原發(fā)性IgA腎病患者血清miR-181b水平表達(dá)與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性分析

沈偉興，湯佳瑾，傅 鵬（上海市市東醫(yī)院.腎內(nèi)科；.重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200438）

原發(fā)性免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)腎病是因腎小球系膜區(qū)IgA 沉積腎小球引起的病理改變，患者主要表現(xiàn)為血尿、蛋白尿及腎功能損害，病情嚴(yán)重程度不一[1]。資料顯示[2]，原發(fā)性IgA 腎病占原發(fā)性腎小球疾病患者的45%～50%，是引發(fā)終末期腎臟病的主要原因之一。目前，原發(fā)性IgA 腎病的診斷和病情評(píng)估主要依靠腎活檢組織病理學(xué)及免疫病理分析，而腎活檢具有較大的創(chuàng)傷性，易引發(fā)出血并發(fā)癥[3]。目前國(guó)內(nèi)、國(guó)際上對(duì)原發(fā)性IgA 腎病病情嚴(yán)重程度、預(yù)后的評(píng)價(jià)缺少簡(jiǎn)單、有效的指標(biāo)，尋找到無(wú)需腎穿、簡(jiǎn)單易得的生物標(biāo)志物評(píng)估IgA 腎病的嚴(yán)重程度及預(yù)后成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛參與機(jī)體生理、病理調(diào)控的非編碼蛋白質(zhì)小分子RNA。有研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，微小RNA 181b(microRNA-181b, miR?181b)參與慢性腎臟疾病的病理生理過(guò)程，可作為IgA 腎病患者病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物之一，但有關(guān)IgA 腎病患者miR?181b 表達(dá)與其病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性分析仍較為缺乏。本研究回顧性分析了107 例原發(fā)性IgA 腎病患者的臨床資料，分析血清miR-181b 水平表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度、預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析上海市市東醫(yī)院2015年6月～2017年11月收治的原發(fā)性IgA 腎病患者107 例的臨床資料，其中男性72 例、女性35 例；年齡27～63 歲，平均年齡41.26±6.94 歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《原發(fā)性IgA 腎病診治循證指南(2016)》[6]中診斷標(biāo)準(zhǔn)：腎臟病理光鏡下可見(jiàn)彌漫性系膜增生或局灶節(jié)段增生性腎小球腎炎，免疫熒光可見(jiàn)系膜區(qū)IgA 或以IgA 為主的免疫復(fù)合物沉積。②年齡＞18 歲。③臨床資料完善。④完成至少2年隨訪。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有腎活檢史、免疫抑制劑應(yīng)用史者。②非腎臟因素如腫瘤、肝病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等引起的非原發(fā)性IgA 腎病者。

1.2 儀器與試劑 10g/dl 福爾馬林；德國(guó)Leica DM3000 顯微鏡；離心機(jī)；TRIzol?LS 試劑盒(上海索寶生物)；紫外分光光度計(jì)(北京紐比特科技)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上?？道噬?。

1.3 方法

1.3.1 分組：①病情評(píng)估：根據(jù)患者腎臟病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行判定和分組：用10g/dl 福爾馬林固定腎活檢組織標(biāo)本，石蠟包埋，制成厚度2 μm 的切片，常規(guī)進(jìn)行HE 染色，觀察光鏡(×200)下腎組織病理變化。根據(jù)腎小管間質(zhì)損害程度將患者分為輕度、中度和重度，其中腎小管間質(zhì)損害包括腎小管萎縮(腎小管基底膜不規(guī)則增厚伴管徑減小)、間質(zhì)炎癥(皮質(zhì)間質(zhì)內(nèi)間質(zhì)炎癥細(xì)胞增多)、間質(zhì)纖維化(皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)增多造成腎小管分離)，分別計(jì)0分(無(wú))、1 分(局灶，<50%病理區(qū)域受累)、2 分(彌漫，累及≥50%病理區(qū)域)，3 項(xiàng)的評(píng)分之和為腎小管間質(zhì)損害評(píng)分，在0～6 分?？偡? 分或l分者納入輕度組，2 分者納入中度組，≥3 分者納入重度組。②預(yù)后評(píng)估：患者均通過(guò)電話聯(lián)合門診復(fù)查的形式進(jìn)行隨訪，隨訪2年后進(jìn)行血肌酐和腎小球?yàn)V過(guò)率檢測(cè)。隨訪終點(diǎn)為復(fù)合終點(diǎn)，患者血肌酐水平較基礎(chǔ)值升高至少50%或發(fā)展為終末期腎病(接受維持性血液透析治療或腎小球?yàn)V過(guò)率＜15 ml/(min·1.73m2)或死亡，為預(yù)后較差；未出現(xiàn)上述3 項(xiàng)中任一項(xiàng)，為預(yù)后良好。

1.3.2 血清miR-181b 水平檢測(cè)：采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 法測(cè)定。抽取肘靜脈血10 ml，3 500 r/min，離心15 min 后留取上層血清。加入到TRIzol?LS 試劑盒中提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度及純度。將2 μg 總RNA加至反轉(zhuǎn)錄試劑盒中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。所得產(chǎn)物進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增，條 件 為95 ℃30 s，60 ℃20 s，72℃20 s，循環(huán)40 次。miR-181b 上游引物序列：5’GCGGATCATTCATTGCTGTCG3’，下游引物序列：5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’。以U6 作為內(nèi)參，內(nèi)參上游引物序列：5’CTCGCTTCGGCAGCACATA3’，下游引物序列：5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’。受試者血清miR-181b 檢測(cè)結(jié)果采用2-△△Ct表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，比較采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素的方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性采用Spearman相關(guān)法。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic curve, ROC)曲線分析血清miR-181b水平對(duì)原發(fā)性IgA 腎病疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 病情嚴(yán)重程度與血清miR-181b 的相關(guān)性 107例原發(fā)性IgA 腎病患者中輕度35 例、中度46例、重度26例。輕度、中度和重度患者的血清miR-181b水平分別為(1.47±0.41)×2-△△Ct，(1.89±0.58)×2-△△Ct和(2.69±0.67)×2-△△Ct，經(jīng)單因素的方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.765，P<0.05）。經(jīng)Spearman 相關(guān)分析，病情嚴(yán)重程度與血清miR-181b 呈正相關(guān)(r=0.801，P=0.000)，病情越嚴(yán)重，血清miR-181b 水平越高。

2.2 預(yù)后與血清miR-181b 的相關(guān)性 107 例原發(fā)性IgA 腎病患者隨訪2年后，預(yù)后良好88 例、預(yù)后較差19 例。預(yù)后良好組和預(yù)后較差患者的血清miR-181b 水平分別為（1.73±0.52）×2-△△Ct，（2.95±0.74）×2-△△Ct，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.193，P<0.05)。經(jīng)Spearman 相關(guān)分析，預(yù)后與血清miR-181b 水平呈正相關(guān)(r=0.494，P=0.000)，預(yù)后越差，血清miR-181b 水平越高。

2.3 血清miR-181b 水平對(duì)病情嚴(yán)重程度、預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 將輕度和中度患者賦值“0”、重度患者賦值“1”，預(yù)后良好患者賦值“0”、預(yù)后較差患者賦值“1”，血清miR-181b 水平原始數(shù)據(jù)錄入后分別繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示血清miR-181b 預(yù)測(cè)原發(fā)性IgA 腎病病情嚴(yán)重程度的ROC 曲線下面積 為0.886(95%CI：0.717～0.966，P=0.013)。最 佳臨界值2.25×2-△△Ct，此時(shí)靈敏度為0.892，特異度0.731，見(jiàn)圖1。血清miR-181b 預(yù)測(cè)IgA 腎病預(yù)后的ROC 曲線下面積為0.848(95%CI：0.701～0.925，P=0.020)。最佳臨界值2.48×2-△△Ct，此時(shí)靈敏度為0.873，特異度為0.704，見(jiàn)圖2。

圖1 血清miR-181b 預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度的ROC 曲線

圖2 血清miR-181b 預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC 曲線

3 討論

IgA 腎病缺乏特異性癥狀，患者多表現(xiàn)為無(wú)癥狀血尿、蛋白尿，但也有部分患者無(wú)明顯癥狀，直至發(fā)展為終末期腎病才被發(fā)現(xiàn)[7]。據(jù)報(bào)道[8]，30 歲以上的IgA 腎病患者中50%在確診時(shí)已發(fā)生3 ～5期的慢性腎臟病，其中20%～40%會(huì)在后續(xù)進(jìn)一步發(fā)展為終末期腎病。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，IgA 腎病的發(fā)生與異常糖基化IgA1 的形成、血循環(huán)免疫復(fù)合物沉積、腎小管基底膜增厚、間質(zhì)炎癥和纖維化、腎小管細(xì)胞凋亡等多種病理生理有關(guān)。

miRNA 是內(nèi)源非編碼RNA，對(duì)基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，參與各種生物學(xué)過(guò)程，如代謝、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖和凋亡等[11]。專家發(fā)現(xiàn)[12]，疾病狀態(tài)下的miRNA 表達(dá)譜會(huì)發(fā)生變化，且可通過(guò)靶向途徑影響多種疾病包括慢性腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。張翠平等[13]的研究表明，兒童原發(fā)性腎病綜合征患者的尿液外泌體中miR-23b-3p 濃度明顯高于健康對(duì)照組，且經(jīng)治療后降低，可作為兒童原發(fā)性腎病綜合征輔助診斷和治療效果監(jiān)測(cè)的潛在指標(biāo)。吳忠璟[14]的研究認(rèn)為，糖尿病腎病患者的血清miR-135b 異常升高，且與患者腎臟損傷及預(yù)后不良有關(guān)。miR-181b 是miRNA 中的其中之一，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)[15-16]，特異敲除小鼠的miRNA 酶基因可減緩小鼠腎臟腎小球硬化、蛋白尿和慢性腎衰竭進(jìn)展，表明miRNA 對(duì)腎臟疾病的病理生理過(guò)程有重要調(diào)節(jié)作用。miR-181b 是miR-181 家族成員，參與腎組織損傷過(guò)程。國(guó)外研究表明[17]，miR-181b 可調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而影響腎臟疾病嚴(yán)重程度。Lü 等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)，封閉人近端腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的miR-181b 后，腎小管上皮細(xì)胞對(duì)藥物中毒性腎損傷的抵抗力增強(qiáng)。上述幾項(xiàng)研究均表明，miR-181b 在腎臟疾病發(fā)病過(guò)程中起到重要調(diào)控作用。王琳琳等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者的血清miR-181b 顯著高于2 型糖尿病患者，提示miR-181b 可能參與2型糖尿病患者進(jìn)展為糖尿病腎病的過(guò)程。該研究還進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清miR-181b 與糖尿病腎病嚴(yán)重程度呈顯著相關(guān)性，且采用血清miR-181b預(yù)測(cè)糖尿病腎病的ROC 曲線下面積達(dá)0.911，具有較高的診斷效能，提示血清miR-181b 在糖尿病腎病的診斷和病情評(píng)估中具有較大價(jià)值。

本研究中不同病情嚴(yán)重程度及不同預(yù)后患者血清miR-181b 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)Spearman相關(guān)分析證實(shí)，IgA 腎病嚴(yán)重程度及預(yù)后均與血清miR-181b 水平呈顯著相關(guān)性，病情越嚴(yán)重，預(yù)后越差，血清miR-181b 越高。miR-181b 在IgA 腎病發(fā)生和進(jìn)展中的參與和調(diào)控機(jī)制尚不明確，但有研究指出[20]，miR-181b 可能是通過(guò)間接或直接作用對(duì)收縮壓和尿微量清蛋白/肌酐比值進(jìn)行調(diào)控從而影響IgA 腎病的嚴(yán)重程度與預(yù)后，但具體機(jī)制仍不明確?；|(zhì)金屬蛋白酶是一組參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的肽酶，其中組織金屬蛋白酶抑制因子3(tissue inhibitors of metalloproteinases-3, TIMP3) 的3’-UTR具有兩個(gè)miR-181b 高度保守的同源位點(diǎn)(位點(diǎn)1，2)[21-22]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[23]，在表達(dá)miR-181b 的肝細(xì)胞中觀察到TIMP3 蛋白水平下降50%左右，而耗盡miR-181b 細(xì)胞后，TIMP3 蛋白和RNA 表達(dá)水平分別提高約50%和60%。這一結(jié)果說(shuō)明，TIMP3 是miR-181b 的 靶 標(biāo)，miR-181b 在mRNA和/或蛋白質(zhì)水平上對(duì)TIMP3 表達(dá)進(jìn)行干擾，這也是miR-181b 影響IgA 腎病病情的主要機(jī)制，血清miR-181b 水平越高，對(duì)TIMP3 的抑制作用越強(qiáng)，對(duì)腎臟的損害越重[24]。繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清miR-181b 分別＞2.25×2-△△Ct和2.48×2-△△Ct時(shí)對(duì)重度IgA 腎病、較差預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值最高。另外，其與活體腎組織病理檢查相比創(chuàng)傷性大幅減輕，操作簡(jiǎn)便，臨床適用性較高，可通過(guò)血清檢測(cè)為病情和預(yù)后評(píng)估提供參考。

本研究局限性：①為單中心回顧性研究，且集中在橫斷面，缺乏隊(duì)列研究，未能全面考慮隨訪結(jié)果的影響因素，可能造成預(yù)后的有關(guān)結(jié)論存在偏倚。②隨訪時(shí)間相對(duì)較短，而IgA 腎病屬于慢性腎臟疾病，部分患者到達(dá)研究終點(diǎn)的時(shí)間可能較長(zhǎng)，因此到達(dá)終點(diǎn)事件的人數(shù)較少，可能造成結(jié)果偏倚，有待后續(xù)進(jìn)一步延長(zhǎng)隨訪時(shí)間對(duì)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，血清miR-181b 水平與IgA 腎病病情嚴(yán)重程度及預(yù)后均呈顯著相關(guān)性，血清miR-181b越高，病情越重，預(yù)后越差。積極檢測(cè)IgA 腎病患者血清miR-181b 水平可為患者的病情及預(yù)后評(píng)估提供參考。