黑水虻抗菌肽的研究進展

王 青，陳 俊，李瀟瀟，侯梅芳

上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，上海 201418

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是昆蟲在受到微生物感染或意外傷害時，由脂肪體內(nèi)合成并釋放到血淋巴中的一類小分子活性多肽，在體液免疫防御中發(fā)揮了重要作用。AMPs具有強堿性、熱穩(wěn)定性和廣譜抗菌活性，并對真菌、病毒、寄生蟲及癌細胞也具有一定的殺滅作用[1-2]。由于AMPs具有廣泛的生物學(xué)活性，尤其是對某些耐藥性病原菌也有一定的殺滅作用，因此被認為是理想的抗生素替代物，在畜牧業(yè)、食品醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域都具有巨大應(yīng)用價值和市場潛力[3]。

黑水虻，英文名black soldier fly，又稱亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.)，原產(chǎn)于美洲，目前是全世界廣泛分布的雙翅目水虻科昆蟲，生命周期短，繁殖速度快。其幼蟲主要靠取食腐爛有機物、動物糞便或餐廚垃圾等有機廢棄物獲取營養(yǎng)，并能夠高效轉(zhuǎn)化為昆蟲蛋白，經(jīng)黑水虻處理過的糞便可以成為優(yōu)質(zhì)有機肥[4]。由于黑水虻幼蟲取食時機體暴露于高濃度有害物中，復(fù)雜的環(huán)境因子誘使其產(chǎn)生AMPs等免疫活性物質(zhì)來抵抗病原微生物[5]，但黑水虻蟲體中幾乎檢測不出沙門氏菌等病原菌，因此還被作為飼料使用[6]。隨著黑水虻養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，黑水虻體內(nèi)強大的免疫系統(tǒng)引起了學(xué)術(shù)界的關(guān)注。

本文主要綜述了近年來包括黑水虻在內(nèi)的昆蟲抗菌肽的種類、結(jié)構(gòu)特征、抑菌活性及生產(chǎn)應(yīng)用，分析了國內(nèi)外在該領(lǐng)域取得的研究進展，為研究黑水虻抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系提供了思路，同時也為開發(fā)黑水虻抗菌肽產(chǎn)品提供了理論支持。

1 黑水虻抗菌肽的種類及結(jié)構(gòu)特征

1974年，研究人員首次在接種了細菌的巨型蠶蛾蛹中觀察到昆蟲的抗菌活性，6年之后第一個昆蟲AMP(cecropin)從盲蝽蛹中純化出來，隨后幾十年的研究已經(jīng)鑒定出多類型的AMPs[2]，在AMPs數(shù)據(jù)庫APD(http：//aps.unmc.edu/AP)列出的3 087種AMPs中有305種來自昆蟲[7]。昆蟲抗菌肽是帶有正電荷且具有兩親性的陽離子多肽，一般由幾十個氨基酸殘基組成，其空間結(jié)構(gòu)為線性或帶環(huán)狀[8]，二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β-折疊組成。根據(jù)其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征大致可以分為三類，分別為無半胱氨酸殘基的線性α-螺旋肽(天蠶素類，cecropin and moricin)，具有6～8個保守半胱氨酸殘基、由3或4個二硫鍵橋的β-折疊結(jié)構(gòu)多肽(防御素類，defensinh和drosomycin)，富含脯氨酸和甘氨酸等特定氨基酸殘基的抗菌肽(apidaecin、drosocin、lebocin、attacin和gloverin)[9]。在昆蟲抗菌肽中，天蠶素、防御素、脯氨酸肽和攻擊素是比較普遍的[2]，常見的雙翅目昆蟲抗菌肽的名稱和其抑菌范圍見表1。

表1 雙翅目昆蟲抗菌肽的種類和抑菌作用[8]Table 1 Species and antimicrobial activity of antimicrobial peptides from Diptera [8]

近年來，越來越多的學(xué)者從事黑水虻幼蟲抗菌肽的研究，并分離出多種AMPs，如天蠶素[10]、防御素[11]和攻擊素[12]，并驗證了其抗菌活性。

1.1 天蠶素類抗菌肽

天蠶素最初是從大蠶蛾(cecropia moth)的血淋巴中分離出來的[13]，是一類陽離子AMPs，一般含有31～39個氨基酸殘基，不含半胱氨酸，所以不能形成分子內(nèi)二硫鍵，大多數(shù)天蠶素在C端被酰胺化，酰胺化能促進天蠶素與脂質(zhì)體的相互作用，酰胺化對其抗菌活性也具有重要作用[2]。其N端區(qū)域具有強堿性，且多含一個色氨酸殘基，可形成雙親螺旋結(jié)構(gòu)[8]。Park等[10]從黑水虻幼蟲血淋巴中提取了天蠶素樣肽(CLP1)，純化測定其分子量為4 840 Da。在NCBI BLAST比對中，發(fā)現(xiàn)CLP1的氨基酸序列與果蠅天蠶素C的同源性為60%，其特征為陽離子、線性、α-螺旋和兩親性多肽，并對革蘭氏陰性菌有抑菌活性。Park等進一步采用RACE-PCR方法對N-末端氨基酸測序鑒定的新型CLPs的cDNA序列進行分析，獲得了3個CLP基因(CLP1～3)，將CLP1～3成熟肽的氨基酸序列與報道的雙翅目昆蟲天蠶素氨基酸序列比較顯示，相似程度為60%～65%(見圖1)。

圖1 黑水虻天蠶素CLP1～3氨基酸序列與雙翅目昆蟲天蠶素的比對[10]Fig.1 Multiple alignment of amino acid sequences of H.illucens CLP1-3 with dipteran cecropins [10]注：*相同氨基酸；黑色：保守的氨基酸序列，下同。Note:*Consensus amino acids;Black box:Conserved amino acids,the same below.

1.2 防御素類抗菌肽

此類AMPs主要有防御素(defensins)和果蠅毒素(drosomycins)[8]，昆蟲防御素一般由29～34個氨基酸組成的富含二硫鍵的陽離子型多肽，氨基酸序列中都含有6個保守半胱氨酸和3個分子內(nèi)二硫鍵，其中2個二硫鍵連接C端β-片層和α-螺旋，第3個二硫鍵連接N端和第二個β-片層形成回路，即單個α-螺旋和兩個反向平行的β-片層結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成穩(wěn)定的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)[14]。Park等[11]通過注射金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)黑水虻幼蟲產(chǎn)生抗菌肽，提取血淋巴并使用固相萃取和反相色譜法純化得到新型防御素樣肽(defense-like peptide 4，DLP4)，分子量為4 267 Da，DLP4對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出較強的抗菌活性，對革蘭氏陰性菌沒有活性，新型防御素(DLP)是第一個從黑水虻體內(nèi)分離出來的抗菌肽。為了分析N端氨基酸序列中新發(fā)現(xiàn)的DLP的cDNA序列，Park等采用RACE-PCR方法對黑水虻的AMP基因進行全序列分析，得到4個不同的DLP基因(DLP1-4)，通過DLP1-3和DLP4相比較，ORF中成熟肽和堿性氨基酸數(shù)量存在顯著性差異，該氨基酸被認為是AMP抗菌活性的關(guān)鍵氨基酸。進一步將DLP1-4成熟肽的氨基酸序列與報道的雙翅目昆蟲防御素氨基酸序列比較表明，相似程度為72.5%～75%(見圖2)，特別是半胱氨酸的位置與雙翅目昆蟲是相同的，N端回路、α-螺旋、β鏈的氨基酸的序列是相當保守的。

圖2 黑水虻防御素DLP1-4的氨基酸序列與雙翅目昆蟲防御素比對[11]Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequences of H.illucens DLP1-4 with dipteran defensins [11]

1.3 富含特殊氨基酸的抗菌肽

此類AMPs一般指富含脯氨酸和甘氨酸的抗菌肽，富含脯氨酸的抗菌肽主要包括蜜蜂抗菌肽(apidaecins)，果蠅素(drosocins)和家蠶抗菌肽(lebocins)等，由14～39個氨基酸殘基，根據(jù)分子大小可分為兩個亞族：短鏈亞族(小于20個氨基酸殘基)和長鏈亞族(大于20個氨基酸殘基)[15]，其中一個是高度保守的結(jié)構(gòu)域，具有抗菌活性；另一個結(jié)構(gòu)域有更多的變量，起到特異性靶向的作用[8]，并且對革蘭氏陰性菌有較強的抗菌活性[16]。此外，富含甘氨酸的抗菌肽，分子量大小在8～30 kDa，含14%～22%的甘氨酸殘基，具有O-糖基化，如攻擊素(attacins)、雙翅肽(diptericins)、肉蠅毒素(sarcotoxins Ⅱ)、天蠶葛老素(gloverins)等都屬于這一類[17,18]。Shin等[12]通過對黑水虻免疫脂肪體制備的cDNA文庫進行篩選，獲得編碼類攻擊素(attacin)蛋白的cDNA并進行克隆得到新型黑水虻攻擊素(HI-attacin)，預(yù)測由169個氨基酸組成，分子量為17.7 kDa。HI-attacin對大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)均具有抗菌活性。與其他雙翅類attacins相比，HI-attacin的N端G1結(jié)構(gòu)域短于其它雙翅目昆蟲，含46個氨基酸；而C端G2結(jié)構(gòu)域較G1區(qū)保守，包含120個氨基酸(見圖3)。

圖3 黑水虻攻擊素HI-attacin的氨基酸序列與雙翅目昆蟲攻擊素比對[12]Fig.3 Multiple alignment of amino acid sequences of H.illucens attacin with dipteran defensins [12]

2 作用機制

AMPs作用機制是非常復(fù)雜的，可以通過多種機制殺死細菌，包括膜破壞，干擾細菌代謝以及靶向細胞質(zhì)成分[19]。關(guān)于AMPs作用機制主要有離子通道學(xué)說、抑制細胞呼吸學(xué)說、抑制細菌細胞壁的形成學(xué)說、胞內(nèi)損傷假說等幾種觀點來解釋[20]。不同AMPs的作用機制可能不一致，尚有待進一步研究。

2.1 作用于細胞膜機制

由于AMPs帶陽離子，Ongey等[21]認為AMPs可通過靜電或疏水與微生物陰離子表面的相互作用和插入磷脂雙分子層發(fā)揮作用，以改變膜的通透性。AMPs可以在細菌細胞質(zhì)膜上穿孔而形成離子孔道，造成細菌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，而最終導(dǎo)致細菌死亡。因此，AMPs與膜之間的相互作用與AMPs的抗菌活性直接相關(guān)。目前，主要有四種作用模型用于描述AMPs作用于細胞膜：桶形壁模型、地毯模型、環(huán)形孔模型和凝聚模型[22](圖4)。例如，天蠶素和天蠶素樣肽(cecropins)對G-抗菌活性要強于G+，它與細胞膜相接觸是以其長軸α-螺旋結(jié)構(gòu)域平行于脂質(zhì)雙分子層表面，極性殘基與磷脂相互作用，非極性殘基埋入膜的疏水核心。在高濃度時，cecropins形成地毯狀結(jié)構(gòu)破壞細胞膜，具有類似洗滌劑的特性。在低濃度時，cecropins形成孔隙影響細胞電解質(zhì)平衡，并最終導(dǎo)致細菌死亡[7]。

圖4 抗菌肽作用細胞膜機制模型[22]Fig.4 Mechanism model of antibacterial peptide acting on cell membrane [22] 注：A.毯式模型；B.桶板模型；C.環(huán)孔模型；D.聚集模型。Note:A.The carpet model;B.The barrel-stave model;C.The toroidal pore model;D.The aggregate model.

2.2 細胞內(nèi)殺傷機制

富含脯氨酸的抗菌肽(pyrrhocoricin、drosocin和apidaecin)與其他類型的抗菌肽不同，主要是抗G-。其作用方式不涉及膜的溶解，而是通過進入易感細胞在細胞內(nèi)部產(chǎn)生功效。通過定位于細胞內(nèi)相應(yīng)位點阻礙或抑制細胞組分的合成，從而對細胞造成殺傷作用[23]。AMPs在細胞內(nèi)部的靶點主要是70 kDa熱休克蛋白DnaK[3]。它們還可以通過與核酸結(jié)合而干擾DNA和RNA的合成[24](圖5)，這一特性使它們成為一種新型潛在的細胞穿透肽。

圖5 抗菌肽細胞內(nèi)殺傷機制模型[23]Fig.5 Model of intracellular killing mechanism of antimicrobial peptides [23]

3 黑水虻抗菌肽的生產(chǎn)制備

目前AMPs主要通過3種途徑獲取，一是直接從昆蟲體內(nèi)分離純化；二是化學(xué)合成；三是生物工程法[25]。根據(jù)近幾年的研究報道，黑水虻抗菌肽主要采用從蟲體直接分離提純和異源表達。Park等[26]最初研究黑水虻抗菌肽時，直接將黑水虻幼蟲凍干粉用甲醇萃取，再使用高效液相色譜法從幼蟲提取物中分離出具有廣譜抗菌活性的黑水虻抗菌肽并用Edman降解法鑒定防御素的氨基酸序列。由于直接提取分離得到的AMPs產(chǎn)量不高，而化學(xué)合成法的提取工藝復(fù)雜，且成本高、耗時長，因此這兩種途徑都不足以達到規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，從而限制了AMPs的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[18]。近年來，國內(nèi)外研究人員開始利用基因工程的方法生產(chǎn)制備黑水虻抗菌肽，通過AMPs基因克隆到細菌和真菌載體進行重組融合表達[27]。重組表達制備AMPs的工藝在不斷優(yōu)化，但仍遠高于傳統(tǒng)藥物的制造成本。

3.1 黑水虻抗菌肽的重組表達

3.1.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽

從20世紀80年代開始，人們就運用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達AMPs，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點。在所有基因工程菌生產(chǎn)AMPs的方法中，大腸桿菌表達系統(tǒng)是最常見的。但是AMPs對宿主細胞的毒性抑制了其在大腸桿菌體內(nèi)的表達量，因此多采用融合蛋白方式來降低昆蟲抗菌肽對大腸桿菌菌株的毒性，表達后再經(jīng)化學(xué)裂解或者酶解處理后得到有抗菌活性的表達產(chǎn)物[20]。Elhag等[28]從黑水虻中分離出189 bp新型AMPs基因stomoxynZH1，利用PCR技術(shù)克隆出AMPs基因并連接到表達載體pET32a，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中表達，結(jié)果表明基因工程菌株的表達產(chǎn)物重組肽(Trx-stomoxynZH1)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。

3.1.2 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性細菌，具有非致病性和分泌蛋白能力強的特性，是目前原核表達系統(tǒng)中表達和分泌外源蛋白的理想宿主，成為原核表達系統(tǒng)中的一種重要的模式菌株[29]。Xu[30]利用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體PMA5質(zhì)粒和PAX01質(zhì)粒構(gòu)建整合型大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體質(zhì)粒PAX01-KANA，成功構(gòu)建含有黑水虻幼蟲抗菌肽 DLP4、沙蛾抗菌肽SMFP和天蠶素融合基因Cecropin AD三段抗菌肽基因的枯草芽孢桿菌工程菌。結(jié)果顯示，工程菌株發(fā)酵液對大腸桿菌有明顯的抑菌活性，工程菌在LB 液體培養(yǎng)基中生長良好。Ji等[31]將CAM-W、EDDIE和信號肽SacB融合基因轉(zhuǎn)移到由啟動子Pg/v控制的pDM03載體中，轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌內(nèi)，形成高效表達的重組枯草芽孢桿菌WB700表達系統(tǒng)，在上清發(fā)酵液中Cecropin A-melittin濃度高達159 mg/L。

以上兩種表達系統(tǒng)是目前基因工程領(lǐng)域研究應(yīng)用最廣泛、遺傳表達圖譜最清楚的原核表達系統(tǒng)。雖然大腸桿菌表達系統(tǒng)應(yīng)用較多，但表達的蛋白質(zhì)以包含體形式存在，與大腸桿菌內(nèi)毒素不易分離，缺少蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工過程，且雜蛋白多，純化步驟復(fù)雜[30]?？莶菅挎邨U菌的表達系統(tǒng)研究雖然起步較晚，但其本身具有一些獨特的優(yōu)勢：安全無毒、較強的蛋白分泌能力和發(fā)酵工藝成熟[29]，因此也受到研究人員的關(guān)注。此外，還有真核表達系統(tǒng)和桿狀病毒表達系統(tǒng)等，隨著研究的不斷深入有望成為滿足黑水虻抗菌肽工業(yè)化生產(chǎn)需求的表達系統(tǒng)[20]。

4 黑水虻抗菌肽的應(yīng)用前景

昆蟲抗菌肽具有抗菌活性、抗病毒活性、抗寄生蟲活性、抗腫瘤細胞活性和抗炎活性等生物學(xué)活性[8]，因此可以應(yīng)用在農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品以及保健品等領(lǐng)域。目前，黑水虻幼蟲主要集中用于畜禽糞便等有機垃圾的無公害處理[32]，研究人員也在加強黑水虻抗菌肽及其他系列產(chǎn)品的開發(fā)。

4.1 在飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用

黑水虻含有較豐富的粗蛋白質(zhì)且氨基酸種類較齊全，不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和類胡蘿卜素等，還能提取幾丁質(zhì)、AMPs等生物活性物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料原料[33]。Yu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，添加黑水虻幼蟲可以提高豬肉的品質(zhì)。黑水虻幼蟲抗菌肽可以作為飼料添加劑提高畜禽免疫力，提高畜禽生長性能。Ren等[35]報道，在飼料中添加500 mg/kg的AMPs可顯著提高斷奶仔豬血液中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA與血清總補體CH50等免疫因子的含量。Dong等[36]研究在飼養(yǎng)鯉魚時添加AMPs，可以降低血清中的甘油三酸酯水平，增強抗氧化性并提高鯉魚的免疫力。結(jié)果表明，適當濃度的AMPs作為鯉魚飼料中的補充劑可以提高生長性能。由于AMPs擁有良好的理化特性，所以在飼料加工過程中也不會丟失活性，還可以提高飼料的品質(zhì)和延長保質(zhì)期。

4.2 在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

目前很多企業(yè)已在AMPs藥物方面做了大量的研究，并有一些含AMPs成分的產(chǎn)品上市。由于抗生素濫用導(dǎo)致多重耐藥菌的產(chǎn)生，因此AMPs被認為是理想的抗生素替代品[27]。此外，AMPs的抗癌效果也被國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。Lee等[37]分離出黑水虻幼蟲的血淋巴中的抗菌肽HP/F9，證實該肽在體外有效抑制肺炎克雷伯菌的生長，并有效保護小鼠免受肺炎克雷伯菌的感染，這項研究為HP/F9可用作新型抗菌物質(zhì)，用于治療細菌感染。夏嬙課題組對黑水虻幼蟲抗菌肽的醫(yī)用價值做了大量研究，發(fā)現(xiàn)其可以抑制鼻喉癌腫瘤細胞生長[38]。目前已有大量不同治療目的肽類藥物進入臨床或批準上市，如GRN-1201、WT-2725、ITK-1等[39]。昆蟲的抗菌肽的藥用價值在我國中醫(yī)藥中很早就有記載，如將家蠅幼蟲洗凈曬干后與其他中藥配制，用于治療感染性疾病[40]。

4.3 在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用

食品安全中最主要的問題就是微生物污染和化學(xué)防腐劑的添加，AMPs作為天然的防腐劑，具有廣闊的應(yīng)用前景[41]。AMPs在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用包括兩個方面，一是在食品原料控制環(huán)節(jié)應(yīng)用，減少或替代抗生素的使用，提高食品加工原料的安全品質(zhì)；二是在食品防腐保鮮環(huán)節(jié)，作為高效、安全生物防腐劑應(yīng)用于食品加工、儲運等諸多環(huán)節(jié)，解決食品防腐劑的殘留問題，同時也減少環(huán)境耐藥性菌株的產(chǎn)生，進而改善食品安全環(huán)境條件[42]。Secci等[43]用黑水虻幼蟲粉替代大豆粉飼養(yǎng)母雞，雞蛋的質(zhì)量明顯提高，保障了食品原材料的安全。Choi等[44]從黑水虻幼蟲中提取到抗菌肽ME，對導(dǎo)致食品污染的宋內(nèi)志賀氏菌有較強的抑制活性。此外，不同種類的黑水虻抗菌肽還對導(dǎo)致食源性污染的大腸桿菌[10]、金黃色葡萄球菌[11]也有抑制作用。

4.4 在化妝品添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用

AMPs由于其獨特的抗菌、無毒和無刺激性等優(yōu)點，也被用于化妝品生產(chǎn)。昆蟲抗菌肽不僅可作為營養(yǎng)成分，更主要的是其抗菌和美容作用具有獨特的優(yōu)勢和廣泛的市場潛力。Tonk等[45]提出將具有抗皮膚癌效果的AMPs和個人護理產(chǎn)品，可以在皮膚癌在癥狀變得明顯之前通過消除新生癌細胞來預(yù)防和增強人體健康。已證實多種抗菌肽可以對抗痤瘡丙酸桿菌而具有治療痤瘡的潛能[46,47]。黑水虻抗菌肽CLP1對銅綠假單胞菌有抑制作用[10]，再加上AMPs的抗炎作用[48]，也為開發(fā)黑水虻抗菌肽消炎祛痘的化妝品提供了新的思路。

5 總結(jié)

黑水虻作為一種新型“資源昆蟲”，近年來備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。黑水虻體內(nèi)可生產(chǎn)抗菌肽等具有高附加值的產(chǎn)品，對黑水虻養(yǎng)殖業(yè)帶來了新的發(fā)展。黑水虻抗菌肽不僅具有廣譜抗菌效果，還具備抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤細胞和抗炎等活性，與傳統(tǒng)抗生素相比有很大的優(yōu)勢，在飼料、食品、醫(yī)藥與化妝品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，成為了目前生物活性肽的研究熱點之一。但黑水虻抗菌肽天然提取難度較大，化學(xué)合成成本過高，基因工程表達表達量偏低，其制備技術(shù)制約了其大規(guī)模的生產(chǎn)，此外，黑水虻抗菌肽體內(nèi)活性機制也有待進一步研究明確。隨著基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進步，我們相信黑水虻抗菌肽在不遠的將來會實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，并帶來更大的經(jīng)濟效益和社會效益。