催化乙基苯生成β-苯乙醇的可行性，文中采用膽堿氧化酶與GmaUPO級(jí)聯(lián)催化氧化乙基苯的反應(yīng)途徑，并采用三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7所示。乙基苯和β-苯乙醇的保留時(shí)間分別為5.071和9.431 min，在4h內(nèi)β-苯乙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)3.2%(見(jiàn)表1)，表明重組GmaUPO具有催化底物羥基化的活性。

(a)溫度對(duì)GmaUPO酶活力的影響

(b)溫度對(duì)GmaUPO酶活力穩(wěn)定性的影響

(a)反應(yīng)體系的氣相色譜圖

(b)保留時(shí)間為5.071 min時(shí)的質(zhì)譜圖

(c)保留時(shí)間為9.431 min時(shí)的質(zhì)譜圖

表1 GmaUPO的反應(yīng)參數(shù)

3 結(jié)論

本研究從紋緣盔孢傘的基因組中挖掘了一個(gè)假定的非特異性過(guò)氧合酶(GmaUPO)，通過(guò)全基因合成技術(shù)獲得了GmaUPO的基因序列，并實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母X- 33中的重組表達(dá)，通過(guò)研究其催化氧化底物的特性，證實(shí)其具有過(guò)氧合酶的催化活力，并具有合成香料物質(zhì)分子的應(yīng)用潛能。本研究不僅豐富了非特異性過(guò)氧合酶的種類，還為GmaUPO在工業(yè)催化中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。未來(lái)的工作中，需對(duì)GmaUPO進(jìn)行分子定向進(jìn)化來(lái)進(jìn)一步提高其酶活力和表達(dá)量，解析GmaUPO的三維結(jié)構(gòu)，研究其催化底物的偏好性，拓展其應(yīng)用范圍。