新疆地區(qū)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白的原核表達(dá)

蘇 燕，蘇 艷

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830052）

產(chǎn)氣莢膜梭菌是主要分布于人畜糞便及腸道中的一類(lèi)厭氧的條件性致病菌，最早稱為魏氏梭菌，該菌在分解動(dòng)物組織的糖分時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氣體，且絕大部分菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中都有莢膜形成，因而稱之為產(chǎn)氣莢膜梭菌[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌在世界各地都有存在，給全球養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重影響[2]。其致病性主要來(lái)源于產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的毒素，不同毒素的致病機(jī)制不同，在眾多外毒素中α、β、ε和ι是最主要的[3]，這4種外毒素會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，威脅著人和動(dòng)物的健康[4,5]?，F(xiàn)階段將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E、F、G7個(gè)細(xì)菌型[6]，其中A型和C型對(duì)人的致病性極強(qiáng)[7]。所有的產(chǎn)氣莢膜梭菌都分泌α毒素，A型菌分泌的α毒素量最大[8]。研究新疆地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白對(duì)該區(qū)域產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行以及防治具有指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

質(zhì)粒pET-30a載體（實(shí)驗(yàn)室保存），商品化的感受態(tài)，質(zhì)粒和基因組提取試劑盒、快切酶、T4快速連接酶，過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺、青霉素、還原性谷胱甘肽、誘導(dǎo)劑（IPTG）、低溫離心機(jī)等。

1.2 設(shè)計(jì)引物

在NCBI網(wǎng)址中下載編碼α毒素基因序列，并去掉信號(hào)肽片段，該基因共計(jì)927 bp，設(shè)計(jì)α毒素基因的引物，將設(shè)計(jì)好的基因引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，引物序列如表1所示，引物稀釋后凍存。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因引物序列

1.3 擴(kuò)增α毒素基因

用培養(yǎng)24 h后的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌提取基因組，并以此為模板，用1.2合成的引物PCR擴(kuò)增α毒素基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物加至1.2%瓊脂糖凝膠孔中，待電泳結(jié)束后回收α毒素基因片段。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用快切酶EcolⅠ和SalⅠ雙酶切α毒素基因與pET-30a載體，于37℃水浴鍋中酶切20 min后回收酶切產(chǎn)物，酶切后的α毒素基因和pET-30a載體用連接酶過(guò)夜連接，次日轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，將感受態(tài)復(fù)蘇后用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后選單菌落在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并以菌液為模板PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，隨后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并送至公司測(cè)序。

1.5 α毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中過(guò)夜培養(yǎng)，次日擴(kuò)大培養(yǎng)后保存菌液。選取9個(gè)高壓滅菌過(guò)的搖菌瓶，每個(gè)加入200 ml含有抗生素的培養(yǎng)基和2 ml的菌液培養(yǎng)，待菌液OD600值達(dá)到0.4～0.8時(shí)，將誘導(dǎo)試驗(yàn)分為3組，第一組為16℃過(guò)夜誘導(dǎo)，第二組為28℃過(guò)夜誘導(dǎo)，第三組為37℃誘導(dǎo)5 h。每組設(shè)置IPTG的濃度分別為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L。收集誘導(dǎo)后的菌液至離心瓶中，低溫重復(fù)離心清洗黏附在菌體表面的培養(yǎng)基，用Lysis equilibration buffer（LE Buffer）懸起菌體后進(jìn)行超聲破碎，設(shè)置破碎儀工作2 s、暫停5 s，超聲至菌液清亮、透明為宜，約需1.5 h。破碎結(jié)束后以上述同等條件離心，分別取40 μl上清液和沉淀各加入蛋白上樣緩沖液10 μl煮沸后點(diǎn)樣至SDS-PAGE蛋白凝膠孔中，設(shè)置電泳儀的工作電壓為200 V，約工作45 min。用考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后分析α毒素重組蛋白的表達(dá)水平。

1.6 重組蛋白的純化、濃縮

用LE Buffer平衡His-Tag Ni柱3～4次，將超聲破碎后的可溶性上清蛋白加入Ni柱，并將流出液反復(fù)加入Ni柱3～4次，使得重組蛋白與Ni柱充分結(jié)合。分別用LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM、130 mM、250 mM咪唑LE Buffer進(jìn)行洗脫。LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM咪唑清洗4個(gè)柱體積并收集最后流出的2 ml液體，130 mM、250 mM咪唑清洗并回收1個(gè)柱體積約為10 ml的清洗液，平衡、掛柱和清洗均采取約20滴/min的流速。分別取流穿液、LE Buffer和各個(gè)濃度的咪唑清洗液，用1.5中條件進(jìn)行電泳分析純化條件和純化后的純度。

將純化后的重組蛋白轉(zhuǎn)入用EDTA-鈉和EDTA煮沸處理過(guò)的透析袋中，透析袋長(zhǎng)約10 cm為宜，將透析袋放置于0.01 mmol/L的PBS溶液中進(jìn)行透析，PBS的體積約是重組蛋白體積的100倍。透析完成后將透析袋置于PEG 8 000中，以有效地吸出重組蛋白中的水分，達(dá)到濃縮的目的。

1.7 α毒素蛋白的Western-Blot分析

按照1.5中條件進(jìn)行電泳，將蛋白膠置于半干轉(zhuǎn)膜儀中的PVDF膜上并用濾紙包裹，設(shè)置轉(zhuǎn)膜儀電壓為15 V，待工作40 min后將PVDF膜轉(zhuǎn)移至5%的脫脂奶粉中過(guò)夜封閉，次日用TBST清洗3～4次后，用酶標(biāo)記的鼠抗組氨酸抗體室溫孵育1 h。同樣用TBST清洗3～4次，每次5～8 min，最后顯色后曝光。

2 結(jié)果

2.1 α表達(dá)載體的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴(kuò)增的基因條帶約1 194 bp，與預(yù)期值相符（圖1）。把此基因插入pET-30a載體后轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)后擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證（圖2）。提取質(zhì)粒雙酶切檢驗(yàn)（圖3），最后將測(cè)序合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)中。

圖1 PCR擴(kuò)增α基因

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

圖3 雙酶切鑒定

2.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

在16℃、28℃過(guò)夜誘導(dǎo)和37℃誘導(dǎo)5 h條件下，用0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L的IPTG篩選最佳的α毒素蛋白表達(dá)條件，結(jié)果表明IPTG的濃度為0.5 mmol/L時(shí)，采用37℃誘導(dǎo)5 h的表達(dá)條件，最有利于重組蛋白的表達(dá)（圖4）。

圖4 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件

2.3 重組蛋白的純化

SDS-PAGE電泳檢測(cè)流穿液和各個(gè)濃度梯度的咪唑洗脫液，結(jié)果顯示90 mM咪唑LE Buffer中含有較多的雜蛋白，但130 mM咪唑LE Buffer中幾乎沒(méi)有雜蛋白的存在，篩選出了90 mM咪唑LE Buffer能與雜蛋白很好地結(jié)合，達(dá)到清洗的目的，用250 mM咪唑LE Buffer可與α重組蛋白結(jié)合后達(dá)到洗脫的目的（圖5）。將含有重組蛋白的250 mM咪唑的洗脫液裝入透析袋后置于PBS中透析，用PEG 8 000濃縮后于-80℃凍存。

圖5 優(yōu)化純化條件

2.4 重組蛋白免疫原性檢測(cè)

重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后采用半干轉(zhuǎn)模儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，其結(jié)果顯示約58 kD處存在特異性條帶（圖6）。

圖6 α毒素蛋白的免疫印跡反應(yīng)

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌病一般是多種菌型的梭菌混合感染致使動(dòng)物患病，無(wú)特別有效的治療措施，抗生素治療效果不明顯，病死率較大[9]。產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的α毒素是一種多功能金屬酶，該酶屬于致死性毒素，能夠水解細(xì)胞膜的磷脂雙分子，破壞細(xì)胞膜的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，使機(jī)體發(fā)病[10]。α毒素的啟動(dòng)子可被大腸桿菌的聚合酶所識(shí)別從而啟動(dòng)該毒素基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，因此本試驗(yàn)選擇了原核表達(dá)載體pET30a和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，該蛋白的生產(chǎn)工藝成熟，且具有成本低、周期短的優(yōu)點(diǎn)。目前，對(duì)α毒素感染尚無(wú)有效的治療方法，免疫接種是預(yù)防該病的唯一途徑。由于該菌可寄生在腸道內(nèi)，屬于條件性致病菌，且該菌的致病過(guò)程是其分泌的毒素發(fā)揮作用。因此，單純地在機(jī)體中檢測(cè)該菌，不能說(shuō)明是產(chǎn)氣莢膜梭菌病，在機(jī)體中檢測(cè)到相應(yīng)的毒素即可確診。本試驗(yàn)成功誘導(dǎo)表達(dá)了α毒素蛋白并對(duì)其進(jìn)行了純化，獲得了高純度、高濃度且具有生物學(xué)活性的α毒素蛋白，為地區(qū)性的產(chǎn)氣莢膜疫苗研發(fā)和進(jìn)一步研制本地區(qū)α抗體ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。