湖北白豬精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)及初步鑒定

張立蘋，華再東，肖紅衛(wèi)，任紅艷，朱 喆，畢延震

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430064）

精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是一類位于雄性哺乳動(dòng)物睪丸生精小管基膜上、具有自我更新與定向分化能力并能夠產(chǎn)生精母細(xì)胞的成體干細(xì)胞，也是雄性動(dòng)物體內(nèi)惟一能夠?qū)⒆陨磉z傳物質(zhì)傳遞給下一代的干細(xì)胞，是生成精子的基礎(chǔ)細(xì)胞［1］。因此，通過SSCs的體外培養(yǎng)和細(xì)胞移植，可為繁育優(yōu)良動(dòng)物個(gè)體、生產(chǎn)基因修飾動(dòng)物、治療雄性不育和人類某些遺傳疾病提供新思路和新方法［2］。而通過對(duì)哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化得到的功能性精子，是解決人類生殖問題的安全、有效的途徑，且對(duì)精子發(fā)生過程、精原干細(xì)胞自我更新與分化、生產(chǎn)基因修飾動(dòng)物等方面的研究具有重要的科學(xué)研究意義［3］。

SSCs的體外分離、細(xì)胞純化和鑒定是開展其生物學(xué)特性研究、誘導(dǎo)分化及在基因編輯動(dòng)物制備和種質(zhì)資源保存上應(yīng)用的關(guān)鍵和首要步驟，優(yōu)化精原干細(xì)胞分離純化技術(shù)和鑒定方法，建立高效、便捷的精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，有助于精原干細(xì)胞生物學(xué)特性和增殖分化機(jī)制的進(jìn)一步研究以及精原干細(xì)胞在基因編輯動(dòng)物制備方面的應(yīng)用［4］。Kanatsu-Shinohara等［5］首次成功將小鼠精原干細(xì)胞誘導(dǎo)為多潛能干細(xì)胞。近年來，隨著小鼠精原干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)，基本能富集到大量細(xì)胞，促進(jìn)了SSCs誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和體外誘導(dǎo)精子的研究。大動(dòng)物的SSCs體外分離技術(shù)也逐漸興起，但尚未完全成熟［6，7］。

本試驗(yàn)通過對(duì)比不同日齡湖北白豬睪丸精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及初步鑒定結(jié)果，建立適用于湖北白豬精原干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系，從而為進(jìn)一步在體外培養(yǎng)條件下研究湖北白豬精原干細(xì)胞的分化能力、自我更新能力等提供有力條件，并為后續(xù)制備基因編輯豬提供原材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)選取5日齡、10日齡、15日齡健康湖北白豬，由湖北省瘦肉豬研究中心提供。

1.1.2 主要試劑DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗（1 000 IU/mL）、DPBS等試劑購自于GIBCO公司；Ⅳ型膠原蛋白酶、0.25%胰蛋白酶購自于Sigma公司；DNaseⅠ購自于Invitrogen公司；BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器Leica DMI3000B倒置顯微鏡，Ep?pendorf AG 22331 Hamburg離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 湖北白豬精原干細(xì)胞分離采集5日齡、10日齡、15日齡湖北白豬睪丸，選擇75%乙醇溶液擦拭湖北白豬手術(shù)部位，活體采集湖北白豬睪丸，75%乙醇溶液洗滌2 min，35℃生理鹽水（含雙抗100 U/mL）洗滌3次后保溫帶回實(shí)驗(yàn)室；將取回的睪丸放入裝有生理鹽水（含雙抗100 U/mL）的平皿中，用鑷子將睪丸提起，用剪刀將睪丸外部組織等剝離，清洗后放在另一個(gè)培養(yǎng)皿中，剝?nèi)ゲG丸膜，換入下一個(gè)培養(yǎng)皿將睪丸剪碎，分為3份，分別轉(zhuǎn)入2、4、8 mg/mL 3種濃度Ⅳ型膠原蛋白酶中37℃水浴鍋消化30 min，600 r/min離心3 min去除大部分的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，收集曲細(xì)精管于50 mL離心管中并置于37℃水浴鍋，加入0.25%胰蛋白酶中消化分離精原干細(xì)胞，消化期間鏡檢觀察精原干細(xì)胞的分離情況，當(dāng)消化為單細(xì)胞時(shí)，加入培養(yǎng)液終止消化，40 μm網(wǎng)篩過濾，分裝到2 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min洗滌2遍，重懸后接種到6孔板中，每管一孔，補(bǔ)加培養(yǎng)液至2 mL進(jìn)行培養(yǎng)。在39℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h半量換液。

1.2.2 湖北白豬精原干細(xì)胞純化采用差異貼壁法純化湖北白豬精原干細(xì)胞。將接種在6孔板中細(xì)胞放在39℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，移液器輕輕吹打，吸取上清液，并接種到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)此操作3~4次貼壁，收集未貼壁的細(xì)胞置飼養(yǎng)層培養(yǎng)。

1.2.3 湖北白豬精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)取胎牛血清10 mL加入600 μL雙抗，加入DMEM-F12至60 mL，即為精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)液。將最后一次貼壁板上的細(xì)胞消化傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞上，按2 mL/孔加入六孔板，39℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，24 h半量換液。培養(yǎng)基中添加不同濃度（10、20、30、40和50 ng/mL）LIF，分析LIF對(duì)湖北白豬精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響。

1.2.4 飼養(yǎng)層細(xì)胞的處理當(dāng)2次貼壁的六孔板中貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%時(shí)，DPBS洗滌2遍，加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化2~3 min，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞邊緣處于微微皺縮時(shí)，加入1 mL培養(yǎng)基終止消化并傳代，傳代細(xì)胞量為400 μL/孔。傳代細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)加入20 μg/mL絲裂霉素C處理2 h，即得飼養(yǎng)層細(xì)胞。

1.2.5 湖北白豬精原干細(xì)胞堿性磷酸酶檢測(cè)棄去培養(yǎng)在六孔板中干細(xì)胞的舊培養(yǎng)基，用提前在37℃保溫箱中預(yù)熱的DPBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定10~15 min，DPBS洗滌3次，每孔加入1 mL BCIP/NBT染色工作液，室溫避光孵育5~30 min，棄BCIP/NBT染色工作液，DPBS清洗終止顯色反應(yīng)，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖北白豬精原干細(xì)胞的分離純化

選取5日齡、10日齡、15日齡湖北白豬睪丸（圖1A）進(jìn)行平行試驗(yàn)。結(jié)果表明，10日齡小豬睪丸更適合分離精原干細(xì)胞，5日齡小豬睪丸小且嫩，試驗(yàn)前為防止出現(xiàn)細(xì)胞污染現(xiàn)象，需要75%乙醇溶液對(duì)湖北白豬睪丸進(jìn)行消毒，消毒的同時(shí)對(duì)睪丸也產(chǎn)生一定的損傷，分離得到的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢且狀態(tài)不佳，15日齡豬睪丸分離獲取的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)。

在利用Ⅳ型膠原蛋白酶消化時(shí)，對(duì)比濃度2、4、8 mg/mLⅣ型膠原蛋白酶消化睪丸組織情況。結(jié)果表明，4 mg/mLⅣ型膠原蛋白酶水浴消化睪丸組織30 min獲取曲細(xì)精管（圖1B），聯(lián)合0.25%胰蛋白酶消化獲取精原干細(xì)胞效果最好（圖1C精原干細(xì)胞與支持細(xì)胞等混合液），組合酶的聯(lián)合使用既便于鏡檢細(xì)胞的消化程度，又減少了細(xì)胞損傷；同時(shí)試驗(yàn)對(duì)DNaseI的使用進(jìn)行了對(duì)比，研究發(fā)現(xiàn)DNaseI對(duì)分離干細(xì)胞的結(jié)果影響不顯著，但使用DNaseI時(shí)，液體的黏稠度降低，有利于過濾。

圖1 湖北白豬精原干細(xì)胞體外分離純化

2.2 湖北白豬精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)

采用差異貼壁分選方法純化湖北白豬精原干細(xì)胞。將接種在6孔板中的細(xì)胞放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，輕輕吹打，吸取上清液，接種到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)3~4次貼壁，收集未貼壁的細(xì)胞置飼養(yǎng)層培養(yǎng)。湖北白豬精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)發(fā)育進(jìn)程如圖2所示。從圖2可以看出，湖北白豬精原干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞逐漸聚集形成細(xì)胞松散的細(xì)胞集落，最后形成緊密細(xì)胞簇，并且在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞始終呈圓形狀態(tài)，且附著在支持細(xì)胞表面。而睪丸分離出來的支持細(xì)胞等貼壁細(xì)胞自培養(yǎng)12 h貼壁鋪展于培養(yǎng)皿底部，并且開始增殖。試驗(yàn)對(duì)比了不同濃度（10、20、30、40和50 ng/mL）LIF對(duì)精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響，結(jié)果顯示影響不顯著。試驗(yàn)同時(shí)對(duì)比了湖北白豬睪丸支持細(xì)胞在湖北白豬精原干細(xì)胞培養(yǎng)中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)湖北白豬睪丸支持細(xì)胞對(duì)湖北白豬精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)影響顯著，且20 μg/mL絲裂霉素C處理2 h的支持細(xì)胞效果更好，但是形態(tài)上絲裂霉素C處理前后的支持細(xì)胞沒有明顯區(qū)別（圖3）。

圖2 湖北白豬精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)發(fā)育進(jìn)程

圖3 絲裂霉素C處理前后的支持細(xì)胞

2.3 湖北白豬精原干細(xì)胞堿性磷酸酶鑒定

對(duì)培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行了堿性磷酸酶鑒定，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，用堿性磷酸酶進(jìn)行細(xì)胞染色后，干細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的堿性磷酸酶活性，且顏色明顯，而支持細(xì)胞不著色。

圖4 湖北白豬精原干細(xì)胞堿性磷酸酶鑒定

3 小結(jié)與討論

3.1 湖北白豬精原干細(xì)胞的分離純化

動(dòng)物精原干細(xì)胞體外分離純化培養(yǎng)是研究其生物學(xué)特性、誘導(dǎo)分化及在基因編輯動(dòng)物制備和種質(zhì)資源保存上應(yīng)用的基礎(chǔ)［4］，而SSCs的分離是體外培養(yǎng)和細(xì)胞系能否成功構(gòu)建的首要步驟。研究表明，動(dòng)物精原干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和分化能力，理論上可以在各年齡段雄性動(dòng)物睪丸中分離得到，但獲得的干細(xì)胞比例隨動(dòng)物年齡增加而明顯降低［8］。研究發(fā)現(xiàn)，SSCs在新生小鼠睪丸中可達(dá)到約1.41%，而在成年小鼠睪丸中則降低至0.02%~0.03%［9］，因此，取材動(dòng)物年齡的選擇對(duì)SSCs的分離非常重要。研究者分離精原干細(xì)胞多選用青春期前的雄性動(dòng)物睪丸作為原材料。本試驗(yàn)分別對(duì)5日齡、10日齡和15日齡湖北白豬精原干細(xì)胞進(jìn)行了體外分離純化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)10日齡湖北白豬睪丸更適用于精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)。

目前，獲得動(dòng)物睪丸組織的單細(xì)胞懸液一般都采用兩步酶消化法，該方法雖然得到不斷的改良和優(yōu)化，但基本的思路是相同的［10-13］，即先用消化能力緩和的膠原酶消化間質(zhì)細(xì)胞，暴露內(nèi)在的曲細(xì)精管，再用0.25%胰蛋白酶進(jìn)一步消化其曲細(xì)精管后，用網(wǎng)篩過濾掉細(xì)胞壁等雜質(zhì)，獲得單細(xì)胞懸液［14-18］。2007年，Goel等［19］在消化豬睪丸組織過程中，首先去掉了間質(zhì)細(xì)胞，最后分離SSCs，從而提高了分離細(xì)胞的純度。Yang等［20］比較了豬精原干細(xì)胞分離方法，發(fā)現(xiàn)采用酶消化法與機(jī)械法結(jié)合的方式能獲得更高比率的活細(xì)胞，約為僅使用機(jī)械法獲取干細(xì)胞的10倍。本研究中采用機(jī)械分離法聯(lián)合酶消化獲取精原干細(xì)胞，即先用剪刀將已經(jīng)處理過的睪丸組織剪碎，用Ⅳ型膠原蛋白酶在37℃水浴30 min對(duì)組織塊進(jìn)行消化，600 r/min離心3 min除去大部分的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，收集曲細(xì)精管，0.25%胰蛋白酶中消化分離精原干細(xì)胞，最后用40 μm網(wǎng)篩過濾收集得到SSCs細(xì)胞，其中對(duì)Ⅳ型膠原酶的濃度進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，表明4 mg/mL的膠原酶Ⅳ進(jìn)行消化，消化時(shí)間30 min，效果最好，即便于鏡檢細(xì)胞的消化程度，又減少了細(xì)胞損傷；離心管處于水浴中進(jìn)行消化，效果更好；研究發(fā)現(xiàn)DNaseI，對(duì)分離干細(xì)胞的效果影響不顯著，但是使用DNaseI時(shí)，液體的黏稠度降低，有利于過濾。

3.2 湖北白豬精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)

動(dòng)物精原干細(xì)胞分離富集后的體外培養(yǎng)是成功建立SSCs細(xì)胞系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有SSCs可以在體外傳代并長(zhǎng)期培養(yǎng)，才能得到足夠的細(xì)胞量，從而為后續(xù)細(xì)胞的生物學(xué)研究提供足夠的試驗(yàn)原材料，適當(dāng)?shù)腟SCs培養(yǎng)條件可使動(dòng)物精原干細(xì)胞完成自身損傷的修復(fù)和增殖，為細(xì)胞的遺傳修飾及準(zhǔn)備受體動(dòng)物爭(zhēng)取時(shí)間，提高細(xì)胞移植和基因編輯效率［21］。然而，動(dòng)物精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)效果主要取決于最佳培養(yǎng)條件的探索和選擇。

飼養(yǎng)層細(xì)胞即用物理或化學(xué)方法人為處理后不能再次增殖的細(xì)胞，但是細(xì)胞本身仍然能夠分泌諸多生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)精原干細(xì)胞增殖［22］或抑制細(xì)胞分化［23］，因而飼養(yǎng)層有助于干細(xì)胞建系［24］。目前，常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有睪丸支持細(xì)胞、BEF細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞耐鳥苯苷亞系（STO細(xì)胞）等。冉競(jìng)超等［25］利用膠原酶和透明質(zhì)酸酶混合使用來除去間質(zhì)細(xì)胞，從而獲得較純的支持細(xì)胞作干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，并在培養(yǎng)基中添加GDNF、LIF和bFGF等生長(zhǎng)因子后，精原干細(xì)胞克隆明顯增加。Zhang等［26］分離新生仔豬的支持細(xì)胞作為干細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞，并在DMEM-F12添加10%血清替代物（knockout serum replacement，KSR）和4種細(xì)胞因子（GDNF、GFRα1、bFGF和IGF1）作為培養(yǎng)基，獲得未分化的豬精原細(xì)胞，且該細(xì)胞可以在體外增殖至少2個(gè)月而不喪失細(xì)胞干性。本試驗(yàn)用湖北白豬精原干細(xì)胞體外分離純化時(shí)2次貼壁的支持細(xì)胞經(jīng)過20 μg/mL絲裂霉素C處理2 h后作為飼養(yǎng)層進(jìn)行湖北白豬精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)得到了較好的效果，湖北白豬睪丸支持細(xì)胞跟精原干細(xì)胞同種來源，體外培養(yǎng)過程中經(jīng)過直接分泌或旁分泌產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子營(yíng)造的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境更接近于精原干細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)了湖北白豬精原干細(xì)胞的體外生長(zhǎng)發(fā)育。

生長(zhǎng)因子是細(xì)胞在分化和生長(zhǎng)過程中必不可少的一類生物分子。研究表明，白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）是胚胎干細(xì)胞（Embryo stem cell，ESCs）體外自我更新和促進(jìn)增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子［27，28］。試驗(yàn)表明，LIF對(duì)鼠睪丸生殖細(xì)胞的體外增殖有促進(jìn)作用；Dirami等［29］研究表明在培養(yǎng)基中添加EGF、GDNF、LIF、bFGF和SCF 5個(gè)生長(zhǎng)因子的單個(gè)或任意組合時(shí)均促進(jìn)體外SSCs的增殖。在本試驗(yàn)中添加LIF對(duì)湖北白豬精原干細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育影響不顯著。

3.3 湖北白豬精原干細(xì)胞鑒定

動(dòng)物精原干細(xì)胞的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定法、表面特異性標(biāo)記鑒定法及功能性鑒定法等。本試驗(yàn)主要通過形態(tài)學(xué)聯(lián)合堿性磷酸酶進(jìn)行了湖北白豬精原干細(xì)胞的鑒定，體外培養(yǎng)72 h后干細(xì)胞形成集落，培養(yǎng)第6天形成結(jié)構(gòu)緊密的干細(xì)胞簇，這與其他研究者的結(jié)果一致［11］。研究表明，結(jié)構(gòu)和功能完整的SSCs中有完整的AKP表達(dá)，因此，利用AKP細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)對(duì)SSCs進(jìn)行鑒定，本試驗(yàn)利用AKP對(duì)體外培養(yǎng)的PSSCs進(jìn)行了鑒定，表明細(xì)胞是湖北白豬SSCs并具有干細(xì)胞的基本特征。