高山杜鵑離體葉片高效再生及其再生途徑研究

彭綠春，廖多思，解瑋佳，宋 杰，蔡艷飛，張 露，李世峰

（1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南花卉技術(shù)工程研究中心，昆明 650205；2寧南縣林業(yè)和草原局，四川 涼山 615400）

0 引言

杜鵑花屬是世界著名的木本花卉。高山杜鵑是指利用杜鵑花屬中常綠杜鵑亞屬種質(zhì)資源育成的一些革質(zhì)、常綠、花冠碩大的品種類型[1]，其觀賞價(jià)值高，近年來(lái)成為中國(guó)年宵花和高檔園林造景的新秀，高山杜鵑新品種培育在國(guó)內(nèi)也日益引起重視[2]。因在打破種間雜交障礙、定向選育方面較常規(guī)雜交育種表現(xiàn)的優(yōu)越性，基因工程技術(shù)已成為現(xiàn)今杜鵑花育種的熱點(diǎn)問(wèn)題[3]。葉片是遺傳轉(zhuǎn)化和細(xì)胞操作的常用受體材料[4-6]，建立高效、穩(wěn)定的離體葉片再生植株體系和發(fā)掘再生能力強(qiáng)的基因型，是杜鵑花基因工程育種成功的關(guān)鍵。

目前，杜鵑花植株離體再生方面的研究很多，但以離體葉片為材料進(jìn)行的植株再生研究較少，主要涉及基本培養(yǎng)基類型、激素種類和濃度等方面[7-9]。研究認(rèn)為低鹽濃度的Anderson培養(yǎng)基、Read培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基適用于大多數(shù)杜鵑的離體培養(yǎng)[10-12]。外源激素的選用主要是TDZ和ZT，且針對(duì)不同基因型杜鵑花離體葉片再生，2種激素誘導(dǎo)效果差異大。Zaytseva等[13]用 TDZ誘導(dǎo)Rhododendron sichotense和Rhododendron catawbiense‘Grandiflorum’的離體葉片再生不定芽，再生頻率分別達(dá)93%和85%，且再生的芽均起源于葉片近軸面的表皮細(xì)胞，但前者來(lái)源于突起，而后者來(lái)源于胚狀體結(jié)構(gòu)。劉燕等[14]認(rèn)為TDZ較ZT和2-iP更有利于桃葉杜鵑誘導(dǎo)愈傷組織。汪玲敏等[15]則認(rèn)為誘導(dǎo)云南杜鵑離體葉片直接再生芽ZT作用好于TDZ，再生芽率為74%。呂秀立等[16]應(yīng)用ZT誘導(dǎo)大葉常綠杜鵑離體直接再生不定芽率為70%。Pavingerova[17]以不同濃度TDZ誘導(dǎo)15個(gè)杜鵑栽培種離體葉片再生不定芽的研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型所需TDZ濃度不同，且不定芽的再生頻率從0%到100%差異很大。為建立高效、穩(wěn)定的杜鵑離體葉片植株再生體系，一方面有必要針對(duì)特定種和基因型開(kāi)展植株再生研究，一方面還需篩選再生能力強(qiáng)的基因型應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化。

本研究以6個(gè)高山杜鵑品種為材料，研究不同濃度TDZ和ZT對(duì)其離體葉片再生效率的影響，篩選出再生能力強(qiáng)的基因型，并通過(guò)再生過(guò)程形態(tài)學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)觀察對(duì)再生途徑進(jìn)行初步研究，以期為高山杜鵑離體葉片再生芽機(jī)理研究，提高其植株再生頻率和遺傳轉(zhuǎn)化效率提供技術(shù)支持和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018年6月—2019年12月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中保存的6個(gè)高山杜鵑品種的增殖瓶苗，分別 是‘Percy Wiseman’(D4)、‘Cunnigham’s White’(W10)、‘Halfdem Lem’(W17)、‘Madame Masson’(W22)、‘Scintillation’(W29)、‘XXL’(X)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 以增殖培養(yǎng)30天的高山杜鵑瓶苗為材料，取植株頂部往下完全展開(kāi)的第1和第2輪葉片，葉背劃3條傷口，背面朝下接種于附加不同濃度ZT、TDZ和NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，激素配比見(jiàn)表1，每個(gè)配方接種3皿，每皿7個(gè)葉片。接種后每隔1天觀察記錄每個(gè)品種在不同濃度激素處理下的分化時(shí)間和分化的葉片數(shù)（葉片上只要有不定芽長(zhǎng)出，則該葉片為分化的葉片），培養(yǎng)50天后，統(tǒng)計(jì)分化葉片數(shù)并計(jì)算分化率[式(1)～(2)]；此時(shí)將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)接到相應(yīng)處理的新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)40天后，計(jì)數(shù)不同處理下各品種分化芽的數(shù)量[式(3)]。

表1 離體葉片誘導(dǎo)芽激素組合 mg/L

誘導(dǎo)培養(yǎng)基以WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同配比的激素，蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，pH 5.4，121℃高壓滅菌25 min。培養(yǎng)光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度(25±2)℃。

1.3.2 離體葉片分化不定芽形態(tài)及組織細(xì)胞學(xué)觀察 接種后，用體視鏡觀察離體葉片的形態(tài)響應(yīng)，接種后至培養(yǎng)第30天隔1天觀察，培養(yǎng)30天后隔5天觀察，記錄離體葉片分化芽的時(shí)間和形態(tài)學(xué)特征。離體葉片分化形成完整的不定芽之前，每次觀察時(shí)取培養(yǎng)中的葉片進(jìn)行石蠟切片，觀察葉片分化過(guò)程中的組織細(xì)胞學(xué)變化，石蠟切片制作參照Z(yǔ)aytseva1等[13]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計(jì)、計(jì)算，采用SPSS Statistics 18.0軟件分析不同處理間分化率和分化不定芽數(shù)的差異顯著性，顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素種類和濃度對(duì)高山杜鵑離體葉片再生芽效率的影響

2.1.1 分化率 表2結(jié)果顯示，不添加外源細(xì)胞分裂素即可一定程度誘導(dǎo)6種高山杜鵑離體葉片切口處的膨大反應(yīng)，并最終有極少量不定芽形成。從分化率看，TDZ濃度為0.04 mg/L時(shí)，除D4和W22外其余品種的不定芽分化率均可達(dá)到100%。而D4和W22的分化率也是隨TDZ濃度增加而提高，分別于0.08、0.06 mg/L時(shí)達(dá)到100%。ZT對(duì)6個(gè)基因型高山杜鵑離體葉片不定芽的誘導(dǎo)效果顯著弱于TDZ。隨ZT濃度增加，各基因型葉片的分化率提高。當(dāng)ZT濃度為4 mg/L時(shí)，W10、W17、W29、X分化率與TDZ 0.04 mg/L處理無(wú)顯著差異，但D4和W22的分化率顯著低于TDZ處理。

表2 不同處理對(duì)6種高山杜鵑離體葉片分化率的影響%

從響應(yīng)時(shí)間來(lái)看，在各自分化率最高的TDZ濃度下，W10、W29和X的響應(yīng)最早，培養(yǎng)3～5天即可見(jiàn)葉片切口的膨大反應(yīng)（圖1）。W29培養(yǎng)18天后離體葉片即全部開(kāi)始分化不定芽，X培養(yǎng)20天后分化率達(dá)100%，W10培養(yǎng)22天后全部分化，W17培養(yǎng)28天后葉片分化率達(dá)100%，而W22和D4葉片培養(yǎng)35天后分化率達(dá)100%。雖然6個(gè)基因型高山杜鵑的葉片分化率均達(dá)到了100%，但其分化出的不定芽狀態(tài)有差異，且從離體葉片對(duì)外源TDZ的反應(yīng)時(shí)間看，W29最早，W10和X稍晚，再次是W17，W22和D4最晚。

圖1 不同基因型高山杜鵑離體葉片分化趨勢(shì)

2.1.2 再生不定芽數(shù)量 從表3可看出，各基因型中，TDZ誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量顯著高于ZT。對(duì)于同一個(gè)基因型，不同TDZ濃度下離體葉片分化不定芽的數(shù)量表現(xiàn)出差異，隨濃度升高，芽數(shù)量呈先增加后降低的趨勢(shì)，其中，D4、W17、W29、X在TDZ為0.06 mg/L時(shí)分化的芽數(shù)最多，顯著多于其他處理，W10和W22在TDZ 0.04～0.06 mg/L時(shí)分化的芽數(shù)最多，顯著多于其他處理。各基因型高山杜鵑中，W10離體葉片誘導(dǎo)出的不定芽最多，平均達(dá)13個(gè)/片，而X誘導(dǎo)出的芽數(shù)最少，平均只有5.67個(gè)/片。通過(guò)形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，各基因型在TDZ濃度高于0.06 mg/L時(shí)，可分化出大量密集的芽點(diǎn)，但這些芽點(diǎn)大部分不能伸長(zhǎng)生長(zhǎng)發(fā)育成正常的芽，故統(tǒng)計(jì)其分化的芽數(shù)量反而降低。

表3 不同處理對(duì)6種高山杜鵑離體葉片分化芽數(shù)量的影響 個(gè)/片

2.2 高山杜鵑離體葉片再生芽途徑

對(duì)離體葉片再生過(guò)程的形態(tài)學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在TDZ和ZT誘導(dǎo)下，W10、W29、X和 W17通過(guò)器官直接發(fā)生途徑再生不定芽，而W22和D4除了器官直接發(fā)生途徑外，在TDZ誘導(dǎo)下存在少量葉片通過(guò)愈傷組織間接再生途徑分化不定芽。

高山杜鵑離體葉片由上下表皮、柵欄組織、海綿組織和維管組織組成（圖2G）。器官直接再生途徑中，離體葉片接入培養(yǎng)基后，切口處日益膨大（圖2A），此時(shí)葉片上表皮細(xì)胞及其以下的數(shù)層細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞染色深，處于脫分化狀態(tài)（圖2H）；培養(yǎng)10～13天時(shí)，這些細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次分裂，突出表皮，形成染色深的近球形的分生細(xì)胞團(tuán)（圖2I、J），即為葉片切口膨大處觀察到透明的不同大小的球形突起（圖2B）；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)球狀突起長(zhǎng)大，變綠或變紅（圖2C），培養(yǎng)約15天后，突起進(jìn)一步長(zhǎng)大、分化，可見(jiàn)葉片表面分化出不同發(fā)育階段的芽點(diǎn)（圖2D、E、K）；最后芽點(diǎn)長(zhǎng)成結(jié)構(gòu)完整的不定芽，整個(gè)葉片上長(zhǎng)出叢生的小植株（圖2F）。

圖2 0.04 mg/L TDZ誘導(dǎo)下，R.‘Scintillation’(W29)離體葉片直接再生芽的形態(tài)和組織細(xì)胞學(xué)觀察

在離體葉片培養(yǎng)的初始階段，愈傷組織間接再生途徑與直接再生途徑一樣經(jīng)歷了切口處膨大、細(xì)胞分裂活躍和增殖（圖3A，H），與直接途徑不同的是間接途徑葉片切口處持續(xù)膨大，大約培養(yǎng)16天時(shí)形成愈傷組織（圖3B）。愈傷組織來(lái)源于葉片上表皮細(xì)胞及其以下的幾層細(xì)胞的增殖，突出的愈傷組織細(xì)胞排列松散，細(xì)胞染色有深有淺（圖3I）。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，有的愈傷組織褐化、干枯，最后死亡（圖3F、G），培養(yǎng)約25天時(shí)，在愈傷組織細(xì)胞染色深的區(qū)域分化形成突出的細(xì)胞團(tuán)（圖3J），即愈傷組織上形成的突起結(jié)構(gòu)（圖3C），之后這些突起進(jìn)一步分化、長(zhǎng)大，形成芽（圖3D、K、L），離體葉片在培養(yǎng)約65天后通過(guò)愈傷組織間接途徑形成不定芽（圖3E）。

圖3 0.08 mg/L TDZ誘導(dǎo)下R.‘Percy wiseman’(D4)離體葉片愈傷組織途徑再生芽的形態(tài)和組織學(xué)觀察

3 結(jié)論

TDZ誘導(dǎo)6種高山杜鵑離體葉片再生的效果好于ZT。TDZ濃度為0.04 mg/L時(shí)，‘Cunnigham’s White’(W10)、‘Halfdem Lem’(W17)、‘Scintillation’(W29)、‘XXL’(X)不定芽分化率達(dá)到100%，TDZ濃度分別為0.08、0.06 mg/L 時(shí)‘Percy Wiseman’(D4)和‘Madame Masson’(W22)的分化率為100%；‘Cunnigham’s White’離體葉片誘導(dǎo)出的不定芽最多，平均達(dá)13個(gè)/片，而‘XXL’誘導(dǎo)出的芽數(shù)最少，平均只有5.67個(gè)/片；離體葉片分化芽的響應(yīng)時(shí)間‘Scintillation’最早，‘Cunnigham’s White’和‘XXL’稍 晚 ，其 次 是‘Halfdem Lem’，‘Madame Masson’和‘Percy Wiseman’最晚。6個(gè)基因型都可作為遺傳轉(zhuǎn)化的候選材料，其中‘Scintillation’、‘Halfdem Lem’和‘Cunnigham’s White’的再生能力更強(qiáng)。6種高山杜鵑離體葉片的再生途徑主要為器官直接再生，其中‘Percy Wiseman’和‘Madame Masson’除器官直接發(fā)生途徑外，在TDZ誘導(dǎo)下有少量葉片存在愈傷組織間接再生途徑分化不定芽。研究結(jié)果為高山杜鵑離體葉片再生芽機(jī)理研究，提高其植株再生頻率和遺傳轉(zhuǎn)化效率提供技術(shù)支持和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 討論

基因型是影響植株再生的關(guān)鍵因子[18-19]。本研究中6種高山杜鵑離體葉片在TDZ處理下分化率均可達(dá)到100%，表明它們可作為高山杜鵑遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用的候選材料。

TDZ和ZT是杜鵑屬植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用較多的植物激素，具有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性[20]，但兩者對(duì)杜鵑屬不同種植物組培苗增殖和離體葉片分化的效應(yīng)有差異[14-15]。本研究中，從離體葉片的響應(yīng)時(shí)間、分化率和分化芽數(shù)看，TDZ對(duì)6種高山杜鵑離體葉片分化芽的效果均好于ZT，只是不同基因型所需的TDZ濃度有差異。而云南杜鵑、大葉常綠杜鵑的研究中又認(rèn)為ZT對(duì)葉片分化的效果好于TDZ。吳曉軍等[19]在小麥成熟胚再生體系中認(rèn)為，胚處理方式與基因型之間可能存在著一定的互作關(guān)系，找到最適合的胚處理方法，可將基因型的再生能力最大化。在考慮到基因型間差異的同時(shí)，本研究中觀察到一定濃度TDZ能誘導(dǎo)大量不定芽，但芽體大多短縮，最終不能形成正常的芽和植株。劉淼等[21]在牛皮杜鵑分化芽的研究中發(fā)現(xiàn)，TDZ對(duì)組培苗愈傷組織誘導(dǎo)及分化的效果顯著優(yōu)于ZT，但繼代培養(yǎng)時(shí)增殖效果不如ZT?？梢?jiàn)，在前期應(yīng)用TDZ高效誘導(dǎo)離體葉片分化芽點(diǎn)的基礎(chǔ)上，后續(xù)有必要進(jìn)一步研究在培養(yǎng)的不同階段組合低濃度ZT對(duì)芽點(diǎn)成芽的作用。

高山杜鵑離體葉片可通過(guò)器官直接或間接發(fā)生[22-23]和體細(xì)胞胚胎發(fā)生[24]2條途徑再生不定芽，再生途徑除與基因型有關(guān)，還與外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑刺激下的內(nèi)源激素水平密切相關(guān)。羅彭等[25]采用0.8 mg/L TDZ結(jié)合0.2 mg/L NAA誘導(dǎo)大白杜鵑、美容杜鵑、喇叭杜鵑愈傷組織，愈傷組織可分化叢芽。而本研究中，雖然6種高山杜鵑器官直接發(fā)生頻率均達(dá)到100%，但‘Percy Wiseman’、‘Madame Masson’所需TDZ濃度分別為0.08、0.06 mg/L，較其他基因型高，且除器官直接發(fā)生途徑外，還存在少量愈傷組織間接再生途徑。說(shuō)明在不同濃度外源激素誘導(dǎo)下，高山杜鵑再生可能存在不同途徑。故后續(xù)可針對(duì)特定基因型和特定植株再生處理方法，探討離體葉片再生不同階段的形態(tài)和組織細(xì)胞發(fā)育動(dòng)態(tài)，以提高植株再生頻率和遺傳轉(zhuǎn)化效率。