基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討連花清瘟膠囊入血成分干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴防治新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制

王海娟，韓玉潔，張曉雪，李文瑾，郭秋紅,2,3*

1河北中醫(yī)學(xué)院；2河北省中藥組方制劑技術(shù)創(chuàng)新中心；3河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，石家莊 050200

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是由冠狀病毒感染引起的，以發(fā)熱、乏力、干咳為主要臨床特征，部分患者在發(fā)病一周后迅速轉(zhuǎn)為重癥，嚴(yán)重者可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等狀態(tài)。值得注意的是，少數(shù)早期輕癥患者，后期突然加重，導(dǎo)致多器官衰竭而死亡，其主要原因是引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴[1]。

細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)又稱炎癥風(fēng)暴和高細(xì)胞介質(zhì)癥(hypercytokinemia)，主要由于免疫系統(tǒng)失調(diào)后多種細(xì)胞因子迅速大量釋放，導(dǎo)致肺組織廣泛水腫，引起急性肺損傷，與COVID-19的不良預(yù)后密切相關(guān)，是疾病進(jìn)展的重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)，最終可發(fā)展為ARDS、MODS，甚至死亡[2,3]。由此可見(jiàn)，通過(guò)抗炎治療可能是遏制細(xì)胞因子風(fēng)暴防治COVID-19的一種有效方法。

連花清瘟膠囊(簡(jiǎn)稱“連花清瘟”)作為呼吸系統(tǒng)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件代表中成藥，主要由銀翹散和麻杏甘石湯化裁而來(lái)，包括金銀花、連翹、大黃等13味中藥，具有清瘟解毒，宣肺泄熱的功效。已有研究證實(shí)[4]，連花清瘟通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，明顯改善患者發(fā)熱、咳嗽、咳痰、氣促、乏力等相關(guān)癥狀，使轉(zhuǎn)重比率明顯下降，對(duì)治療COVID-19具有十分重要的意義。本研究將以連花清瘟入血成分為基礎(chǔ)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴防治COVID-19可能作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 連花清瘟入血成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定連花清瘟入血成分[5]，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索連花清瘟入血成分相關(guān)靶點(diǎn)，利用中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)連花清瘟入血成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。通過(guò)UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將其轉(zhuǎn)換成與之相對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選及韋恩圖

利用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，OMIM(https://www.omim.org/)以及Drugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)以“Novel coronavirus pneumonia”“Cytokine storm”為關(guān)鍵詞收集疾病相關(guān)蛋白基因，刪除重復(fù)靶基因，作為COVID-19與細(xì)胞因子風(fēng)暴疾病靶點(diǎn)，并利用在線韋恩分析工具Venny 2.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)映射篩選出連花清瘟入血成分對(duì)COVID-19以及細(xì)胞因子風(fēng)暴交集作用靶點(diǎn)。

1.3 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

獲取的連花清瘟入血成分以及與疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并利用“Analyze Network”功能對(duì)其進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲取主要有效化合物。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將連花清瘟入血成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相交集部分導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，把蛋白物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，隱藏單獨(dú)靶點(diǎn)，其余參數(shù)不變，獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù)文件，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)degree值制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并以degree值大于中位數(shù)篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 GO富集和KEGG通路分析

選取連花清瘟入血成分干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴防治COVID-19靶點(diǎn)，導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)，分析基因本體論(GO)富集和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路，物種與背景均設(shè)置為“Homo sapiens”(P<0.01)進(jìn)行操作，并按照count進(jìn)行排序，篩選排名靠前的GO富集和KEGG通路，并通過(guò)Origin 2019軟件工具，對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化作圖。

1.6 構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)篩選得到的連花清瘟入血成分與疾病共同靶點(diǎn)，與KEGG信號(hào)通路一同導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

基于“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)與PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)degree值選取排名前5個(gè)成分與前5個(gè)靶基因進(jìn)行分子對(duì)接。首先從ZINC(http://zinc.docking.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心化合物相關(guān)mol2格式文件，通過(guò)PDB(https://www.rcsb.org/)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載含有原配體的3D結(jié)構(gòu)PDB格式文件，應(yīng)用PyMol軟件刪除蛋白水分子，并拆分蛋白與配體，利用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，最后用PyMol對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理并作圖。

1.8 檢索多器官組織損傷、免疫損傷和SARS相關(guān)靶點(diǎn)

通過(guò)GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“SARS”“Liver injury”“Renal injury”“Lung injury”“Cardiovascular injury”“Immune injury”為檢索詞，收集多器官組織損傷、免疫損傷相關(guān)靶點(diǎn)，利用在線工具Draw Venn Diagram分析連花清瘟入血成分與多器官組織損傷、免疫損傷和SARS之間的交集靶點(diǎn)，制作韋恩圖。并分別將其交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行KEGG通路分析，通過(guò)Origin對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 篩選連花清瘟入血成靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)并制作韋恩圖

通過(guò)文獻(xiàn)查閱確定連花清瘟22個(gè)入血成分，剔除無(wú)靶點(diǎn)的成分，一共17個(gè)連花清瘟入血活性成分(見(jiàn)表1)，借助TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)共收集得到237個(gè)靶點(diǎn)。利用GeneCards、OMIM以及Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)查找COVID-19及細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)靶點(diǎn)，其中收集COVID-19靶點(diǎn)451個(gè)，細(xì)胞因子風(fēng)暴靶點(diǎn)303個(gè)，篩除重復(fù)靶點(diǎn)得到685個(gè)。將連花清瘟入血成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.0進(jìn)行繪制韋恩圖，如圖1所示。

表1 連花清瘟入血成分Table 1 Absorbed components of Lianhua Qingwen

圖1 成分與疾病靶點(diǎn)交集分布Fig.1 Intersection distribution of components and disease targets

2.2 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖與核心化合物

17個(gè)入血成分和47個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2所示，其中網(wǎng)絡(luò)共有74個(gè)節(jié)點(diǎn)，176條邊，藍(lán)色代表靶點(diǎn)，黃色代表成分，紅色代表疾病與中藥名稱；利用內(nèi)部“Analyze Network”功能，并根據(jù)degree值進(jìn)行分析，度值越高，說(shuō)明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。結(jié)果顯示大黃素(emodin)、芒柄花黃素(formononetin)、蘆丁(rutin)、沒(méi)食子酸(gallic acid)、甘草素(liquiritigenin)成分在網(wǎng)絡(luò)中排名較高，可能是連花清瘟入血成分干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴防治COVID-19重要活性成分。

圖2 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Herbs-components-targets-disease” network

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)制作及篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

將17個(gè)入血成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相映射得到47個(gè)相交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置蛋白互作綜合得分> 0.4，隱藏單獨(dú)靶點(diǎn)，其余參數(shù)不變，得到PPI網(wǎng)絡(luò)信息，導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)degree值制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示，其中節(jié)點(diǎn)表示每個(gè)蛋白，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連線表示蛋白之間的相互作用關(guān)系；以“degree >中位數(shù)(20)”篩選出核心靶點(diǎn)22個(gè)(見(jiàn)表2)，連花清瘟入血成分可能與核心靶點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮其藥理作用。

表2 連花清瘟入血成分關(guān)鍵靶點(diǎn)信息Table 2 Information on the key targets of absorbed components of Lianhua Qingwen

圖3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI protein interaction network

2.4 GO富集和KEGG通路分析

把得到的47共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物功能注釋，獲得GO條目174個(gè)(P<0.01)，分別包括生物過(guò)程(BP)129個(gè)，細(xì)胞組成(CC)15個(gè)，分子功能(MF)30個(gè)，根據(jù)count值選取各自排名前10個(gè)條目繪制柱狀圖，如圖4所示，其中生物過(guò)程主要與炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、免疫反應(yīng)(immune response)等相關(guān)；細(xì)胞組成主要富集在細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、核(nucleus)、線粒體(mitochondrion)等；分子功能主要涉及在蛋白結(jié)合(protein binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等。KEGG通路分析共富集于83個(gè)條目(P< 0.01)，篩選排名靠前的20個(gè)條目進(jìn)行可視化分析，繪制氣泡圖，如圖5所示，主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-κB signaling pathway)等。

圖4 GO功能分析Fig.4 GO functional analysis

圖5 KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis

2.5 構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)路圖

47個(gè)靶點(diǎn)，83條KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖6所示，其中網(wǎng)絡(luò)共有132個(gè)節(jié)點(diǎn)，790條邊，利用內(nèi)部的“Analyze Network”功能進(jìn)行分析，在47個(gè)靶點(diǎn)中PIK3CG、AKT1、RELA、TNF、IKBKB、JUN、IL6、TP53、PRKCA、MAPK14、PRKCB、IL1B、TGFB1、CASP3、GSK3B、EGF、CDKN1B、BAX、BCL2L1、CSF2、NOS2共參與10條以上信號(hào)通路，為富集較多的基因，提示這些基因與連花清瘟入血成分作用機(jī)制高度相關(guān)。

圖6 “靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.6 “Targets-pathways” network

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果分析

本研究將emodin、formononetin、rutin、gallic acid、liquiritigenin核心化合物與AKT1、IL-6、TP53、JUN、TNF核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果表明化合物與靶點(diǎn)有良好的結(jié)合能力，其結(jié)合能越小表示結(jié)合活性越高，化合物越容易與靶點(diǎn)結(jié)合。結(jié)果見(jiàn)表3所示，核心化合物emodin分別與AKT1、JUN、TNF、ACE2結(jié)合能均小于-8 kcal/mol；Liquiritigenin與TNF結(jié)合能最低，其次為emodin與JUN，表明liquiritigenin、emodin與TNF、JUN結(jié)合活性最強(qiáng)；而emodin通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)MET-111、ASN-114形成氫鍵作用。分子對(duì)接情況如圖7所示。

圖7 化合物與靶點(diǎn)分子對(duì)接圖Fig.7 Molecular docking diagram of compounds and target注：a.大黃素-JUN；b.甘草素-TNF；c.芒柄花黃素-TNF；d.蘆丁-AKT1。Note: a.Emodin-JUN;b.Liquiritigenin-TNF;c.Formononetin-TNF;d.Rutin-AKT1.

表3 化合物與靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of compound and target

2.7 連花清瘟入血成分對(duì)多器官組織損傷、免疫損傷和SARS的作用

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Liver injury”相關(guān)靶點(diǎn)7 842個(gè)，“Renal injury”靶點(diǎn)6 685個(gè)，“Lung injury”靶點(diǎn)8 484個(gè)，“Cardiovascular injury”靶點(diǎn)6 513個(gè)，“Immune injury”靶點(diǎn)7 343個(gè)，“SARS”靶點(diǎn)1 688個(gè)。為了進(jìn)一步分析連花清瘟入血成分對(duì)多器官組織損傷以及免疫損傷是否有調(diào)控作用，把連花清瘟入血成分靶點(diǎn)與器官組織損傷、免疫損傷靶點(diǎn)之間取交集，并制作韋恩圖，如圖8所示，交集靶點(diǎn)個(gè)數(shù)與比例見(jiàn)表4。

圖8 連花清瘟入血成分與多器官組織損傷和免疫損傷、SARS韋恩圖Fig.8 Venn diagram of absorbed components of Lianhua Qingwen and multiple organ tissue injury,immune injury and SARS注：a.連花清瘟入血成分；b.肺損傷；c.肝損傷；d.腎損傷；e.心血管損傷.f.免疫損傷；g.SARS。Note: a.absorbed components of Lianhua Qingwen;b.Lung injury;c.Liver injury;d.Renal injury;e.Cardiovascular injury;f.Immune injury;g.SARS.

表4 連花清瘟入血成分與多器官組織損傷、免疫損傷和SARS靶點(diǎn)信息Table 4 Target information of absorbed components of Lianhua Qingwen and multiple organ tissue injury,immune injury and SARS

將連花清瘟入血成分與SARS得到的76個(gè)交集靶點(diǎn)，多器官組織損傷130個(gè)交集靶點(diǎn)，免疫損傷133個(gè)交集靶點(diǎn)，分別導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路分析，并篩選各自排名靠前的12個(gè)條目進(jìn)行繪制條形圖，如圖9所示，結(jié)果顯示多器官組織損傷、免疫損傷和SARS主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等。

圖9 連花清瘟入血成分與SARS、多器官組織損傷和免疫損傷KEGG通路分析Fig.9 KEGG pathway analysis of absorbed components of Lianhua Qingwen and multiple organ tissue injury,immune injury and SARS

3 討論

本研究通過(guò)查閱文獻(xiàn)得出17個(gè)連花清瘟有效入血成分，利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得到emodin、formononetin、rutin、gallic acid、liquiritigenin核心成分；獲得47個(gè)連花清瘟入血成分干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴防治COVID-19潛在作用靶點(diǎn)，包括AKT1、IL-6、TP53、JUN、TNF、CASP3、IL1B、EGF等22個(gè)核心靶點(diǎn)。為了更好的詮釋靶點(diǎn)涉及的功能，本研究對(duì)47個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行了GO富集分析和KEGG通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連花清瘟入血成分作用機(jī)制主要富集RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性正調(diào)控(positive regulation of NF-KappaB transcription factor activity)等與炎癥相關(guān)的生物過(guò)程；KEGG通路分析主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-κB signa-ling pathway)等。分子對(duì)接顯示連花清瘟入血成分中emodin、formononetin、rutin、gallic acid、liquiritigenin核心化合物與AKT1、IL-6、TP53、JUN、TNF核心靶點(diǎn)有良好的結(jié)合能力，推測(cè)連花清瘟入血成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)，抑制炎癥細(xì)胞因子分泌，阻斷SARS-CoV-2病毒與ACE2蛋白結(jié)合，防止SARS-CoV-2感染人體細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴的效果。

為了進(jìn)一步分析連花清瘟入血成分對(duì)多器官組織損傷以及免疫損傷是否有調(diào)控作用，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索多器官組織損傷以及免疫損傷相關(guān)靶點(diǎn)，并與連花清瘟入血成分靶點(diǎn)之間取交集，結(jié)果顯示連花清瘟膠囊入血成分與多器官組織損傷及免疫損傷相交集靶點(diǎn)比例為1.6%～2%。因SARS病毒與冠狀病毒具有高度的同源性，把連花清瘟入血成分與SARS病毒兩者之間取交集，得出連花清瘟入血成分與SARS交集靶點(diǎn)比例為4.3%。提示連花清瘟入血成分有調(diào)節(jié)免疫，保護(hù)組織器官以及抗病毒的可能。KEGG通路分析結(jié)果顯示多器官組織損傷、免疫損傷和SARS主要涉及癌癥通路、PI3K-Akt、MAPK、TNF、HIF-1等信號(hào)通路。故本研究根據(jù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，及KEGG通路分析，將從清除抗原，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，保護(hù)組織器官三個(gè)方面探討連花清瘟入血成分干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴防治COVID-19的作用。

3.1 清除抗原—抗病毒

新型冠狀病毒是COVID-19的病原體，廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)連花清瘟體外可明顯抑制新型冠狀病毒活性，減少細(xì)胞胞膜及胞漿中病毒含量，抑制細(xì)胞因子過(guò)度激活。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2是SARS-CoV-2宿主細(xì)胞受體，SARS-CoV-2與ACE2 結(jié)合是病毒感染人體細(xì)胞的重要環(huán)節(jié)，SARS-CoV-2感染后進(jìn)入肺泡細(xì)胞，短期內(nèi)復(fù)制大量細(xì)胞因子，最終形成細(xì)胞因子風(fēng)暴引發(fā)炎癥[6,7]。Ho等[8]發(fā)現(xiàn)大黃素通過(guò)阻斷SARS-CoV蛋白與ACE2受體結(jié)合來(lái)抑制SARS-CoV感染，從而起到抗病毒作用。已有研究表明，蘆丁200mg/kg時(shí)，對(duì)流感小鼠肺指數(shù)抑制率為27.3%，具有明顯抗流感病毒的作用，而對(duì)流感病毒抑制作用可能在釋放和擴(kuò)散階段[9,10]。MAPK是一種已知可被多種病毒激活的主要細(xì)胞信號(hào)通路，此前有關(guān)人冠狀病毒感染的報(bào)道顯示，p38 MAPK通路激活，其下游調(diào)控蛋白磷酸化增強(qiáng)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴[11]。Wang等[12]通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃酸可以抑制甲型流感病毒(IAV)吸附和復(fù)制，可能是通過(guò)抑制MAPK以及NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。已經(jīng)證實(shí)甘草主要成分甘草酸可以抑制SARS-CoV病毒在體外培養(yǎng)Vero細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，還能抑制病毒在復(fù)制周期早期階段的吸附和滲透[13]。以上說(shuō)明連花清瘟入血成分具有廣譜抗病毒作用，可能通過(guò)抑制病毒繁殖，進(jìn)一步從源頭遏制細(xì)胞因子風(fēng)暴發(fā)生。

3.2 免疫調(diào)節(jié)—抑制炎癥風(fēng)暴

免疫紊亂是細(xì)胞因子風(fēng)暴的核心，病毒進(jìn)入機(jī)體后，使免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間平衡失調(diào)，使機(jī)體走向一種高炎癥狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。通過(guò)韋恩圖發(fā)現(xiàn)連花清瘟入血成分與免疫損傷有133個(gè)共同靶點(diǎn)，由此可知連花清瘟入血成分可能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)達(dá)到抑制炎癥風(fēng)暴。根據(jù)已有研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞顯著減少，但CD4+T淋巴細(xì)胞Th17亞群增加，CD8+T淋巴細(xì)胞含有更高濃度的細(xì)胞毒性顆粒，提示在某種程度上，病人免疫程度損傷嚴(yán)重[14]。IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，IL-6分泌有助于輔助評(píng)估COVID-19嚴(yán)重程度，且IL-6水平動(dòng)態(tài)變化可作為重癥新冠肺炎患者病情監(jiān)測(cè)的指標(biāo)[15]。TNF-α主要有單核巨噬細(xì)胞分泌的小分子蛋白，釋放炎性因子參與炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重疾病發(fā)生發(fā)展。已有研究發(fā)現(xiàn)激活NF-κB通路，導(dǎo)致TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)，阻斷NF-κB信號(hào)通路不僅可以抑制病毒傳播，還可以抑制相關(guān)炎癥發(fā)展[16]。甘草酸在綿羊肺炎支原體(MO)感染中，可以通過(guò)增加MO感染后的巨噬細(xì)胞增殖，從而起到免疫調(diào)控作用[17]。大黃素作為大黃的主要成分之一，除了能抑制炎癥早期細(xì)胞因子外，還能抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，降低“次級(jí)”炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，通過(guò)抑制NF-κB p65磷酸化，能使IL-6、TNF-α在外周血中表達(dá)降低，抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，具有較理想抗炎功效[18,19]。已有研究表明芒柄花黃素可以降低對(duì)腦組織炎癥因子表達(dá)，主要是通過(guò)控制SphK1/SIP信號(hào)通路的激活，從而抑制NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)一步改善炎癥因子對(duì)腦組織的損傷[20]。Liu等[21]觀察發(fā)現(xiàn)紅景天苷能使血清中促炎細(xì)胞因子和肺部炎癥顯著降低，明顯抑制TNF-α、IL-1β、IL-6促炎細(xì)胞因子，使抗炎細(xì)胞因子IL-10水平明顯升高。以上表明，連花清瘟入血成分通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，上調(diào)抗炎細(xì)胞因子水平，使促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間平衡，從而起到干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴作用。

3.3 組織器官保護(hù)

細(xì)胞因子風(fēng)暴的后果是多器官功能衰竭，過(guò)量的細(xì)胞因子釋放會(huì)導(dǎo)致組織損傷，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。在臨床生化檢驗(yàn)指標(biāo)中發(fā)現(xiàn)，COVID-19主要損傷器官是肺，其次對(duì)心、肝、腎也有不同程度的損傷[22]。根據(jù)連花清瘟入血成分與各臟器損傷的靶點(diǎn)制作韋恩圖可知，連花清瘟入血成分對(duì)各臟器損傷都有交集靶點(diǎn)，可能通過(guò)這些靶點(diǎn)減輕組織器官損傷，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。PI3K屬于胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，Akt是PI3K下游非常重要的活性靶標(biāo)，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PI3K/Akt信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的慢性肝損傷中表達(dá)升高，顯著影響NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄改變，最終導(dǎo)致肝功能障礙；有研究證明苦杏仁苷對(duì)細(xì)胞中PI3K和磷酸化AKT表達(dá)降低，表明苦杏仁苷通過(guò)抑制PI3K/AKT和NF-κB信號(hào)通路，增強(qiáng)抗炎能力，對(duì)肝損傷具有顯著保護(hù)作用[23]。Hu等[24]研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-6炎癥反應(yīng)是急性肺損傷(ALI)惡化的關(guān)鍵因素，因此，抑制促炎細(xì)胞因子過(guò)量產(chǎn)生和表達(dá)來(lái)降低LPS誘導(dǎo)ALI不可忽視。大黃素在重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷大鼠模型中，通過(guò)下調(diào)NF-κB、TNF-α、IL-1β炎癥表達(dá)，起到保護(hù)SAP肺損傷，保護(hù)機(jī)體的作用[25]。說(shuō)明連花清瘟入血成分，通過(guò)抑制PI3K/AKT、NF-κB炎癥信號(hào)通路，具有減輕組織器官損傷的作用。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接對(duì)連花清瘟入血成分進(jìn)行探究性研究，表明連花清瘟入血成分具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子及信號(hào)通路發(fā)揮清除抗原、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)組織器官的作用。該研究為連花清瘟膠囊有效防治COVID-19提供了物質(zhì)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。