植株葉綠素a和葉綠素b無損檢測系統(tǒng)研究與開發(fā)

楊張青，李國強(qiáng)，張玉民，蘇偉波，吳建中，段鐵城,3，齊 磊

（1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，鄭州 450008；2河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)有限公司，鄭州 450002；3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

0 引言

氮素是作物生長發(fā)育過程中不可缺少的重要營養(yǎng)元素之一[1]。為了使作物保持適宜的氮素水平，在作物不同生育期合理施用氮肥非常重要。適量施用氮肥能提高作物產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量，并改善加工品質(zhì)；但過量或不合理施氮不僅不能達(dá)到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的目的，還會使作物莖葉徒長，降低氮肥利用率，增加氮肥損失，并造成環(huán)境污染[2-4]。中國農(nóng)作物化肥使用總量從1980年的1269.4萬t/年增加至2014年的5995.9萬t/年，而且重氮肥輕磷、鉀肥的現(xiàn)象比較嚴(yán)重[5]。但中國對氮肥的利用率僅為30%左右，遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家60%～70%的利用率，導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染[6-8]。

氮化物主要集中在作物生命活動旺盛的區(qū)域，如葉片、分生組織等。植物葉片中70%～80%氮素存在于葉綠體內(nèi)，所以葉片中葉綠素含量的高低和氮素關(guān)系密切[9-10]。植株葉綠素含量傳統(tǒng)分析采用分光光度法，其中普遍使用的是Arnon法[11]，該法在測定時需要采摘并破壞植株葉片，檢測過程操作繁瑣，不利于對植株葉片的田間快速無損監(jiān)測。為了克服上述缺點(diǎn)，近年來作物葉綠素?zé)o損診斷技術(shù)受到人們青睞，目前多采用高光譜遙感、葉綠素?zé)晒?、葉綠素儀等分析技術(shù)，其中葉綠素儀分析技術(shù)包括透射式和漫反射式葉綠素儀檢測技術(shù)[12]。透射式葉綠素檢測技術(shù)采用葉綠素指數(shù)或葉色值表征植株葉片葉綠素含量高低，文獻(xiàn)報道中具有代表性的是SPAD-502葉綠素儀[13-15]（Minolta，日本），該葉綠素儀基于朗伯比爾定律原理，采用650 nm和940 nm 2個波長進(jìn)行檢測，克服了單一波長受植株生物量、環(huán)境背景干擾等的影響，提高了葉綠素光譜診斷的精度[16]。但是該類型的葉綠素儀在應(yīng)用性研究中還存在一些缺點(diǎn)：（1）由于葉綠素儀依據(jù)光透射原理進(jìn)行設(shè)計，在檢測葉綠素含量較高的葉片時光基本透射不過去，導(dǎo)致儀器測值變化不明顯，如當(dāng)SPAD值超過50時，測量精度顯著降低，而作物SPAD值在生育期達(dá)到50的情況很常見，使得其應(yīng)用推廣受到限制[17-18]。（2）該葉綠素指數(shù)與葉片葉綠素總量雖有顯著相關(guān)性，但是尚未實現(xiàn)直接輸出植株葉片葉綠素a和b值，而葉綠素a和b的比值是作物病理診斷和栽培管理的重要參數(shù)之一。漫反射式葉綠素檢測技術(shù)基于光學(xué)漫反射理論進(jìn)行檢測系統(tǒng)設(shè)計開發(fā)。2015年河南農(nóng)業(yè)大學(xué)的魏凱等[19]探究了葡萄葉片YN-FS-1型便攜式漫反射葉綠素儀測值XJI與全氮的關(guān)系。古東東等[20]搭建了三波長檢測裝置，分析了3個品種玉米葉片葉綠素含量與KM值的相關(guān)性。本研究將繼續(xù)深入優(yōu)化光路系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計，提高測試結(jié)果的準(zhǔn)確性；通過漫反射吸光度建立葉綠素a和b數(shù)學(xué)模型；進(jìn)行小麥、玉米和花卉等植株葉片檢測和數(shù)據(jù)分析，以期為大田作物、花卉栽培氮素施肥提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

氣浴恒溫振蕩器（金壇市城東新瑞儀器廠）、紫外-可見分光光度計（南京菲勒儀器有限公司）、電子天平（梅特勒托利多集團(tuán)）、光譜儀定標(biāo)白板（海洋光學(xué)）、透光度75%消光片、25 mL刻度試管、80%乙醇（分析純）、蒸餾水。

1.2 檢測系統(tǒng)工作原理

1.2.1 Kubelka-Munk函數(shù) 基于Kubelka-Munk光學(xué)漫反射理論應(yīng)用于植株葉片葉綠素檢測可概述為：當(dāng)一束平行光垂直照射到植株葉片時，這一束平行入射光與物體內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生折射、反射、吸收和散射4種現(xiàn)象后，剩余的光攜帶有豐富的葉片內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)信息并在葉子表面產(chǎn)生漫反射現(xiàn)象，利用這一光學(xué)現(xiàn)象，借助光電探測器進(jìn)行漫反射光檢測可間接獲得葉片內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)信息。與漫反射光相比，光透射受液體樣品的濃度、固體樣品厚度等因素影響，因此透射光無法對一定厚度的固體樣品進(jìn)行定量測定，相反，漫反射不受樣品或待測物厚度的影響，在檢測固相樣本時更為可靠。由于Kubelka-Munk理論的K-M函數(shù)式推導(dǎo)過程是在6個條件同時滿足的理想情況下完成的：（1）一束平行光垂直入射；（2）物體表面無限大；（3）物體厚度無限厚；（4）物體表面粗糙不平，無鏡面反射光；（5）這束光在物體內(nèi)部和表面產(chǎn)生了完全的散射和吸收；（6）吸收系數(shù)K和散射系數(shù)S均為常數(shù)。因此，基于漫反射光學(xué)理論的應(yīng)用性研究，還需要在理論指導(dǎo)下根據(jù)實際情況進(jìn)行拓展性應(yīng)用。在實際應(yīng)用中，為了保證反射率不受物體厚度改變而變化，測量都是在該物體厚度足夠厚的層上進(jìn)行，實際測量中物體厚度約1 mm厚就能滿足該條件。因此，用R∞代表物體反射系數(shù)，計算見公式(1)。

其中，F(xiàn)(R∞)稱為Kubelka-Munk(K-M)函數(shù)或者remission函數(shù)。

由公式(1)可推導(dǎo)出R∞的公式(2)。

1.2.2 漫反射吸光度 漫反射吸光度A定義為公式(3)。

1.3 檢測系統(tǒng)設(shè)計

該檢測系統(tǒng)主要圍繞光電檢測、信號轉(zhuǎn)化、數(shù)據(jù)處理和人機(jī)交互4個功能開發(fā)。其中，光路系統(tǒng)由光源、傳感器、反射板、定位板、避光組件等組成；選用內(nèi)置A/D轉(zhuǎn)化器的單片機(jī)為數(shù)據(jù)采集和處理器，由模擬信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號并輸出顯示，以數(shù)據(jù)組的形式存儲至SD卡，并實現(xiàn)USB接口與電腦通訊。檢測系統(tǒng)示意圖和電氣圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 檢測系統(tǒng)示意圖

圖2 檢測系統(tǒng)電氣圖

1.3.1 光路系統(tǒng) 光路系統(tǒng)采用3光源3光束垂直照射植株葉片的設(shè)計思路，使得3束光在葉片上呈現(xiàn)的光斑實現(xiàn)最大面積的重疊，重疊區(qū)的信號比例達(dá)到最大。光路組件側(cè)面45°陷阱式結(jié)構(gòu)設(shè)計，如圖3所示，在陷阱內(nèi)、檢測器前端安裝透鏡對漫反射光進(jìn)行匯聚，以增強(qiáng)信號采集。光電傳感器將采集到的光信號進(jìn)行對數(shù)運(yùn)算并放大后送給A/D轉(zhuǎn)化，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)化后的數(shù)字信號由液晶顯示實現(xiàn)漫反射光強(qiáng)值輸出。光路組件密封性要求達(dá)到避免外界光干擾的目的，加工材質(zhì)選用黑色ABS，組件分為光源發(fā)射、探測部分和漫反射白板內(nèi)陷及固定部分，兩部分之間用硅膠墊密封，避免夾住葉片時漏光。漫反射光路示意圖如圖3所示。

圖3 漫反射光路系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

1.3.2 光電檢測及數(shù)據(jù)采集 第一波長為峰值波長645 nm的LED光源，第二波長為峰值波長663 nm的LED光源，第三波長為峰值波長940 nm的LED光源。以下分別簡稱第一波長、第二波長和第三波長。光電檢測在封閉暗室中進(jìn)行，不能受到外界光或太陽光的干擾，由于第一波長和第二波長分別是葉綠素b和a的最大吸收波長，葉片顏色深淺不同而產(chǎn)生不同程度的吸收，光電傳感器接收到的漫反射光信號強(qiáng)弱與葉片葉綠素含量高低呈現(xiàn)高度一致性。檢測系統(tǒng)開機(jī)：（1）分別調(diào)整第一、二和三波長的限流電阻使得AD輸出值接近滿量程且3個波長的值基本一致，滿足要求后不得再調(diào)整限流電阻；（2）先夾住漫反射標(biāo)準(zhǔn)白板，分別獲取第一、二和三波長的AD輸出值作為原始值；再檢測3個光源均熄滅時系統(tǒng)的暗電流值，每次測量均扣除該本底值；然后夾住葉片進(jìn)行測量，第三波長的漫反射值為動態(tài)參照值，用于扣除葉脈、葉片表面狀況和內(nèi)部生物組織結(jié)構(gòu)等因素的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性和重復(fù)性

以透光度75%的消光片為標(biāo)準(zhǔn)，對該檢測系統(tǒng)進(jìn)行穩(wěn)定性和重復(fù)性測試和評價，評價參數(shù)為3個波長的光強(qiáng)值。（1）系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測方法：以透光度(T)75%的消光片水平放置檢測窗口固定位置20次檢測，記錄第一波長、第二波長和第三波長的光強(qiáng)值Is1、Is2和Is3。（2）系統(tǒng)重復(fù)性檢測方法：以透光度75%的消光片重復(fù)水平放置至檢測窗口進(jìn)行20次檢測，記錄第一波長、第二波長和第三波長的光強(qiáng)值Is1、Is2和Is3。該檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測RSD≤0.39%，n=20；重復(fù)性檢測RSD≤0.59%，n=20。數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性(n=20)

2.2 植株葉片葉綠素a和b測定

2.2.1 試驗方案 選取生長季節(jié)舒展開的第1、2、3片葉子，葉色均勻，盡量避開主葉脈、蟲斑、病害斑，破損部位。同時進(jìn)行Arnon法和葉綠素檢測系統(tǒng)無損測定方法（以下簡稱漫反射法）進(jìn)行葉綠素測定。

（1）漫反射法。按壓儀器檢測頭夾住植株代表性葉片，按“確定”鍵進(jìn)行測定，并記錄葉綠素a和葉綠素b單位面積含量值(mg/cm2)。

（2）Arnon法（又稱阿爾諾法，常規(guī)法）。從植株上選取有代表性的葉片（避開粗大葉脈、病蟲害部位和灰塵特別多的葉片）打孔取樣，打孔器半徑為7 mm，準(zhǔn)確稱取0.2 g樣本，用鑷子夾住放入25 mL離心管中，然后量取80%乙醇25 mL，蓋蓋子60℃空氣浴提取，或者室溫25℃下避光放置24 h，顏色較深葉片視情況而定，至葉片全部褪綠為止。以80%乙醇為參比溶液，在紫外-可見分光光度計上機(jī)測定，記錄波長663、645 nm處測定的吸光度值，計算見公式(7)～(10)。

式中，Ca為葉綠素a的濃度(mg/L)，Cb為葉綠素b的濃度(mg/L)，a為葉綠素a的含量(mg/cm2)，b為葉綠素b的含量(mg/cm2)，S為選取代表性葉片的葉面積(cm2)。

2.2.2 2種檢測方法的對比分析 共采集小麥樣本50個，玉米樣本95個，9種花卉樣本344個。分別進(jìn)行葉綠素a和葉綠素b的漫反射法和Arnon法直線回歸，兩者的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平，用***表示。詳見表2。

表2 11種植株樣本2種測定方法的數(shù)據(jù)分析

2.2.3 玻璃翠葉片的測定 選取玻璃翠葉片10片，進(jìn)行漫反射法和Arnon法的對比實驗，葉綠素a和葉綠素b值詳見表3。

表3 玻璃翠葉片2種測定方法葉綠素a和葉綠素b值 mg/cm2

對2種檢測方法的Chl a和Chl b分別進(jìn)行回歸分析。Chl a為y=0.570x+1.189，r=0.966***；其中x表示漫反射法Chl a單位面積含量值，y表示Arnon法葉綠素a值。Chl b為y=0.299x+0.671，r=0.939***；其中x表示漫反射法葉Chl b單位面積含量值，y表示Arnon法Chl b值。漫反射法和Arnon法的Chl a和Chl b均達(dá)到極顯著相關(guān)，該檢測系統(tǒng)適用于玻璃翠花這類特殊厚度葉片的檢測。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

植株葉綠素?zé)o損診斷技術(shù)在作物氮素營養(yǎng)診斷及推薦施肥中具有重大意義，其中Chl a和Chl b的比值是作物病理診斷和栽培管理的重要參數(shù)之一。依據(jù)儀器工作原理葉綠素儀分為透射式和漫反射式。因其小巧、便攜，便于農(nóng)業(yè)科研田間使用，該儀器具有較好的市場前景。其中，透射式葉綠素儀在國內(nèi)外農(nóng)業(yè)科研領(lǐng)域使用較多，但由于其檢測葉綠素含量較高葉片時光基本透射不過去，導(dǎo)致儀器測值變化不明顯，該缺陷致使其應(yīng)用受限。為了解決該問題，國內(nèi)以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)段鐵城教授為首的研究團(tuán)隊率先進(jìn)行了漫反射式葉綠素檢測技術(shù)研究，古東東等設(shè)計的3波長檢測裝置用于玉米葉片葉綠素含量與KM值相關(guān)性研究取得了重大進(jìn)展，但是尚未實現(xiàn)直接輸出植株葉片葉綠素a和b值。為了實現(xiàn)該目的，同時，進(jìn)一步提高測試準(zhǔn)確度，本研究從2個方面進(jìn)行了深入研究：（1）光路設(shè)計上采用陷阱式3光源3光束垂直照射，實現(xiàn)3束光投射在葉片上光斑最大面積重疊，從根本上提高重疊區(qū)信號采集率，解決測試精度問題。（2）在數(shù)據(jù)建模上引入漫反射吸光度計算公式和良好線性區(qū)間，以國際上通用的Arnon法為參照，借助偏最小二乘法、矩陣等分析法，進(jìn)行了漫反射和Arnon 2種檢測方法吸光度值的回歸分析。（3）以巨厚型玻璃翠葉片為樣本，測試了葉片厚度對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果表明漫反射法在葉片測試時不受葉片厚度的影響，本研究基本上解決了透射式葉綠素儀的使用缺陷?；诠鈱W(xué)漫反射理論的植株葉片葉綠素?zé)o損診斷技術(shù)極具發(fā)展前景。

3.2 結(jié)論

本研究基于光學(xué)漫反射理論構(gòu)建3光束垂直入射和側(cè)面45°陷阱式光電傳感器數(shù)據(jù)采集的光路設(shè)計，研究檢測系統(tǒng)設(shè)計中的關(guān)鍵技術(shù)，初步建立了植株葉片葉綠素a和葉綠素b的數(shù)學(xué)預(yù)測模型。采集小麥、玉米和花卉等植株葉片進(jìn)行漫反射法與Arnon法葉綠素a和b值檢測，分別進(jìn)行2種檢測方法的Chl a和Chl b測值回歸分析，兩者的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平。大田作物、花卉等葉片厚度一般不超過1.2 mm，但一些特殊花卉如玻璃翠的葉片厚度可達(dá)3.0 mm以上，為了檢驗漫反射法是否適應(yīng)對于這類厚度特殊的花卉，選取玻璃翠葉片進(jìn)行2種檢測方法的測定，結(jié)果理想。