雞胚模型在生物學(xué)研究中的應(yīng)用進展

袁若男，于曉雪,通信作者，李秀榮，李留安，潘鵬宇，孟玉芳，向軍，祁海臻，杜楠

雞胚模型在生物學(xué)研究中的應(yīng)用進展

袁若男1，于曉雪1,通信作者，李秀榮2，李留安1，潘鵬宇1，孟玉芳1，向軍1，祁海臻1，杜楠1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2. 巴彥淖爾市臨河區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古自治區(qū) 巴彥淖爾 015000）

雞胚離開母體獨立發(fā)育，便于獲得大量相同發(fā)育時期的胚胎進行批量操作，且在胚胎期操作對母體不造成傷害，是應(yīng)用廣泛的重要動物模型。通過查閱大量文獻，本文對雞胚模型在疾病模型、病毒學(xué)研究、寄生蟲學(xué)研究、藥物作用研究及生長發(fā)育等生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀進行了總結(jié)闡述，以期為繼續(xù)拓展雞胚模型的應(yīng)用前景提供參考。

雞胚模型；可視化孵化；生物學(xué)研究

雞胚獨立于母體發(fā)育，在種蛋產(chǎn)出后進入短暫休眠，并在條件適宜時繼續(xù)發(fā)育，且較其他動物胚胎模型而言容易獲得。這些特點使雞胚成為重要的動物模型，科研工作者可控制孵化條件將大量雞胚處于相同發(fā)育時期，從而進行批量操作，且對雞胚的操作避免了對母體的傷害。本文總結(jié)了雞胚模型在疾病研究、藥物作用等生物學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀，為拓展雞胚在生物學(xué)中的研究和應(yīng)用提供參考。

1 雞胚動物模型在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1 雞胚在血管生成與抗血管生成研究中的應(yīng)用

雞胚絨毛尿囊膜（Chick chorioallantoic membrane，CAM）是廣泛應(yīng)用于研究血管形成和抗血管形成的理想體內(nèi)模型。郭振亞等通過7日齡雞胚開窗，將滅菌定性濾紙圓片放入CAM血管較少部位，并滴加索拉非尼和沙利度胺的稀釋液及混合液，無菌封口后繼續(xù)孵化2天，結(jié)果顯示索拉非尼和沙利度胺均有良好的抗血管生成作用，且聯(lián)合用藥抗血管作用更加顯著[1]。崔杰等人通過相同的方式在雞胚孵育7日齡開窗，將銀杏葉提取物加入放置雞胚CAM中的滅菌圓片中，封口后繼續(xù)孵化2天，觀察到血管數(shù)量增多且血管顏色加深，證明銀杏葉提取物能夠促進血管新生[2]。除此之外，鉤吻總堿[3]和綠茶多酚[4]等對雞胚絨毛尿囊膜血管生成具有抑制作用；淫羊藿苷[5]和芪參益氣滴丸[6]等對雞胚絨毛尿囊膜血管生成具有促進作用，其作用效果與劑量一般成量效關(guān)系。

1.2 雞胚在癌轉(zhuǎn)移與抗癌藥物研究中的應(yīng)用

癌癥轉(zhuǎn)移是全球癌癥死亡的主要原因，通過雞胚模型了解癌癥轉(zhuǎn)移的機制，并篩選各種治療藥物是癌癥生物學(xué)和藥物研究新的領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，將人癌細(xì)胞系接種到CAM上，其移植瘤組織結(jié)構(gòu)與人癌組織結(jié)構(gòu)類似[7]。將過表達綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的癌細(xì)胞注射至雞胚血管中，可檢測GFP標(biāo)記癌細(xì)胞的遷移以及遷移過程中器官的變化[8]?？拱┧幬锏淖饔脵C理通常是通過靶向抑制癌細(xì)胞中的血管生成來實現(xiàn)的。余猛等利用反向?qū)ぐ蟹òl(fā)現(xiàn)沙苑子苷A能調(diào)控原癌基因絡(luò)氨酸蛋白激酶和腫瘤血管生成的相關(guān)靶點蛋白，利用分子對接法發(fā)現(xiàn)其能與腫瘤血管生成的相關(guān)靶點結(jié)合，表明沙苑子苷A能調(diào)控腫瘤基因的表達并能抑制血管生成從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[9]。肝素硅阿霉素抗癌藥物系統(tǒng)對堿性成纖維生長因子誘導(dǎo)血管生成和正常新生血管均有一定抑制作用[10]；丙戊酸鈉具有阻斷腫瘤生長、侵襲和血管生成的作用[11]；龍葵堿和血管內(nèi)皮生長因子抗體兩者聯(lián)合使用可更加有效抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系誘導(dǎo)的腫瘤血管生成及腫瘤增 殖[12]。

1.3 雞胚在寄生蟲研究的應(yīng)用

雞胚模型在寄生蟲研究中也有所應(yīng)用，主要是艾美耳球蟲與貝氏隱孢子蟲。雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于雞腸道所引起的一種危害嚴(yán)重的寄生蟲病，雞柔嫩艾美耳球蟲的分泌物及代謝產(chǎn)物可使雞胚原代盲腸上皮細(xì)胞的活性顯著下 降[13]。研究者們對防治雞球蟲病從藥物防治逐漸轉(zhuǎn)移到免疫防治，制備雞胚傳代致弱球蟲苗，球蟲孢子在雞胚尿囊膜上連續(xù)生長幾代后其致病力減弱但其免疫原性不變[14]。貝氏隱孢子蟲廣泛存在于多種脊椎動物體內(nèi)，是引起主要臨床表現(xiàn)為腹瀉的人畜共患病的原蟲，雞胚能充當(dāng)貝氏隱孢子蟲的自然宿主細(xì)胞并支持和發(fā)展貝氏隱孢子蟲的內(nèi)生生命周期[15]。研究表明，制備大量貝氏隱孢子蟲囊胚可采用9日齡雞胚尿囊膜接種法，實時熒光定量PCR方法能快速、特異的定量檢測貝氏隱孢子蟲在雞胚中良好的S型擴增曲線[16]。復(fù)方磺胺對甲氧嘧啶以一定劑量連續(xù)使用一定時間對雛雞貝氏隱孢子蟲病有潛在治療作用[17]。

1.4 雞胚在病毒研究中的應(yīng)用

雞胚在病毒致病機理和疫苗制備及效價檢測方面有廣泛應(yīng)用。感染塞卡病毒的雞胚表現(xiàn)出更高的缺陷發(fā)生率，如發(fā)育中腦量減少、面部異常等中腦缺陷[18]；通過雞胚免疫方法接種新城疫分離毒株，可檢測到雛雞有較高的抗體水平，因此可用此方法防控養(yǎng)殖場發(fā)生新城疫[19]；鵝源禽痘病毒可在雞胚中增殖，五輪傳代后雞胚病變及病毒滴度趨于穩(wěn)定[20]；經(jīng)雞胚傳代培養(yǎng)的鴨甲型肝炎病毒減毒活疫苗可為雛鴨提供有效免疫保護[21]；將四價流感病毒接種于健康雞胚尿囊腔中，48～72 h后獲取尿囊液，制取四價流感亞單位疫苗[22]；原代雞胚成纖維細(xì)胞可用于凍干人用狂犬疫苗生產(chǎn)[23]。

1.5 雞胚在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用

各種化學(xué)和物理因素對雞胚的中樞神經(jīng)發(fā)育會造成不同程度的影響。神經(jīng)管缺陷是胚胎發(fā)育過程中發(fā)生的嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天缺陷，高劑量的雙氯芬酸鈉或苯丙氨酸氨基酚可導(dǎo)致早期雞胚中線閉合缺陷，并導(dǎo)致大腦和脊柱畸形，甚至導(dǎo)致雞胚死亡或終身殘疾[24-25]。小腦發(fā)育易受糖皮質(zhì)激素的影響，雞胚胎期過多的糖皮質(zhì)激素刺激可引起小腦功能障礙與神經(jīng)發(fā)育障礙[26]。染料木黃酮注射入雞胚的卵黃囊中可能會影響神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)育，從而影響整個神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程[27]。藻紅蛋白是一種紅色染料，使用允許劑量的一半可增加早期雞胚胎神經(jīng)管缺陷的風(fēng)險[28]。不同濃度的硒通過調(diào)控硒磷酸酯合成酶Ⅰ影響雞胚中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，高濃度的硒對神經(jīng)元有毒性作 用[29]。與未暴露于磁場的胚胎相比，暴露于磁場的胚胎神經(jīng)導(dǎo)管閉合缺陷顯著增加[30]。

1.6 雞胚在心血管系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用

利用獨立于母體發(fā)育的雞胚作為試驗動物，來研究氧氣、營養(yǎng)或應(yīng)激激素等的變化對心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響，可以排除母體或胎盤的生理變化影響[31]。心血管系統(tǒng)是機體發(fā)育過程中最易缺氧的系統(tǒng)之一，在急性和慢性缺氧條件下孵化會導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)和功能上的心臟缺陷[32]。發(fā)育中的胚胎對氧化應(yīng)激非常敏感，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的一個重要因素，2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致雞胚心血管系統(tǒng)損傷[33]。濃度為5～20 μg/mL蟛蜞菊醇提物能夠極顯著提高心肌細(xì)胞活性，可以有效減緩熱應(yīng)激對原代雞胚心肌細(xì)胞損傷[34]。用治療劑量的氟苯尼考注射母雞后產(chǎn)卵并孵育，雞胚血管密度降低，包括血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子在內(nèi)的與血管生成相關(guān)的關(guān)鍵基因在卵黃囊膜中的表達水平也降低[35]。

1.7 雞胚在個體生長發(fā)育研究中的應(yīng)用

在雞胚孵化過程中理化因素改變或加入某些外源物質(zhì)，可能影響其生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。磁共振成像會導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩[30]；氟苯尼考會抑制雞胚發(fā)育[35]；類固醇可能會影響胚胎生長而不影響大腦分化[36]。在雞胚發(fā)育過程中，控制脂肪沉積的關(guān)鍵因素是脂肪酸降解，因此雞胚是用于研究人類肥胖癥的良好動物模型[37]。將11日齡雞胚小腸結(jié)扎，近端肌腸神經(jīng)節(jié)數(shù)目增加且肌腸神經(jīng)節(jié)向更小的方向移動[38]。胚胎第4天是性腺分化的初始階段，在此時注射雙酚A代謝物并用石蠟封口，孵育至19日齡可觀察到雌性表現(xiàn)出更小的左側(cè)卵巢，而雄性表現(xiàn)出更小的睪丸，表明雙酚A代謝物擾亂了雄性和雌性生殖器官發(fā)育[39]。

1.8 雞胚在嵌合體動物或轉(zhuǎn)基因雞研究中的應(yīng)用

嵌合體動物是由來自多個受精卵的體細(xì)胞或生殖系組織組成的個體，種間嵌合體的組織來源于不同的物種。雞胚模型在制備嵌合體動物來保存瀕危鳥類或其他物種基因的研究中，已被證明是非常有用的工具。有研究顯示，通過種內(nèi)移植的方法對雞迷走神經(jīng)細(xì)胞進行永久性GFP標(biāo)記，迷走神經(jīng)細(xì)胞從后腦進入前腸，再從后腸沿著胃腸道形成腸神經(jīng)系統(tǒng)，獲得表達GFP的轉(zhuǎn)基因雞胚，將含有GFP陽性神經(jīng)嵴細(xì)胞的腸段移植到受體胚胎的迷走神經(jīng)區(qū)域，陽性GFP重新向腸和肺的方向遷移同時定植于腸道和肺[40]。利用轉(zhuǎn)基因手段制備轉(zhuǎn)基因雞，可進行基因功能研究或培育優(yōu)勢雞品種，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)法是應(yīng)用較廣泛和成功率較高的方法，慢病毒的應(yīng)用使這種方法更加有效、安全[41]。慢病毒載體攜帶大型轉(zhuǎn)基因，并有效地感染和整合這些基因到分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞的基因組中，成為將遺傳物質(zhì)運輸?shù)郊?xì)胞和組織的理想載體[42]。王爽等利用慢病毒包裝抗高致病性禽流感病毒基因，顯微注射雞胚血管來制備轉(zhuǎn)基因雞，慢病毒顆粒在胚胎外周血管中感染經(jīng)血液循環(huán)的原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells，PGCs），抗病毒基因整合到PGCs中，完成制備轉(zhuǎn)基因雞[43]。JIANG等利用修飾的Sindbus病毒包膜蛋白偶聯(lián)抗PGC膜蛋白特異性抗體制成慢病毒載體，提高了目的基因靶向傳導(dǎo)效率，增加外源基因的嵌合率[44]。筆者實驗室發(fā)現(xiàn)，采集雞胚血液中PGCs，微注射入鴨胚中，可在鴨胚多個器官中檢測到嵌合現(xiàn)象，如肝臟、腦、性腺，證明了異種之間注射PGCs制備種間嵌合體具有很大潛力。另外，將穩(wěn)定表達GFP的DT40細(xì)胞微注射于雞胚血管中，可在出雛雞多個組織中檢測到外源蛋白表達，說明可以利用雞胚作為生物反應(yīng)器的動物模型。

2 小結(jié)與展望

與其他動物模型相比，雞胚具有價廉、容易獲得、脫離母體便于實時觀察以及敏感性強等優(yōu)點。因其生理優(yōu)勢，雞胚模型在血管生成、癌癥轉(zhuǎn)移與治療、寄生蟲和病毒研究、各系統(tǒng)發(fā)育和個體發(fā)育以及嵌合體動物和轉(zhuǎn)基因動物研究中普遍應(yīng)用，且具有獨特的優(yōu)越性，甚至在生物學(xué)的生產(chǎn)實踐中也優(yōu)勢明顯，如制備轉(zhuǎn)基因雞作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥用蛋白等。

受孵化規(guī)模小、自然光照較少、溫室缺乏等條件限制，實驗室內(nèi)的種蛋孵化率和雛雞存活率較規(guī)范化雞場低，可促進科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化的有機結(jié)合，發(fā)揮優(yōu)勢互補，提高實驗室雞胚的孵化率和存活率，同時加速科研成果轉(zhuǎn)化。相信在科研工作者的共同努力下，隨著孵化條件控制越來越精準(zhǔn)和可視化孵化不斷發(fā)展，雞胚模型在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將越來越廣泛。

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Chicken embryo and application in biological research

Yuan Ruonan1, Yu Xiaoxue1, Corresponding Author, Li Xiurong2, Li Liuan1, Pan Pengyu1, Meng Yufang1, Xiang Jun1，Qi Haizhen1, Du Nan1

（1. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Agricultural and Animal Product Quality and Safety Center of Linhe district, Bayannaoer 015000, Inner Mongolia Autonomous Region, China）

Chicken embryos develop independently from the mother body. It is convenient to obtain a large number of embryos in the same development period to carry out batch operations, and the operation during embryo stage does not harm the mother body. Therefore, chicken embryo has been an important experimental animal model which was widely used. This paper summarized the current application of chicken embryo models in biological studies such as diseases and drug effects, with the purpose to provide reference for expanding the application prospects of chicken embryo models.

chicken embryo model; hatching; biological research

S831.3

A

1008-5394（2021）02-0094-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.019

2020-05-07

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201803015）；國家自然科學(xué)基金項目（3170223）；天津市“131”創(chuàng)新型人才團隊項目（JRC2018044）；天津市企業(yè)科技特派員項目（19JCTPJC59500）；天津市科技重大專項與工程項目（18ZXBFNC00310）

袁若男（1997—），女，本科在讀，主要從事畜禽獸醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail：1055990579@qq.com。

于曉雪（1990—），女，講師，博士，主要從事畜禽獸醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail：yuxiaoxue1990@163.com。

責(zé)任編輯：張愛婷