超干處理延長菜豆種子壽命的生理生化機制研究

孫 璐，馮國軍，劉大軍，楊曉旭，劉 暢，閆志山

（黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

菜豆味道鮮美且營養(yǎng)價值高，富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、鎂等元素。菜豆種子在一般條件下不耐貯藏，菜豆種子的老化和活力喪失對其種質(zhì)資源保存和現(xiàn)實生產(chǎn)會造成巨大損失。長期保存種子需要貯藏溫度、種子含水量2個關(guān)鍵控制因素。國際植物遺傳資源委員會(BIPGR)把(5±1)%含水量、-18℃低溫作為種子儲藏保存的理想條件，目前常采用低溫和超低溫的方式來貯藏種質(zhì)，但冷庫的建設(shè)和運行成本昂貴，耗資巨大。種子超干貯藏(ultra-dry storage)是將種子水分降至5%以下（一般認為5%是種子安全含水量下限），密封后在室溫下貯藏種子的技術(shù)和方法[1]，讓種子含水量與儲存溫度兩者之間有某種意義上的互補關(guān)系。研究表明，低含水量狀態(tài)下的種子劣變程度降低，且在一定的含水量范圍內(nèi)，降低種子含水量得到延長種子壽命的效果與低溫儲存種子一樣[2]。不同品種的種子耐干的特殊性質(zhì)差異很大，對大蔥[3]、芝麻[4]、落葉松[5]、黃花補血草[6]、花生[7]等植物種子超干的研究結(jié)果表明，大部分作物種子的超干處理可以減緩種子老化，種子的活力可以在長期內(nèi)保持較高水準，且對種子無害。油料種子可忍受極高程度的脫水，且對活力沒有影響；蛋白質(zhì)類的種子以及淀粉類的種子品種間耐干能力上存在很大的差異性，如大豆、大麥和水稻[8-10]。當含水量低于某一臨界點時，種子壽命縮短，甚至出現(xiàn)干燥受損、活力下降的現(xiàn)象[11]。超干貯藏技術(shù)想要得到廣泛的應用，主要是確定不同品種種子超干的下限含水量。種子活力的喪失通常歸因于原生質(zhì)膜完整性的喪失，盡管目前尚不清楚膜損傷是種子變質(zhì)的主要原因還是次要效應，但仍可以將其視為種子老化的早期癥狀。人工高溫高濕加速老化種子經(jīng)常用來測定種子活力。人工老化是人為控制種子在短時間內(nèi)進行劣變老化，控制種子的活力、發(fā)芽率、發(fā)芽勢等快速下降，人工老化可以模擬自然界中種子老化的過程。

本研究以菜豆種子為材料，對它們進行超干和人工老化處理，從發(fā)芽率、熱穩(wěn)蛋白含量、丙二醛(MDA)含量等方面對菜豆種子超干貯藏的效果進行研究，探討菜豆種子超干貯藏的可行性，以利于菜豆種質(zhì)資源的保存。

1 材料與方法

1.1 材料

由黑龍江大學園藝學團隊收集和保存的菜豆種質(zhì)資源篩選出‘將軍’、‘紫冠’、‘熱那亞’，初始含水量分別為12.44%、12.77%、11.87%，初始發(fā)芽率分別為98.67%、87.33%、89.33%。

1.2 種子超干處理及老化

在室溫條件下利用硅膠干燥[12]，將種子裝入尼龍網(wǎng)袋，置于裝滿硅膠的干燥器中，硅膠與種子的質(zhì)量比為10:1，制備不同含水量的種子。置于40℃、90%濕度恒溫箱中保溫老化6天[13]。

1.3 回濕處理

對老化后的種子采取逐級回水處理[14]。將不同含水量的種子放入裝有飽和CaCl2溶液、飽和NH4Cl溶液及水的干燥器中，密封，各平衡24 h，使種子含水量逐步提高。

1.4 種子發(fā)芽率、活力以及硬實率的測定

回水處理后的菜豆采用《國際種子檢驗規(guī)程》標準測定種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[15]，種子萌發(fā)溫度為20℃/25℃(12 h/12 h)，7天統(tǒng)計結(jié)束，每次測定50粒種子，3次重復?；盍χ笖?shù)(VI)按式(1)～(2)計算。同時對種子的硬實率進行測定[16]。

式中，GI為發(fā)芽指數(shù)，Gt為t日后發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽時間，Sx為發(fā)芽x天后小苗的平均胚軸長。

1.5 生理指標測定

參照張憲政[17]的方法，稱取0.2 g種子，置于裝有50 mL蒸餾水的燒杯中，用DDS-IIA型電導率儀測定此時的電導率(A)，然后將加有蒸餾水的種子于25℃恒溫條件下浸泡24 h后，用DDS-IIA型電導率儀測定此時的電導率(B)，再將其置于沸水鍋中水浴30 min，待冷卻到室溫后測定電導率(C)。

稱取吸脹24 h的種子0.5 g，種子可溶性蛋白含量采用李合生的考馬斯亮藍G-250染色法[18]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[19]，超氧陰離子自由基(O2-)產(chǎn)生速率采用比色法[20]。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度計法測定，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[21]。

1.6 胚根細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

隨機選取含水量范圍為12%、8.5%、6.5%和5.5%的種子樣品，浸泡12 h，取種子的胚根，固定在4%戊二醛溶液中7天，放置在4℃保存。然后酒精梯度脫水，再利用四氧化鋨固定，最后用樹脂包埋。利用LKB8800 III超薄超微切片機切片，再用透視電鏡觀察切片[22]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

各數(shù)據(jù)3次重復取平均值，用SPSS 25.0軟件在P=0.05下利用LSD多重比較進行數(shù)據(jù)分析，用Excel 2016軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆種子的干燥過程

在室溫條件下利用硅膠干燥法，‘將軍’含水量由12.44%降至8.52%、6.95%、5.78%分別需要6、15、105天，‘紫冠’含水量由12.77%降至8.38%、6.89%、5.35%分別需要6、15、105天，‘熱那亞’含水量由11.87%降至6.04%、5.95%、5.01%分別需要6、15、105天（圖1）。3種菜豆種子干燥速率均呈先快后慢的變化趨勢，且整體干燥進程中，‘熱那亞’的干燥速度快于‘將軍’和‘紫冠’，前者含水量的降低速率比后者快0.3%～2%。這可能與種子大小以及所含物質(zhì)成分有關(guān)。

圖1 菜豆種子在室溫下的脫水速率

2.2 超干處理對菜豆種子活力的影響

隨著含水量的降低，‘將軍’和‘紫冠’種子均出現(xiàn)硬實現(xiàn)象，而‘熱那亞’沒有出現(xiàn)硬實。種子硬實是因種皮結(jié)構(gòu)過于緊密從而導致種子吸脹能力差，這是一種讓種子處于休眠狀態(tài)的保護機制，菜豆種子硬實現(xiàn)象普遍存在，在打破種子硬實后，種子依舊可以發(fā)芽。與未超干種子相比，超干處理的3個品種菜豆種子發(fā)芽率均顯著上升。當‘將軍’種子由初始含水量12.44%降到5.78%時，‘將軍’種子的硬實率上升至16.00%，發(fā)芽率上升了22個百分點；當‘紫冠’種子由初始含水量12.77%降到5.35%時，硬實率上升至6.77%，發(fā)芽率上升了27個百分點；當‘熱那亞’種子由初始含水量11.87%降到5.01%時，發(fā)芽率上升了46個百分點（表1）。在菜豆種子老化過程中，適度的超干處理使菜豆種子的發(fā)芽率上升，但不同品種間存在差異。

表1 老化處理后超干菜豆種子萌發(fā)和活力水平

2.3 超干處理對菜豆種子胚胎線粒體細胞的影響

菜豆種子中線粒體的顯微鏡觀察表明，在種子衰老過程中，胚胎細胞中的線粒體超微結(jié)構(gòu)受到破壞，與種子水分含量有關(guān)（圖2）。在含水量為5.78%的‘將軍’種子中，胚胎細胞中的線粒體保持完好，清晰可見雙層膜和線粒體嵴，而12.44%老化的‘將軍’種子中看不到膜，且細胞呈解體狀態(tài)（圖2A～B）。在含水量為5.01%的‘熱那亞’種子中，線粒體膜在種子中是正常的，線粒體內(nèi)膜和嵴清晰可見。在含水量為11.87%的‘熱那亞’種子中，種子中線粒體內(nèi)膜和線粒體嵴消失，線粒體開始呈液泡狀結(jié)構(gòu)并分解（圖2C～D）。在含水量為5.35%的老化‘紫冠’種子中，胚胎細胞中的線粒體保持完好，清晰可見雙層膜，12.77%老化的‘紫冠’種子中看不到膜，且細胞呈解體狀態(tài)（圖2E～F）。說明超干處理有利于種子在老化過程中線粒體的保持。

圖2 不同含水量菜豆種子老化胚根線粒體結(jié)構(gòu)變化

2.4 超干老化處理對菜豆種子生物膜透性的影響

經(jīng)過人工老化處理后，超干處理的‘將軍’、‘熱那亞’種子的電解質(zhì)滲透率隨著含水量的下降而降低，而‘紫冠’種子的電解質(zhì)滲透率在各含水量之間不存在顯著差異（圖3）。說明在不同的菜豆品種中，超干處理對電解質(zhì)滲透率的影響不同，且適度的超干處理有利于維持生物膜的完整性。

圖3 不同含水量菜豆種子老化后電導率變化

經(jīng)過人工老化處理后，超干處理的‘將軍’種子熱穩(wěn)蛋白含量都顯著高于對照，在含水量為6.95%時達到最高值；‘紫冠’和‘熱那亞’種子的熱穩(wěn)蛋白含量呈上升趨勢，且差異明顯，在含水量在6%左右時均顯著高于對照（圖4）。這說明在菜豆種子老化過程中，超干處理阻止蛋白在老化過程中的變性，增加種子的抗老化能力。

圖4 不同含水量菜豆種子老化后熱穩(wěn)蛋白含量變化

經(jīng)過老化處理后，超干處理的3種菜豆品種種子的MDA含量顯著低于未經(jīng)超干的菜豆種子（圖5）。未經(jīng)超干的菜豆種子MDA含量最高，其中‘紫冠’變化最明顯，未超干的‘紫冠’種子MDA含量約是含水量為5.35%種子的1.84倍。說明適度超干處理保持種子的活力，種子耐藏性得到很大改善。

圖5 不同含水量菜豆種子老化后MDA含量變化

在人工加速老化過程中，超干處理后‘將軍’和‘熱那亞’種子O2-產(chǎn)生速率隨著含水量的降低而顯著降低，‘紫冠’脫水至6.89%時O2-產(chǎn)生速率呈下降趨勢且顯著低于未超干種子，在5.35%時有所回升，但仍顯著低于對照（圖6），未經(jīng)超干的3個菜豆品種種子O2-含量約為含水量在5.5%范圍種子O2-含量的2倍。表明超干處理后的菜豆種子抗老化能力更強。

圖6 不同含水量菜豆種子老化后O2-含量變化

2.5 超干處理對菜豆種子自由基清除系統(tǒng)的影響

在人工加速老化過程中，與未經(jīng)超干處理的種子相比，超干處理后的3個菜豆品種種子的SOD活性顯著增高，說明適度超干處理可以提高菜豆種子SOD活性水平（圖7）。

圖7 不同含水量菜豆種子老化后SOD含量變化

在人工加速老化過程中，種子POD酶活性與未超干種子相比有不同程度的上升，且不同含水量間POD酶活性差異顯著。3個品種POD酶活性在初始含水量時最低，‘將軍’種子在含水量為6.95%活性最高，‘紫冠’和‘熱那亞’品種種子在含水量分別為5.35%和5.01%時最高（圖8）。由此可見，適度超干可以提高種子的POD活性。

圖8 不同含水量菜豆種子老化后POD含量變化

在人工加速老化過程中，與未超干種子相比，超干處理的‘將軍’、‘紫冠’、‘熱那亞’種子的CAT活性明顯增高（圖9），‘將軍’和‘熱那亞’種子在含水量分別為6.95%和6.15%時最高，‘紫冠’種子含水量在5.35%活性最高，約是CK的1.74倍，變化明顯。說明超干處理可以使菜豆種子的CAT活性顯著增高。

圖9 不同含水量菜豆種子老化后CAT含量變化

3 結(jié)論與討論

菜豆種子為蛋白質(zhì)類種子，籽粒大，親水性強，且隨著含水量下降，‘將軍’和‘紫冠’種子出現(xiàn)了硬實現(xiàn)象。菜豆種子脫水速度較慢，‘將軍’種子經(jīng)過101天干燥含水量降至5.78%左右，‘紫冠’種子經(jīng)過110天含水量降至5.35%左右，‘熱那亞’種子經(jīng)過62天干燥至含水量5%。油脂類種子的含水量安全下限比較低（一般在1%～2%），淀粉類種子的含水量安全下限一般在4%～5%[23]，而蛋白質(zhì)類種子的含水量安全下限一般在3%左右，也有蛋白質(zhì)較高的豌豆、綠豆、豇豆的最適含水量為6%[24]。本研究表明，‘將軍’種子含水量在5.78%～6.95%時、‘紫冠’種子含水量在5.35%～6.89%時、‘熱那亞’種子含水量在5.01%～6.15%時，種子老化后的各項發(fā)芽和生理指標優(yōu)于自然含水量種子，可以利用室溫硅膠干燥法獲得‘將軍’、‘紫冠’、‘熱那亞’超干種子，這與其他高蛋白質(zhì)類種子較接近。

熱穩(wěn)定蛋白積累與種子耐脫水性的獲得相關(guān)[25]。朱誠[26]對超干大豆、花生種子研究中，發(fā)現(xiàn)超干可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。究其原因是菜豆種子內(nèi)部的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，或者與其他物質(zhì)發(fā)生某種反應，阻止蛋白的變性并增加了穩(wěn)定性。MDA就是脂質(zhì)過氧化反應最重要的產(chǎn)物之一，也是種子老化的基本原因[27]。本研究中，老化后的超干菜豆種子MDA含量有所積累，但是膜系統(tǒng)完整且含量低于未超干的菜豆種子，這與程紅焱[13]的研究結(jié)果相似。這可能是因為隨著含水量的降低，脫水面積增大，缺乏化學反應介質(zhì)，脂質(zhì)擁有較強的自衛(wèi)能力，可以在一定程度上抑制了種子老化過程中有害物質(zhì)的積累，膜系統(tǒng)完整性得到保持。試驗表明，超干可以提高種子貯藏穩(wěn)定性，究其原因自由基清除系統(tǒng)SOD、POD、CAT可以清除由自由基引起的脂質(zhì)過氧化。種子在貯存期間積累的有毒物質(zhì)會在種子吸漲時被恢復活性的酶清除，減少了對細胞膜的損傷，種子得以萌發(fā)[28]。適度超干處理可提高菜豆種子貯藏穩(wěn)定性。

就目前而言，種子超干最適合的含水量研究還沒有形成完善的體系，有許多問題仍然需要不斷探索。本研究也存在著一些不足，在菜豆種子的超干過程中，采用硅膠干燥的方法雖然安全溫和，但干燥速率緩慢且不容易控制，獲得了包括對照在內(nèi)共4種含水量。如何快速安全的干燥種子且能精準控制含水量范圍還是一大難題，這也是超干研究發(fā)展的方向。在超干研究中，為了加快試驗進度，自然老化種子方法使用較少，基本利用50℃以上高溫人工老化種子，人工老化種子雖然可以在短時間內(nèi)快速控制種子的劣變，但一定程度上并不能完全代替自然老化。2種方法對于超干種子具體的影響，還有待進一步深入研究。

綜上所述，‘將軍’種子含水量為5.78%～6.95%時儲藏較為適宜，‘紫冠’種子含水量為5.35%～6.89%時儲藏較為適宜，‘熱那亞’種子以含水量5.01%～6.15%時儲藏較為適宜，采用超干保存技術(shù)保存菜豆種子具有一定的可行性。