枸杞皂苷通過調(diào)控Suv39H1/JAK2/STAT3通路對鼻咽癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

胡鵬剛，張昌明(空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，西安 710032)

鼻咽癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，目前的治療方法尚未明顯改善鼻咽癌患者的生存率[1-2]。據(jù)報道組蛋白甲基化酶Suv39H1 作為癌基因與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)中藥皂苷通過下調(diào)促癌基因表達促進鼻咽癌CNE-2 細胞的自噬和凋亡[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在從用植物黃酮處理的癌細胞分離的組蛋白中注意到降低的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2表達和H3K27 的三甲基化[6]。黃芩苷通過下調(diào)Suv39H1 的表達和H3K9 甲基化水平起到抗腫瘤的作用[7]。枸杞皂苷，又名短葶山麥冬皂苷C，其富含皂苷和黃酮等有效成分，通過抑制血管生成，腫瘤增殖、黏附和侵襲，表現(xiàn)出抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[8]。因此，推測枸杞皂苷可能通過調(diào)節(jié)Suv39H1 的表達抑制鼻咽癌發(fā)展。本研究通過枸杞皂苷干預鼻咽癌CNE-2細胞觀察細胞增殖、凋亡、侵襲以及Suv39H1 蛋白表達的變化，旨在為鼻咽癌治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 研究時間為2019年8月～2020年9月，人鼻咽癌細胞系（HONE1，C666-1，CNE-1和CNE-2）和人鼻咽上皮細胞（NP69）購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，在溫度為37℃，5 %（v/v）CO2，濕潤的細胞培養(yǎng)箱中孵育。從得到組織病理學證實的15 例患者（男性，年齡32.46 ±9.77 歲）收集鼻咽癌組織和鄰近組織樣品。所有患者均未接受放療或化療，沒有其他疾病和腫瘤。所有鼻咽癌患者均簽署了知情同意書。本研究經(jīng)西安交通大學醫(yī)學部倫理委員會批準。動物實驗程序嚴格按照機構(gòu)動物護理和使用委員會批準的方案進行。

1.2 儀器與試劑 枸杞皂苷（西安康諾化工有限公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Hyclone 公司；青霉素-鏈霉素、0.25g/dl 胰蛋白酶/EDTA 消化液（美國Sigma 公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000 購自美國Sigma 公司；JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 及Suv39H1 等一抗及相應二抗（美國Santa Cruz 公司）；RT-qPCR 試劑盒RNA 提取試劑盒，RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，蛋白提取試劑盒，引物合成由上海生工合成；Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo 公司；CCK-8 試劑盒，Annexin V-FITC 檢測試劑盒，Transwell 小室（美國Millipore 公司）；高通量實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Roche 公司，瑞士），Western blot系統(tǒng)（北京六一儀器廠DYY-7C），臺式低溫高速離心機（日本KUBOTA 公司），細胞培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器公司），流式細胞儀（美國Beckman 公司），凝膠成像分析儀（廣州瑞豐實驗設備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及分組：將鼻咽癌細胞CNE-2 復蘇后，置于含10ml/dl 胎牛血清和1g/dl 青鏈霉素（100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素）的RPMI-1640 培養(yǎng)液于37℃，5%（v/v） CO2恒溫箱中培養(yǎng)。當細胞匯合至70%時，用不同濃度枸杞皂苷（0，2.5，5，10，50，100 和200μmol/L）分別處理細胞24 h 檢測細胞活力，篩選合適濃度；使用5，10 和50μmol/L 的枸杞皂苷分別干預細胞，在0，24，48 和72 h 時檢測細胞增殖，48 h 后檢測細胞凋亡率和侵襲率；將pcDNA-Suv39H1 和Suv39H1 siRNA 分別轉(zhuǎn)染于細胞內(nèi)，檢測細胞增殖、凋亡和侵襲；轉(zhuǎn)染pcDNA-Suv39H1 載體于細胞中，24 h后使用50 μmol/L 枸杞皂苷干預細胞，48 h 后檢測細胞增殖、凋亡和侵襲。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染：Suv39H1 過表達載體（pcDNASuv39H1）和針對Suv39H1 的siRNA（Suv39H1 siRNA）均獲自上海生工公司（中國上海）。轉(zhuǎn)染前，使用1g/dl 胰蛋白酶處理消化細胞。在血液計數(shù)室中計數(shù)后，將細胞接種到六孔培養(yǎng)板上24 h，然后以40%～60%匯合率轉(zhuǎn)染。所有轉(zhuǎn)染均使用Lipofectamine?3000 根據(jù)制造商的說明進行。轉(zhuǎn)染后48 h，收獲細胞并進行下一步分析。

1.3.3 實時熒光定量-PCR：檢測組蛋白甲基轉(zhuǎn)移 酶Suv39H1 的mRNA水平，按照TRIZOL 試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，并用紫外分光光度計檢測RNA 的純度和濃度。隨后，使用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄各組檢測基因，并使用SYBR Green PCR Master Mix 擴增反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物，以β-actin 作為內(nèi)參基因。Suv39H1 上游引物：5’-GGTGGTGGGGAAGAAGCTGG-3’；下游引物：5’-TCCCACCTCTCCACGAAGTT-3’。β-actin 上游引物：5’-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3’；下游引物：5’-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’。采 用Applied Biosystems 7900HT qPCR 系統(tǒng)按照以下參數(shù)進行qPCR：95℃預變性2 min，94℃變性15 s，55℃退火25 s，在72℃延伸15 s，進行35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1g/dl 瓊脂糖凝膠電泳檢測，依據(jù)2-ΔΔCt法計算各樣本mRNA 的相對表達量。

1.3.4 Western blot 檢測法：檢測Suv39H1 和JAK2/ STAT3 通路蛋白JAK2，p-JAK2，STAT3 和p-STAT3的表達。將各組細胞按照每孔1×105的密度接種于6 孔板，24 h 后采用蛋白質(zhì)定量（bicinchoninic acid，BCA）法進行蛋白定量，各取30μl 樣品進行十二烷基硫酸鈉聚炳烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），再將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，5g/dl 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入I 抗，4℃孵育過夜。加入II 抗（1∶ 1 000，ab150077）37℃ 孵育45 min，用ECL 液顯影，使用化學發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，隨后結(jié)果采用Image-Pro Plus 6 軟件（Media Cybernetics）分析，以待測蛋白與內(nèi)參照GAPDH 的灰度值比值作為蛋白的相對表達量。

1.3.5 CCK-8 實驗檢測細胞活力：將各組細胞按照每孔1×105的密度接種于96 孔板中，用含10ml/dl胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液制成單細胞懸液，置于37℃、5%（v/v）CO2的條件下培養(yǎng)。每組設5個復孔，加入20 μl CCK-8 溶液。培養(yǎng)24 h，于酶標儀450 nm 處檢測吸光度（A）值。取5 孔A值的平均數(shù)，按照下列公式計算細胞相對活力：細胞相對活力（%）=處理組A/對照組A×100%。

1.3.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：根據(jù)制造商說明使用雙染凋亡試劑盒Annexin-V FITC/PI處理細胞，于1 h 內(nèi)，在流式細胞儀上使用Beckman CXP 軟件檢測細胞凋亡情況。

1.3.7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力：在Transwell 上室加入300 μl 預溫的無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液，使用無血清培養(yǎng)液將待測細胞制成濃度為1×106/ml 的單細胞懸液，取細胞懸液100～200 μl加入Transwell 上室中，并于下室中加入500 μl 含10ml/dl 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)細胞12～24 h，使用0.5g/dl 的結(jié)晶紫對上室底部細胞進行染色，用棉簽除去上室內(nèi)側(cè)細胞，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并統(tǒng)計細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。采用ANOVA 方差分析、Dunnett-t法比較總體和總體中兩樣本均數(shù)之間的差異。以P＜0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察枸杞皂苷對鼻咽癌CNE-2 細胞生物學行為的影響 與0 μmol/L 枸杞皂苷干預組比較，不同濃度枸杞皂苷干預劑量依賴性降低CNE-2 細胞活力（P＜0.01），見表1。與對照組比較，5，10 和50 μmol/L枸杞皂苷干預組CNE-2 細胞增殖力呈劑量依賴性顯著降低，ANOVA 比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。與對照組相比，5，10 和50 μmol/L 枸杞皂苷干預組CNE-2細胞凋亡率呈劑量依賴性增加至（15.70±1.18）%（F=5.232，P=0.026 1），細胞侵襲數(shù)劑量依賴性減少至（32.66±2.51）%（F=4.807，P=0.031 5），ANOVA 比較差異均具有統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1 枸杞皂苷對鼻咽癌CNE-2 細胞凋亡和侵襲的影響

表1 不同濃度枸杞皂苷干預后CNE-2 細胞活力（n=3，±s）

表1 不同濃度枸杞皂苷干預后CNE-2 細胞活力（n=3，±s）

指標不同濃度枸杞皂苷（μmol/L）F P 0 5 10 50 100 200細胞活力% 100.00 83.03±6.34 75.92±5.88 68.20±6.03 46.22±4.19 27.08±2.21 91.7 0.00

表2 不同濃度枸杞皂苷干預CNE-2 細胞后的細胞增殖力比較（n=3，±s）

表2 不同濃度枸杞皂苷干預CNE-2 細胞后的細胞增殖力比較（n=3，±s）

時間（h） 對照組不同濃度枸杞皂苷（μmol/L）干預組F P 5 10 50 0 0.26±0.03 0.25±0.03 0.25±0.02 0.26±0.04 0.035 0.990 5 24 0.51±0.03 0.46±0.05 0.40±0.04 0.33±0.03 4.090 0.049 3 48 0.79±0.06 0.68±0.04 0.62±0.03 0.51±0.04 7.100 0.012 1 72 1.22±0.08 1.01±0.06 0.82±0.07 0.63±0.08 12.030 0.002 5

2.2 不同劑量枸杞皂苷對鼻咽癌CNE-2 細胞中Suv39H1 表達的影響 見圖2。與對照組相比，枸杞皂苷干預組CNE-2 細胞中Suv39H1 的mRNA（F=25.75，P= 0.000 2）和蛋白（F=14.64，P= 0.001 3）表達均隨著枸杞皂苷濃度增加而減少，ANOVA 比較差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 Western blot 檢測CNE-2 細胞中Suv39H1 蛋白表達

2.3 組蛋白甲基化酶Suv39H1 在鼻咽癌中高表達 本實驗通過Western blot 測定15 對鼻咽癌患者腫瘤組織和相鄰非腫瘤組織中Suv39H1 的表達水平。結(jié)果顯示，與正常組織（normal）相比，Suv39H1 在鼻咽癌組織中高表達，unpaired-t檢驗比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3A。與正常鼻咽上皮細胞（NP69）相比，Suv39H1 在鼻咽癌細胞系（HONE1，C666-1，CNE-1 和CNE-2）中高表達，Dunnett-t檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3B。

圖3 組蛋白甲基化酶Suv39H1 在鼻咽癌細胞和 組織中的表達

2.4 組蛋白甲基化酶Suv39H1 對CNE-2 細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 見表3。本實驗測得轉(zhuǎn)染pcDNA-Suv39H1 過表達效率為pcDNA-3.1 組的3.16±0.22 倍，轉(zhuǎn)染Suv39H1 siRNA干擾效率為NC siRNA 組 的0.33±0.06 倍（Dunnett-t檢驗，P＜0.01）。與pcDNA-3.1 組比較，pcDNASuv39H1 組CNE-2 細胞增殖力以及細胞侵襲數(shù)（圖4B）明顯增加，細胞凋亡率顯著降低（圖4A），Dunnett-t檢驗比較差異具有統(tǒng)計學意義；與對照組及NC siRNA 組比較，Suv39H1 siRNA 組CNE-2細胞在450 nm 處吸光度值以及細胞侵襲數(shù)（圖4B）顯著降低，細胞凋亡率明顯增加（圖4A），Dunnett-t檢驗比較差異具有統(tǒng)計學意義。

圖4 轉(zhuǎn)染pcDNA-Suv39H1 和Suv39H1 siRNA對CNE-2 細胞侵襲和凋亡的影響

表3 轉(zhuǎn)染pcDNA-Suv39H1 和Suv39H1 siRNA 后CNE-2 細胞增殖力比較（n=3，±s）

表3 轉(zhuǎn)染pcDNA-Suv39H1 和Suv39H1 siRNA 后CNE-2 細胞增殖力比較（n=3，±s）

時間（h） 對照組 pcDNA-3.1 pcDNA-Suv39H1 NC siRNA Suv39H1siRNA F P 0 0.25±0.03 0.26±0.02 0.24±0.03 0.23±0.04 0.25±0.03 0.175 0.911 24 0.53±0.05 0.57±0.03 0.69±0.04 0.55±0.03 0.36±0.04 9.333 0.002 48 0.76±0.05 0.74±0.06 1.14±0.03 0.71±0.04 0.53±0.04 24.38 0.000 72 1.23±0.09 1.27±0.07 2.09±0.11 1.19±0.06 0.66±0.07 39.10 0.000

2.5 枸杞皂苷干預通過Suv39H1 對CNE-2 細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 見表4。與50 μmol/L 枸杞皂苷干預+pcDNA-3.1 組相比，50 μmol/L 枸杞皂苷干預+pcDNA-Suv39H1 組CNE-2 細胞吸光度顯著降低（Dunnett-t檢驗，P＜0.01）。與50 μmol/L枸杞皂苷干預+pcDNA-3.1 組比較，50 μmol/L 枸杞皂苷干預+pcDNA-Suv39H1 組CNE-2 細胞凋亡率明顯降低，細胞侵襲數(shù)顯著增加，Dunnett-t檢驗差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖5。

圖5 枸杞皂苷通過下調(diào)Suv39H1 抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲并促進細胞凋亡

表4 枸杞皂苷干預轉(zhuǎn)染pcDNA-Suv39H1 的CNE-2 細胞增殖力比較（n=3，±s）

表4 枸杞皂苷干預轉(zhuǎn)染pcDNA-Suv39H1 的CNE-2 細胞增殖力比較（n=3，±s）

時間（h） 對照組 50μmol/L 枸杞皂苷干預組50μmol/L 枸杞皂苷干預+pcDNA-3.1 50μmol/L 枸杞皂苷干預+pcDNA-Suv39H1 F P 0 0.25±0.03 0.23±0.03 0.25±0.05 0.25±0.04 0.073 0.973 24 0.53±0.05 0.31±0.03 0.34±0.04 0.52±0.04 19.7 0.000 48 0.71±0.06 0.54±0.05 0.57±0.06 0.71±0.05 18.72 0.000 72 1.28±0.11 0.61±0.07 0.66±0.09 1.18±0.10 53.63 0.000

2.6 枸杞皂苷干預對JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達的影響 見圖6。與對照組相比，枸杞皂苷干預組JAK2/STAT3 通路蛋白p-JAK2 和p-STAT3 的表達均被顯著抑制，Dunnett-t檢驗差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與枸杞皂苷干預+pcDNA-3.1 組相比，枸杞皂苷干預+pcDNA-Suv39H1 組p-JAK2和p-STAT3 的蛋白表達明顯增強，Dunnett-t檢驗比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01）。

圖6 枸杞皂苷干預細胞后JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達

3 討論

鼻咽癌是遺傳因素、病毒感染和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，放療是主要治療手段，但30%以上的晚期鼻咽癌患者仍治療失敗[9]。所以致力于開發(fā)治療鼻咽癌更有效更安全的藥物是十分必要的。本研究探討了枸杞皂苷對鼻咽癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并探究通過下調(diào)Suv39H1 表達發(fā)揮對腫瘤細胞增殖和侵襲的抑制作用，進而改善鼻咽癌治療進展。

傳統(tǒng)中藥的開發(fā)已成為新藥研發(fā)的途徑之一，許多中藥及其活性成分可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。WANG 等[10]研究表明人參皂苷Rg3 可能通過調(diào)節(jié)MMP-2，MMP-9 和EMT 相關(guān)基因的表達抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲。枸杞皂苷作為癌癥治療的熱點藥物具有抑制腫瘤增殖抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。HE等[11]報道枸杞皂苷通過調(diào)節(jié)脂肪細胞與乳腺癌細胞之間的相互作用抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。此外，1，5，10，30 和50 μmol/L 枸杞皂苷以非肌肉肌球蛋白IIA（NMIIA）作為靶標，通過劑量依賴性下調(diào)其表達預防肺癌轉(zhuǎn)移[12]。本研究表明枸杞皂苷干預對鼻咽癌CNE-2 細胞有明顯的增殖抑制作用，呈劑量依賴性（5，10，50，100 和200μmol/L）抑制CNE-2 細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡。

越來越多的研究表明，基因突變及表觀遺傳學改變是腫瘤發(fā)病的重要機制。其中，組蛋白修飾的異?？墒贡碛^遺傳學調(diào)控失衡，導致疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。表觀遺傳的改變是可逆的，這就為疾病的治療提供了靶點。組蛋白H3K9 特異性甲基化酶Suv39H1 可催化組蛋白H3K9 三甲基化，參與異染色質(zhì)形成，是表觀遺傳學及染色體研究領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)[14]。目前認為Suv39H1 不僅與染色體的分離和穩(wěn)定性有關(guān)，也能影響腫瘤抑制蛋白Rb，導致腫瘤發(fā)生[15]。RODRIGUES 等[16]研究表明Suv39H1 和H3K9me3 水平升高的患者，宮頸癌復發(fā)率明顯增高。Suv39H1 在前列腺癌中表達升高，并促進前列腺癌細胞的遷移[17]。本研究表明枸杞皂苷能夠通過下調(diào)Suv39H1 表達抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲。提示Suv39H1 在鼻咽癌的發(fā)生過程中可能起到了促進的作用。

JAKs 家族JAK 是一類重要的酪氨酸激酶，下游信號是STAT，是信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子，也是一類具有信號轉(zhuǎn)導功能和轉(zhuǎn)錄活化功能的細胞脂蛋白[18]。研究顯示，多種人類腫瘤中有該家族成員的異常激活，尤其是STAT1，STAT3 和STAT5[19]。其中STAT3 可通過自身活化的增強以及下游基因表達的變化來抑制凋亡，促進細胞增殖，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20]。據(jù)報道當JAK2/STAT3 途徑持續(xù)激活，可導致鼻咽癌細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，可能與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的機制相關(guān)聯(lián)[21]。此外，有研究報道在骨髓增殖性腫瘤中上調(diào)Suv39H1 的表達，JAK2的表達顯著增加[4]。黃芪甲苷通過JAK2/STAT3 途徑被證明是氣道慢性炎癥性肺病和血管生成的重要調(diào)節(jié)劑[22]。本研究表明，當枸杞皂苷干預鼻咽癌CNE-2 細胞后，JAK2/STAT3 通路蛋白的表達水平顯著降低，而Suv39H1 過表達能夠逆轉(zhuǎn)該結(jié)果。

綜上所述，本研究表明枸杞皂苷能夠抑制Suv39H1 表達和JAK2/STAT3 信號通路以緩解體外鼻咽癌細胞的增殖和侵襲，有望成為治療鼻咽癌新的靶向藥物。本研究還未對組蛋白甲基化酶Suv39H1 催化組蛋白H3K9 三甲基化的下游靶基因做深入研究，接下來將以表觀遺傳學組蛋白修飾作為后續(xù)研究重點。