骨關(guān)節(jié)尖端賽多孢菌與偶發(fā)分枝桿菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床治療

王 曦，蒼金榮，歸巧娣，周 楠，劉宗智（.西安市紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)病院，西安 70054；

2.陜西省人民醫(yī)院，a.檢驗(yàn)科；b.陜西省臨檢中心；c.藥學(xué)部；d 骨科，西安710068）

骨關(guān)節(jié)感染是指細(xì)菌、病毒等微生物侵入關(guān)節(jié)腔內(nèi)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎癥，患者多為抵抗力較弱的兒童以及老年人。關(guān)節(jié)感染最常見的原因是敗血癥，而外傷、手術(shù)、關(guān)節(jié)附近的軟組織感染也是造成關(guān)節(jié)感染的原因。關(guān)節(jié)感染臨床上分為急性感染性關(guān)節(jié)炎和慢性感染性關(guān)節(jié)炎，急性感染性關(guān)節(jié)炎可由細(xì)菌或病毒感染引起，而慢性感染性關(guān)節(jié)炎可由分枝桿菌、真菌和一些致病性較弱的細(xì)菌引起。隨著新的診療技術(shù)應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)診斷水平的提高，苛氧菌、少見菌等感染的報(bào)道屢見不鮮。本文報(bào)道1 例骨關(guān)節(jié)發(fā)生少見的尖端賽多孢菌與偶發(fā)分枝桿菌并發(fā)感染病例，從病原學(xué)診斷和臨床治療過程進(jìn)行分析，為臨床少見病原菌感染診治提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2017年12月在陜西省某三甲醫(yī)院骨科收治1 例骨關(guān)節(jié)尖端賽多孢菌與偶發(fā)分枝桿菌并發(fā)感染病例作為研究對象?；颊吣行?，46 歲，體重60 kg，農(nóng)民，2 個半月前（2017-9-18）耕地時因旋耕機(jī)打傷，致左側(cè)大腿及膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)軟組織損傷，傷口與左膝關(guān)節(jié)相通，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行清創(chuàng)縫合術(shù)，術(shù)后3 周傷口愈合良好，拆線；1 個半月前（2017-10-21），患者左膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫伴有發(fā)熱，體溫38 ℃，外院給予頭孢類抗生素對癥治療及關(guān)節(jié)腔穿刺培養(yǎng)（未培養(yǎng)出細(xì)菌），隨后行“左膝關(guān)節(jié)沖洗引流術(shù)”，引流后體溫恢復(fù)正常，但是后期引流欠佳時，體溫再次升高。為求進(jìn)一步診治以“左膝關(guān)節(jié)術(shù)后感染”收住于骨科（2017-12-01）。入院時查體發(fā)現(xiàn)左下肢見膝關(guān)節(jié)內(nèi)上方延伸約15 cm至膝關(guān)節(jié)前方愈合瘢痕，仍留有少許縫線，傷口愈合欠佳，膝關(guān)節(jié)無明顯發(fā)紅，稍腫脹，皮溫略高，左膝關(guān)節(jié)局部壓痛，活動受限，雙下肢末梢血運(yùn)好。

1.2 儀器與試劑 革蘭染色液、抗酸染色液、熒光染色液和棉蘭染液（貝索）；血平板、麥康凱平板、沙保弱平板和厭氧平板(鄭州安圖)；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS，美國BD 公司）。

1.3 方法 患者入院后，采集靜脈血進(jìn)行血細(xì)胞分析、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、紅細(xì)胞沉降率和降鈣素原（PCT）等指標(biāo)檢測，同時由骨科醫(yī)師采用無菌操作抽取關(guān)節(jié)腔積液，立即送檢驗(yàn)科微生物室進(jìn)行涂片染色（革蘭染色、抗酸染色、熒光染色）和培養(yǎng)。具體操作嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4 版）進(jìn)行。根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果參考《熱病》、《國家抗微生物治療指南》及臨床藥師意見進(jìn)行抗生素治療。定期復(fù)查血細(xì)胞檢測、肝腎功能及感染指標(biāo)，及時調(diào)整用藥。

2 結(jié)果

2.1 患者常規(guī)檢查結(jié)果 血細(xì)胞分析：白細(xì)胞計(jì)數(shù)7.1×109/L，中性粒細(xì)胞百分比66%，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)4.14×1012/L，血紅蛋白119 g/L，血小板計(jì)數(shù)444×109/L；肝腎功能均正常；其他感染指標(biāo)：紅細(xì)胞沉降率85 mm/h，CRP 75.23 mg/L，PCT ＜0.05 ng/mL，T-SPORT 陰性。

2.2 關(guān)節(jié)液病原學(xué)檢查

2.2.1 直接涂片檢查結(jié)果：見圖1?；颊哧P(guān)節(jié)腔引流液外觀為膿血性乳糜狀液體（圖1D）；直接涂片染色的結(jié)果：抗酸染色見大量白細(xì)胞和抗酸陽性呈柴捆狀排列的菌體（圖1A）；革蘭染色見大量白細(xì)胞及真菌菌絲和孢子（圖1B）；熒光染色見團(tuán)狀菌絲（圖1C）。

圖1 關(guān)節(jié)腔膿液性狀及涂片多種染色結(jié)果

2.2.2 培養(yǎng)與MALDI-TOF MS 鑒定結(jié)果：見圖2。關(guān)節(jié)腔積液接種于血平板、麥康凱平板、沙保弱平板和厭氧平板，分別置于37℃ 和30℃，需氧和厭氧環(huán)境培養(yǎng)，逐日觀察。培養(yǎng)72h 后，37℃需氧血平板見灰白色絲狀真菌大菌落及細(xì)小、顆粒樣、干燥小菌落（圖2A）；30℃沙保弱平板也見灰白色絨毛樣大菌落（圖2B），尖端賽多孢菌培養(yǎng)物經(jīng)棉蘭染色見尖端賽多孢黏束產(chǎn)孢和環(huán)痕產(chǎn)孢（圖2C 和圖2D）。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）鑒定，真菌為尖端賽多孢菌、細(xì)菌為偶發(fā)分枝桿菌，見圖3。

圖2 關(guān)節(jié)液培養(yǎng)血平板（A）、沙保弱平板（B）菌落形態(tài)及尖端賽多孢菌棉蘭染色（C，D）

圖3 尖端賽多孢菌、偶發(fā)分枝桿菌MALDI-TOF MS 鑒定圖譜

2.3 臨床治療 臨床根據(jù)培養(yǎng)鑒定結(jié)果和《熱病》、《國家抗微生物治療指南》及臨床藥師意見進(jìn)行抗生素治療。給予左氧氟沙星＋伏立康唑＋阿米卡星靜脈滴注、治療14日，患者左膝關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，左下肢肌力正常、出院。出院醫(yī)囑口服左氧氟沙星＋多西環(huán)素＋伏立康唑，因患者經(jīng)濟(jì)原因中途自行停服伏立康唑后病情復(fù)發(fā)再次入院。行關(guān)節(jié)積液穿刺培養(yǎng)報(bào)告：尖端賽多孢菌感染。再次清創(chuàng)，繼續(xù)給予左氧氟沙星＋伏立康唑＋阿米卡星靜脈滴注治療，待癥狀改善后改左氧氟沙星＋多西環(huán)素＋伏立康唑口服，期間查肝功能：ALT 166 U/L，AST 163 U/L，ALP 127 U/L，GGT 165 U/L，考慮聯(lián)合用藥肝功能輕度受損，改口服左氧氟沙星＋復(fù)方磺胺甲噁唑＋伏立康唑，直至出院。出院后6月，患者左膝關(guān)節(jié)腫脹消失，可自行站立行走，復(fù)查血細(xì)胞分析、CRP，紅細(xì)胞沉降率及肝腎功能均正常，逐停用所有藥物。該患者停藥后再無復(fù)發(fā)。

3 討論

關(guān)節(jié)感染是由來源于滑膜或關(guān)節(jié)周圍組織的細(xì)菌、真菌或病毒引起的炎癥。感染性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率在全球差異較大：在美國，發(fā)病率<200/10 萬，歐洲國家的發(fā)病率較低，在瑞士<5/10萬，但在非洲、拉丁美洲和亞洲發(fā)病率相對較高。由于很多骨關(guān)節(jié)感染癥狀非特異，常常被誤認(rèn)為骨關(guān)節(jié)病及骨質(zhì)疏松而忽略。引起骨關(guān)節(jié)感染主要病原體仍以G＋菌為主，特別是葡萄球菌屬細(xì)菌[1]。而我國近年的大樣本病原學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)G-菌感染的比例有所升高[2]。隨著人工植入物相關(guān)感染日漸增多，骨關(guān)節(jié)感染率逐漸升高，感染病原體多樣化，少見菌、苛氧菌引起的感染報(bào)告屢見不鮮[3-4]。

分枝桿菌（Mycobacterium）包括：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌（NTM）和麻風(fēng)分枝桿菌。目前已報(bào)道的NTM 菌種有190 余種，14 個亞種，大部分為寄生菌，少數(shù)為條件致病菌。近年來，由NTM 引起的疾病呈快速增多趨勢。2016年發(fā)表的《非結(jié)核分枝桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷專家共識》指出[5]：NTM 可引起身體各部位的疾病，但以肺部感染最為常見，約占NTM 感染的90%，其次受累部位有淋巴結(jié)、皮膚軟組織、骨及全身播散性病變，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、角膜和耳部感染有個案報(bào)道?！恫苁舷到y(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》根據(jù) NTM 生長速度將其分為快速生長型和緩慢生長型，常見的快速生長分枝桿菌（rapidly growingMycobacteria，RGM）29 種，緩慢生長分枝桿菌26 種。RGM 廣泛分布于水源、土壤和動物體內(nèi)，為條件致病菌，可引起免疫低下人群的呼吸道感染或全身播散。肺外感染通常由局部創(chuàng)傷或手術(shù)引起。關(guān)節(jié)腔感染以龜分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌多見。2020年《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南》[6]（下簡稱《指南》）首次指出了NTM病發(fā)生的危險(xiǎn)因素包括宿主因素、藥物因素和環(huán)境因素。該病患系農(nóng)民，傷口被土壤污染造成感染，環(huán)境因素在疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。臨床標(biāo)本分離NTM 一般考慮從無菌部位分離出的NTM 多為致病菌，從非無菌部位分離出的應(yīng)首先排除標(biāo)本污染，呼吸道標(biāo)本還要排除定植。該患者標(biāo)本系無菌操作下采集，同時多點(diǎn)取材，培養(yǎng)均檢見偶發(fā)分枝桿菌，涂片也證實(shí)有抗酸陽性菌，多考慮為致病菌而非污染菌。為提高抗酸陽性菌的檢出率，本研究還做了涂片熒光染色，同樣可檢見團(tuán)狀菌絲?！吨改稀分袑τ诳焖偕L型分枝桿菌，推薦進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)的藥物應(yīng)包括阿米卡星、亞胺培南/西司他丁(僅限于偶發(fā)分枝桿菌)、多西環(huán)素、氟喹喏酮類藥物、磺胺甲嗯唑/甲氧芐啶、頭孢西丁、大環(huán)內(nèi)酯類和利奈唑胺等。微孔稀釋法是目前CLSI 推薦的藥敏方法，但該方法步驟相對復(fù)雜，未在臨床廣泛應(yīng)用。對于偶發(fā)分枝桿菌皮膚、軟組織和骨病的推薦治療策略為：至少采用2 種敏感藥物，療程至少4 個月，骨病患者的療程至少6 個月，對于病灶廣泛、膿腫形成及藥物療效不佳者，可采用外科清創(chuàng)術(shù)或異物清除處理。

尖端賽多孢菌是臨床較常分離的賽多孢子菌，是波氏假阿利什菌的無性型，在土壤、污水、腐物等受污染的環(huán)境中廣泛、長期存在。近年發(fā)現(xiàn)，尖端賽多孢菌引起的感染大多為深部感染，免疫功能缺陷人群中如艾滋病、器官移植、淋巴瘤、白血病、長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等患者容易并發(fā)該菌感染[7-9]，但在免疫功能正常者中也有檢出[10]。尖端賽多孢菌可造成肺部、關(guān)節(jié)、眼部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多部位感染，嚴(yán)重時可造成致死性感染。尖端賽多孢菌對兩性霉素B、制霉菌素、伊曲康唑和酮康唑等抗真菌藥物天然耐藥或活性較低，但對伏立康唑較為敏感。目前 CLSI M38-A2 方案尚未有關(guān)于尖端賽多孢菌藥敏折點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，同時尚未確定流行病學(xué)折點(diǎn)及臨床折點(diǎn)。朱信霖[11]查閱文獻(xiàn)，參考煙曲霉的6 種抗真菌藥流行病學(xué)折點(diǎn)進(jìn)行判斷發(fā)現(xiàn)：伏立康唑(MIC50=0.25μg/ml；MIC90=0.5μg/ml)和米卡芬凈(MIC50=0.25μg/ml；MIC90=0.5μg/ml)抗菌活性最高。本例患者采用伏立康唑治療有效，但抗真菌治療周期較長，停藥指征嚴(yán)格，前期該患者因?yàn)榻?jīng)濟(jì)原因自行停藥后復(fù)發(fā)，給治療帶來了不必要的麻煩。

本例患者在田間勞動時發(fā)生意外感染偶發(fā)分枝桿菌和尖端賽多孢菌，這兩種病原體均廣泛分布在土壤，成為混合感染的共同“媒介”。但目前這兩種菌混合感染尚不多見，檢出率較低。分析原因可能：①兩者均為臨床少見菌感染，生長相對較緩慢，菌落較小，容易忽視、漏診。②基層實(shí)驗(yàn)室設(shè)備相對落后，人員經(jīng)驗(yàn)不足、檢查流程與操作不規(guī)范等。該患者起病初期在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院未培養(yǎng)出病原菌，可能與此有關(guān)。一些實(shí)驗(yàn)室不重視膿液、引流液涂片檢測。忽視涂片和培養(yǎng)相結(jié)合而造成漏診。本實(shí)驗(yàn)室對標(biāo)本涂片進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)：抗酸染色見抗酸陽性呈柴捆狀排列之菌體，革蘭染色見真菌菌絲，熒光染色見團(tuán)狀菌絲。這為后期菌落觀察及鑒定提供依據(jù)，提高培養(yǎng)的陽性率，同時縮短了報(bào)告時間。另外許多實(shí)驗(yàn)室診斷手段如分子診斷技術(shù)，如通過分析同源DNA序列組成差異將細(xì)菌鑒定至種的水平，是目前菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。直接同源基因或序列比較方法、間接同源基因或序列比較方法、二代測序技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解析電離化/飛行時間質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于大型實(shí)驗(yàn)室，大大縮短了鑒定時間，為臨床診治提供依據(jù)。但基層實(shí)驗(yàn)室這些設(shè)備短缺也是造成診斷陽性率低下的原因。

由于目前國內(nèi)并沒有建立或未廣泛開展偶發(fā)分枝桿菌和尖端賽多孢菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，我們主要根據(jù)《熱病》、《國家抗微生物治療指南》等推薦意見，選擇抗生素治療?？紤]到治療這兩種病原體感染需要長期使用抗生素，治療過程中應(yīng)密切觀察肝毒性、腎毒性等全身性副作用，及時更改治療方案。該患者使用左氧氟沙星＋多西環(huán)素＋伏立康唑一個月后，血清轉(zhuǎn)氨酶濃度升高，考慮是多西環(huán)素及伏立康唑常見不良反應(yīng)，為此在制定第二次出院方案中，選擇復(fù)方磺胺甲噁唑替換多西環(huán)素，以降低肝臟負(fù)擔(dān)。長期用藥患者的依從性也很關(guān)鍵，該患者使用伏立康唑治療30天后自行停藥導(dǎo)致治療失敗，再次規(guī)范、足療程治療8 個月后，真菌才徹底清除。因此，對于長期使用抗生素的患者，加強(qiáng)患者用藥依從性，監(jiān)測藥物不良反應(yīng)，都是提高抗感染治療的成功率的關(guān)鍵。

總之，對于深部無菌組織及骨關(guān)節(jié)感染的診斷，首先需重視標(biāo)本的留取，特別是用藥前標(biāo)本的留取；其次是標(biāo)本中膿液直接涂片、多種染色方法的鏡下找病原菌，能有效、快速找到大致病原菌；第三是分離培養(yǎng)、苛養(yǎng)菌培養(yǎng)、延長培養(yǎng)時間與仔細(xì)觀察細(xì)菌的生長情況，進(jìn)一步驗(yàn)證直接涂片結(jié)果，且為下一步的鑒定提供菌株；第四是新的鑒定方法的使用，如MALDI- TOF MS 技術(shù)及基因測序技術(shù)的應(yīng)用等，提高了病原菌的鑒定準(zhǔn)確性與時效性；第五是需不斷學(xué)習(xí)新知識，更新理論知識，學(xué)習(xí)少見菌及罕見菌的用藥指南，對指導(dǎo)臨床用藥治療提供幫助。最后，敏感藥物的足量全程治療是徹底治愈骨關(guān)節(jié)感染的關(guān)鍵，否則感染會反復(fù)發(fā)作。