GPRC5A對肝癌細胞增殖、凋亡和氧化應激的影響及作用機制探討

陳 偲，王 穎，謝生茂，李忠輝，武建軍

（1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六九醫(yī)院消化內(nèi)分泌科,呼和浩特 010010; 2.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院a.老年病科; b.腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010; 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，呼和浩特 010010 ）

近年隨著基因分子生物學的研究進展，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制復雜，涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活及眾多信號分子通路，基于分子生物學的研究為腫瘤的研究及診治提供了新的方向和思路[1]。G 蛋白偶聯(lián)受體家族C 群5 成員A（G protein coupled receptor C type group 5 member A，GPRC5A）是3-G 蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，以往研究發(fā)現(xiàn)GPRC5A 在多種惡性腫瘤中表達失調(diào)，提示GPRC5A 可能參與腫瘤的進展。GPRC5A 的作用首次在肺癌中被揭示，認為是一種促進生長的基因和一種新的p53 轉(zhuǎn)錄靶點[2]。且研究表明，與鄰近正常組織相比，肺腫瘤組織中GPRC5A 表達下調(diào)[3]，其在肺腺癌中發(fā)揮抑癌作用。而在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)GPRC5A 基因具有高突變率[4]。另據(jù)報道顯示，信號傳導轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在眾多癌細胞中表達顯著上調(diào)，能夠促進癌癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，敲除STAT3 能夠通過刺激腫瘤細胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，提高免疫原性化療的療效[5]。STAT3 在多種癌癥中的表達及功能已被證實，GPRC5A 和STAT3 表達具有相關(guān)性[6]。且證實，GPRC5A 在結(jié)直腸癌組織中高表達，正向調(diào)控STAT3 表達，與結(jié)直腸癌臨床病理關(guān)系密切[6]。提示GPRC5A 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮某種作用。因此，本研究擬探究GPRC5A 在肝癌中的表達及其對肝癌細胞增殖、凋亡及氧化應激的影響，以期為臨床提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年12月～2019年11月在本院行手術(shù)治療的38 例肝癌患者癌組織及其對應癌旁正常組織樣本，均經(jīng)臨床病理確診。人正常肝上皮細胞株HL-7702 和人肝癌細胞株（HepG2，HCCLM3，HuH-7 和MHCC-97H）均購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)液購自Biological Industries 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol 試劑盒購自大連Takara 公司；LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司；實時熒光定量PCR 儀購自Life technologies 公司；BCA 檢測試劑盒、Transwell 小室購自Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗鼠GPRC5A 單抗、兔抗鼠VEGF 單抗、兔抗鼠caspase-3 單抗、兔抗鼠STAT3 單抗、兔抗鼠c-MYC 單抗、兔抗鼠Socs3 單抗和鼠抗GAPDH購自美國Abcam 公司；陰性對照pcDNA3.1 質(zhì)粒，pcDNA3.1-GPRC5A 質(zhì)粒及PCR 引物由武漢金開瑞生物工程有限公司設計合成；酶標儀購自DR-200Bs Diatek 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) : 將實驗肝癌細胞置于含10ml/dl胎牛血清及雙抗RPMI1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱孵育，待細胞融合至85%左右時進行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染: 按照Lipo 2000 試劑盒說明書將陰性對照pcDNA3.1 和pcDNA3.1-GPRC5 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HepG2 細胞，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)48 h，檢測轉(zhuǎn)染效率，實驗重復三次。分組：根據(jù)轉(zhuǎn)染情況分為空白對照組（control 組），pcDNA3.1（對照pcDNA3.1 組），pcDNA3.1-GPRC5（pcDNA3.1-GPRC5A 過表達組）。

1.3.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗：采用Trizol 法提取細胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板配置PCR 擴增反應體系行qRT-PCR 實驗，以β-actin 為內(nèi)參，檢測GPRC5A 相對表達。引物序列如下，GPRC5A 正向：5’-AGCAGGTCTCATCGCAGCTT-3’，反向：5’-ACTTGCGAATCATACGCACG-3’；β-actin 正向：5’-CTGACGATCGATAGTCATATGGC-3’，反 向：5’- agCatacGttGtCacGactCc-3’。2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blotting）實驗：取對數(shù)生長期HepG2 細胞接種于25 cm2培養(yǎng)皿，待細胞融合至80%～90%時進行細胞轉(zhuǎn)染。48 h 后收集各組細胞，加入RIPA 裂解液于冰上裂解，采用BCA 法測定蛋白濃度；取20 mg 蛋白樣品行SDSPAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5g/dl 脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗孵育過夜；次日，TBST 洗膜3次，加HRP 標記二抗，孵育2 h；TBST 洗膜3 次，ECL 顯色觀察。

1.3.5 MTT 細胞增殖實驗: 取對數(shù)生長期HepG2細胞接種于96 孔板，濃度6×105個/孔，培養(yǎng)4h后每孔加入MTT 溶液10 μl，繼續(xù)孵育4 h，采用酶標儀測量570 nm 處吸光度值。實驗重復3 次。

1.3.6 V-FITC/PI 細胞凋亡檢測 ：將pcDNA3.1-GPRC5A 或空載pcDNA3.1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染在HepG2細胞，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)48 h；收集細胞接種在6 孔板，濃度1×106個/孔，根據(jù)V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測，流式細胞儀分析細胞凋亡率。實驗重復3 次。

1.3.7 細胞氧化應激檢測：待細胞轉(zhuǎn)染后用于以下實驗檢測：①ROS 含量檢測：以1×106個/孔接種在6 孔板，48 h 后收集細胞，加入10 μmol/L DCFH-DA 重懸，根據(jù)ROS 檢測試劑盒說明書進行檢測。②NAD+/NADH 檢測：以同樣密度接種于96 孔板，48 h 后收集提取細胞蛋白，按照NAD+/NADH 試劑盒說明書配制檢測液，并加入配置好的樣本液，37℃避光孵育1 h，檢測450 nm 處吸光度值。③ATP 含量檢測：以同樣密度接種于96 孔板，48 h 后收集提取細胞蛋白；按ATP 檢測試劑盒說明書配制檢測液，加入50 μl 樣本液，避光孵育30 min，檢測450 nm 處吸光度值。實驗重復3 次。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用one-way ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。肝癌組織及癌旁正常組織中表達差異采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GPRC5A 在肝癌組織及細胞中的表達 qRTPCR 法檢測肝癌組織、配對正常組織和肝癌細胞、肝正常上皮細胞中GPRC5A 表達，結(jié)果顯示肝癌組織中GPRC5A 表達量（0.34±0.09）顯著低于癌旁正常組織（0.73±0.10），差異有統(tǒng)計學意義（t=17.869，P<0.01），見圖1A；類似地，GPRC5A 在肝癌細胞

HepG2（0.35±0.06），HCCLM3（0.38±0.10），HuH-7（0.53±0.07） 和MHCC-97H（0.67±0.06）中的表達量均顯著低于人正常肝上皮細胞HL-7702中的表達量（1.00±0.08），差異均有統(tǒng)計學意義（t= 11.258，8.386，7.658，5.716，P<0.05，見圖1B），其中HepG2，HCCLM3 細胞中表達最低。因此選擇HepG2 細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 GPRC5A 在肝癌組織和細胞中的表達量

2.2 GPRC5A 過表達對肝癌細胞增殖的影響 經(jīng)實驗檢測顯示，與對照組（1.00±0.10）和pcDNA3.1組（1.02±0.08）相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A組（2.49±0.22）細胞中GPRC5A 表達水平顯著增加（F=101.421，P<0.001），見圖2A 和2B。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A 組（0.94±0.16）36 h 的細胞增殖A值較對照組（1.49±0.05）和pcDNA3.1 組（1.45±0.07）顯著降低（F=25.640，P<0.01），見圖2C。GPRC5A 過表達組（0.98±0.04）細胞上皮增長因子VEGF 表達量較Control 組（2.94±0.15）和pcDNA3.1 組（2.89±0.11）也顯著降低（F= 310.450，P<0.001），見圖2A 和2B。以上結(jié)果說明過表達GPRC5A抑制了肝癌HepG2細胞的增殖。

圖2 過表達GPRC5A 抑制肝癌細胞的增殖

2.3 GPRC5A 過表達對肝癌細胞氧化應激和凋亡的影響 經(jīng)檢測顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A 組（182.12±13.42）細胞中氧化應激相關(guān)因子ROS水平較對照組（101.23±11.20）和pcDNA3.1 組（98.30±10.26）顯著增加（F=49.577，P<0.001）；NAD+/NADH（35.24±6.43） 及ATP（55.34±6.51）水平較對照組（100.25±12.41，100.17±14.36）和pcDNA3.1 組（97.86±9.67，102.23±11.02）顯著降低（F=42.338 和17.077，P<0.05），見圖3A。GPRC5A過表達組（20.70%）細胞凋亡率較對照組（4.70%）和pcDNA3.1 組（5.00%）顯著提高，見圖3B。細胞凋亡蛋白caspase-3（2.61±0.16）表達量較對照組（1.00±0.11）和pcDNA3.1 組（1.01±0.02）也顯著增加（F=202.843，P<0.001），見圖3C。以上結(jié)果說明過表達GPRC5A 促進了HepG2，HCCLM3 細胞的氧化應激，并誘導細胞凋亡。

圖3 過表達GPRC5A 誘導肝癌細胞的氧化應激和凋亡

2.4 GPRC5A 對STAT3/Socs3/c-MYC 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 研究通過轉(zhuǎn)染過表達肝癌細胞中GPRC5A 表達發(fā)現(xiàn)，與對照組（1.00±0.13）和pcDNA3.1 組（1.03±0.12）相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A 組（0.43±0.06）細胞中p-STAT3 表達量顯著降低（F=29.476，P<0.001），見圖4A 和4B；pcDNA3.1-GPRC5A 組下游基因Socs3（0.47±0.05），c-MYC（0.54±0.06）表達量顯著低于對照組（1.01± 0.05，1.00±0.04） 和pcDNA3.1 組（0.98±0.09，1.02±0.06）（F=63.275，75.409，均P<0.001），見圖4A，4C 和4D。進一步研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中STAT3 與GPRC5A 表達量呈顯著負相關(guān)（r=-0.746，P<0.01），見圖4E。以上結(jié)果說明過表達GPRC5A抑制STAT3 的表達，并抑制Socs3/c-MYC 通路的激活。

圖4 過表達GPRC5A 抑制STAT3/Socs3/c-MYC 信號通路激活

2.5 STAT3 介導的Socs3/c-MYC信號通路參與GPRC5A 對肝癌細胞的作用機制 為探究GPRC5A與Socs3/c-MYC 信號通路在肝癌中作用機制，研究在HepG2 細胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A，pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3顯著促進細胞內(nèi)VEGF 蛋白表達（P<0.05），見圖5A；抑制細胞凋亡率（P<0.05），見圖5B；增加細胞內(nèi)IL-6 水平（P<0.05），見圖5C；細胞內(nèi)ROS 水平明顯降低（P<0.05），見圖5D，顯著逆轉(zhuǎn)了pcDNA3.1-GPRC5A 的抑制作用。以上結(jié)果表明STAT3 介導的Socs3/c-MYC 信號通路參與GPRC5A 對肝癌細胞的作用機制。

圖5 STAT3 介導的Socs3/c-MYC 信號通路抑制卵巢癌細胞的氧化應激和凋亡

3 討論

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，高死亡率，是全世界癌癥相關(guān)死亡率的第三大常見原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，遺傳、表觀遺傳改變、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素、吸煙、肥胖和糖尿病等是肝癌的主要危險因素[7-8]。高復發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率是肝癌患者預后差的主要原因[9]。因此，基于分子生物學角度找尋特異性分子靶標對肝癌臨床診治及攻克具有顯著意義。

研究發(fā)現(xiàn)，GPRC5A 異常表達與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。GPRC5A 在肺組織中異常低表達，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展進程[3]。GPRC5A 通過激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號導致MDM2 失調(diào)，促進肺腫瘤的發(fā)展[11]。GPRC5A 通過調(diào)節(jié)細胞周期促進前列腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。GPRC5A 通過介導細胞氧化應激反應促進了喉癌的進展[13]。提示GPRC5A 在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演原癌或抑癌基因作用。而本研究檢測表明GPRC5A 在肝癌組織和細胞中顯著低表達，GPRC5A 過表達顯著抑制了肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡和氧化應激。

最近研究表明，GPRC5A 功能障礙發(fā)生在多種與人類癌癥相關(guān)的途徑中，包括NF-κB，F(xiàn)AK/SCR 和STAT3 途徑[3]。STAT3 被認為是癌癥治療的重要靶點，易在各種惡性腫瘤中被激活[14]。研究發(fā)現(xiàn)，化合物K 通過調(diào)控STAT3 誘導人肝癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡[15]。MEST 通過STAT3 激活誘導乳腺癌中twist-1 介導的EMT，STAT3，Twist 和EMT標記物可作為防治乳腺癌的潛在分子靶點[16]。此外，BRM 轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-302a-3p 靶向SOCS5/STAT3 信號軸，增強胰腺癌轉(zhuǎn)移[17]。GPRC5A 過表達抑制了IL-6 誘導的STAT3 活化，抑制了細胞生長，阻止了頭頸部鱗狀細胞癌的進一步惡化。同樣，在本研究中探究發(fā)現(xiàn)GPRC5A 抑制了STAT3的表達，而STAT3 促進了肝癌細胞的增殖，兩者表達呈顯著負相關(guān)，這表明STAT3 在促進肝癌的發(fā)展中起著重要作用。

據(jù)報道，IL-6 激活的STAT3/Socs3 軸促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。研究發(fā)現(xiàn)，MiR-203 通過靶向SOCS3 調(diào)控JAK-STAT 通路影響胰腺癌細胞增殖和凋亡[19]。認為STAT3 和SOCS3 之間存在負反饋，這可能通過抑制特異性細胞因子和凋亡信號的產(chǎn)生在T 細胞淋巴瘤中發(fā)揮致癌作用。此外，STAT3和c-MYC 在人胃癌組織和細胞中上調(diào)，c-MYC 的敲除抑制胃癌細胞的增殖和糖酵解，提示STAT3/c-MYC 可能是胃癌潛在的治療靶點[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，GPRC5A 過表達能夠下調(diào)STAT3 及下游基因Socs3，c-MYC 表達量，抑制Socs3/c-MYC 通路激活，當同時共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3 時，GPRC5A 過表達對肝癌細胞的作用被完全逆轉(zhuǎn)，提示STAT3 介導的Socs3/c-MYC 信號通路參與GPRC5A 對肝癌細胞的作用機制，靶向STAT3/Socs3/c-MYC 通路可能是肝癌潛在的腫瘤治療方法。本研究初步探明了GPRC5A 對肝癌細胞生物學行為及氧化應激的影響，揭示了其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達作用機制，為臨床肝癌的研究治療提供了新的分子靶標，具有可推廣性。然而腫瘤發(fā)生的機制復雜，其中涉及分子通過的異常激活或失活，本研究雖證實GPRC5A 通過調(diào)控STAT3 介導的Socs3/c-MYC 信號通路發(fā)揮作用，但其更深入的調(diào)控機制還需進一步探究闡明。

綜上所述，肝癌細胞中GPRC5A 顯著低表達，GPRC5A 過表達能夠抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞氧化應激及凋亡，其通過調(diào)節(jié)STAT3 介導的Socs3/c-MYC 信號通路和NLRP3 炎癥小體參與調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，提示GPRC5A 可作為新的與肝癌細胞增殖、氧化應激和凋亡相關(guān)的生物標志物。進一步探究GPRC5A 的功能作用，有助于為人類惡性腫瘤的治療找尋新的治療途徑。