印度刺猬蛋白基因敲除對腓骨骨折小鼠愈合的影響*

劉超，張焱祥，王顯勛，李勇光

(江漢大學附屬湖北省第三人民醫(yī)院 骨科,湖北 武漢 430000)

近年來，各種骨折的發(fā)生率明顯增加，其中肢體骨折是骨折的主要類型[1]。骨折的治療包括手術治療和非手術治療,為了獲得更好的治療效果，臨床上通常采用外固定、切除內固定、髓內釘固定等方法[2]，但術后骨的發(fā)育和生長也是康復的重要因素。骨的發(fā)育和形成主要通過軟骨內成骨和膜內成骨，而肢體骨的發(fā)育和形成主要通過軟骨內成骨[3]，既往研究發(fā)現(xiàn)軟骨內成骨過程與各種內分泌激素及相關生長因子的調控有關，這些內分泌激素及相關生長因子通過復雜的相互作用和一系列正、負反饋來調控骨骼的發(fā)生和生長[4]。印度刺猬蛋白(Ihh)是Hedgehog家族成員之一，在所有生物系統(tǒng)中都能檢測到其表達，在生物發(fā)育過程中起著復雜而重要的作用，是臨床調節(jié)軟骨細胞分化和增殖的信號因子[5]。本研究旨在分析Ihh基因敲除對小鼠腓骨骨折愈合的影響，為Ihh信號通路抑制劑治療骨折患者提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 40只同時存在基因型Ⅱ型膠原(Col2)a1-哺乳動物細胞Cre重組酶表達質粒(Cre ERT2)的 Ihhf1/f1小鼠，12周齡，體質量(23.42±2.25)g，購于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，生產許可證號SCXK(滬)2020-0015。所有小鼠均給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水，本研究動物實驗符合復旦大學科學部實驗動物倫理學標準。

1.1.2主要試劑與儀器 超凈工作臺(濟南鑫貝西生物技術有限公司)、低速離心機(山東博科集團)、倒置顯微鏡(MOTIC)、倒置熒光顯微鏡(型號DMI6000B,Leica)、臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)、Micro-CT(Skyscan1176)、凝膠成像及分析系統(tǒng)(南京世研儀器)。胎牛血清(上海李記生物科技有限公司)、DMEM-高糖培養(yǎng)基(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)、青—鏈霉素、PBS緩沖液、Lipofectamine 2000 (北京宜科思源科技有限公司)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗期間小鼠情況 小鼠常規(guī)飼養(yǎng)至12周齡，飼養(yǎng)過程中2組小鼠中各有1只死亡；12周齡時對剩余38只小鼠實施無菌條件下后肢腓骨骨折造模，經腓骨X線正側位片觀察存在明顯的骨折線即診斷為造模成功；2組中又各有1只小鼠造模后腓骨X線正側位片不合格，被剔除實驗，最終成功造模36只，觀察組和對照組各18只。

1.2.2實驗分組 采用Ihhf1/f1和Col2a1-CreERT2；Ihhf1/f1基因型小鼠繁育，采用PCR凝膠電泳技術鑒定新生小鼠的基因型，從新生小鼠中隨機選取Col2a1-CreERT2、Ihhf1/f1基因型小鼠40只。隨機選取20小鼠作為觀察組，出生后第1、2天腹腔注射雌激素受體拮抗劑TM(托馬西酚)溶液，誘導IHH基因敲除[6]；其余20只小鼠腹腔注射等量植物油作為對照組。

1.2.3腓骨骨折模型制備 小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(劑量40 mg/kg)麻醉，仰臥并固定在手術臺上，常規(guī)脫毛、皮膚準備和碘伏消毒，后肢腓骨中段用線鋸水平切開，將直徑為1.0 mm的克氏針逆行引入近端骨折，穿過腓骨大轉子上部，骨折復位后順行引入遠端髓腔；用生理鹽水沖洗傷口，分層密封。每只小鼠注射50 000 U的青霉素以防止感染，醒后恢復進食和自由活動。

1.3 觀察指標

造模后第1周、第2周及第3周末2組各取6只小鼠：(1)斷頭法處死小鼠，取腓骨，使用4%中性甲醛固定72 h行X線檢查，由3名實驗員共同討論評價骨折線模糊程度；(2)腓骨樣本固定72 h后行Micro-CT掃描，電壓42 kV、電流555 μA、角度360°、濾過片0.2 mm、分辨率8.73 μm，行骨痂三維圖像重建分析各項參數(shù)；(3)處死小鼠前，抽取1 mL鼠尾靜脈血，室溫下靜置1 h，以2 500 r/min的速率離心15 min，取上層血清，采用ELISA法檢測血清血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF-β1)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、鈣與磷離子濃度，計算鈣磷乘積，采用對硝基苯磷酸鹽法測定ALP活性;(4)ABH染色，取腓骨樣本10%中性甲醛固定72 h，以10%中性EDTA脫鈣4周，然后脫水、包埋、制成蠟塊，切為3 μm組織切片，56 ℃烤片過夜，行ABH染色，中性樹脂封片，觀察結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0分析。計量數(shù)據(jù)行重復測量方差分析與LSD-t檢驗，計數(shù)資料比較為秩和檢驗，α=0.05，Bonferroni校正法調整檢驗水準。

2 結果

2.1 X線顯示骨折線

造模后3個時點2組小鼠腓骨側位X線片可見，隨著造模時間的延長各組小鼠的骨折線均逐漸模糊，造模后第1周2組小鼠均有清晰骨折線及不明顯骨性連接影；造模后第2周2組小鼠均有模糊骨折線，且骨性骨痂連接影增多；造模后第3周2組小鼠骨折線均模糊，且觀察組骨折線模糊和非常模糊的比例低于對照組(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 造模后不同時點2組小鼠骨折線模糊程度Tab.1 Comparison of the ambiguity of fracture lines between 2 groups at different times after modeling

2.2 骨折部位Micro-CT參數(shù)

隨著造模骨折時間的延長，各組小鼠Micro-CT參數(shù)中SMI逐漸降低，TV、BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th先升高后降低，Tb.Pf逐漸降低。與對照組相比，觀察組小鼠造模后第2周和第3周時Micro-CT參數(shù)中SMI、TV、BV、BV/TV、Tb.N水平均降低，Tb.Pf、Tb.Th水平均升高(P<0.05)。見表2。

注：箭頭指向為骨折線。圖1 造模后不同時點2組小鼠腓骨骨折線(側位)Fig.1 The fracture lines between 2 groups at different times after modeling (lateral position)

表2 2組小鼠造模后不同時點骨折部位Micro-CT參數(shù)Tab.2 Comparison of Micro-CT parameters between 2 groups at different times after modeling

2.3 血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平

隨著造模時間的延長，對照組小鼠血清VEGF水平逐漸降低，TGF-β1水平先升高后降低，ALP、BGP水平逐漸升高，觀察組小鼠血清VEGF水平逐漸降低，TGF-β1水平先升高后降低，ALP水平逐漸降低，BGP水平先降低后升高。與對照組相比，造模后第1周時觀察組小鼠的血清VEGF水平降低，造模后第2周、第3周時小鼠的血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組小鼠造模后不同時點血清VEGF、TGF-β1、ALP及BGP水平Tab.3 Comparison of serum VEGF,TGF-β1,ALP,and BGP levels between 2 groups at different times after modeling

2.4 血清鈣、磷離子濃度及鈣磷乘積

隨著造模時間的延長，對照組小鼠血清鈣離子水平逐漸降低，磷離子水平先降低后升高，鈣磷乘積逐漸升高，觀察組小鼠血清鈣離子水平逐漸降低，磷離子、鈣磷乘積水平逐漸升高。與對照組比較，造模后第2周和第3周時觀察組小鼠的血清鈣離子濃度均升高、血清磷離子均降低(P<0.05)。見表4。

表4 2組小鼠造模后不同時點血清鈣、磷離子濃度及鈣磷乘積比較Tab.4 Comparison of serum calcium,phosphorus ion concentrations,and calcium and phosphorus product between 2 groups at different times after modeling

2.5 ABH染色

ABH染色結果顯示，造模后第1周2組小鼠骨痂可見較多軟骨成分；造模后第2周2組小鼠軟骨成分相似，對照組出現(xiàn)骨性骨痂；與造模后第1周和第2周比較，造模后3周觀察組小鼠僅出現(xiàn)少量骨性骨痂，骨小梁小于于對照組，且形狀不規(guī)則，而對照組的骨小梁形狀較觀察組規(guī)則、粗大。見圖2。

注：A、C、E分別為對照組第1周、第2周和第3周，B、D、F分別為觀察組第1周、第2周和第3周；綠色箭頭(黑色部位)為肌肉，紅色箭頭(白色部位)為骨骼。圖2 造模后不同時點2組小鼠ABH染色情況(50×)Fig.2 ABH staining between 2 groups at different times after modeling(50×)

3 討論

骨折患者臨床治療中骨組織的形成是康復的重要過程，骨組織的形成是通過不同細胞高度協(xié)調的過程，而四肢骨發(fā)生的主要形式為軟骨內成骨，該過程內包括間葉細胞群形成軟骨原基，軟骨細胞的增殖、分化、成熟，血管侵入，成骨細胞和破骨細胞出現(xiàn)，礦化幾個過程[7-8]。已有研究表明，Ihh信號通路與骨性關節(jié)炎和腫瘤的發(fā)生密切相關，且Ihh信號通路在軟骨內成骨以及骨的生長中也很重要[9-10]。隨著人口老齡化的加劇，老年人群骨性關節(jié)炎或腫瘤的發(fā)生率增高，易發(fā)生骨折[11]。本研究分析了Ihh基因敲除對腓骨骨折小鼠愈合的影響，以期為今后當患有骨性關節(jié)炎或腫瘤患者出現(xiàn)骨折時，通過Ihh信號通路抑制劑來干預骨折愈合，從而開辟新的治療途徑，獲得更佳的臨床療效。

已有研究指出，Ihh可調節(jié)軟骨細胞的增殖和肥大，調節(jié)軟骨內骨的形態(tài)發(fā)生，它的作用非常復雜，需要在甲狀旁腺激素相關肽Ihh的表達和間接調控過程中進行，Ihh可以抑制肥大軟骨細胞的分化，特別是當甲狀旁腺激素相關肽缺乏時，Ihh不能依賴于促進軟骨細胞肥大[12-15]。因此，在Ihh缺失的情況下，甲狀旁腺激素相關肽可以抑制膠質瘤相關癌基因同源家族的轉錄因子，從而抑制下游基因的表達[16]。通過IHH條件基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Ihh信號通路與骨關節(jié)炎進展過程中的病理變化有關，敲除Ihh基因可在組織、細胞和分子水平上預防關節(jié)軟骨的破壞[17-18]。另外，有學者發(fā)現(xiàn)敲除Ihh基因的小鼠四肢較短，軟骨細胞增殖減少[19-20]。其次Ihh在出生后骨發(fā)育中起著重要作用[21-22]。MicroCT是一種全面、三維、準確的骨骼微結構檢測方法，能有效描述組織的三維結構，彌補了病理切片、X線等二維觀察方法的不足[23-24]。本研究中采用托馬西酚溶液抑制雌激素活性的化合物，可抑制機體的生長發(fā)育過程，減少對增殖型與肥大型軟骨細胞過渡區(qū)域的刺激，抑制Ihh的分泌，因此托馬西酚溶液能夠有效敲除Ihh基因。進一步通過提取肋軟骨細胞總RNA并測定Ihh基因是否敲除成功，所納入的40只小鼠均成功敲除Ihh基因，常規(guī)飼養(yǎng)至12周齡，飼養(yǎng)過程中兩組中各1只死亡，12周齡時對剩余38只小鼠實施無菌條件下腓骨骨折造模，最終成功造模36只。造模后3周兩組小鼠骨折線均非常模糊，且觀察組程度較低，造模后2周、3周時對照組小鼠的Micro-CT各參數(shù)均優(yōu)于觀察組。VEGF是特異性較高的促學管內皮細胞生長因子，可促進血管通透性增加，促使血管內皮細胞增殖和遷移，促進血管形成，其水平降低時不利于腓骨骨折小鼠的血管增生；TGF-β1為一種多功能蛋白質，對細胞的生長、分化、凋亡和免疫等均有重要的調節(jié)作用，其能夠與細胞表面的受體相結合，進而激活信息傳遞通路，其水平降低說明腓骨骨折小鼠的骨細胞增殖、分化能力較弱，說明骨折愈合情況不佳；ALP在臨床中常用于對肝膽系統(tǒng)、骨骼疾病的診斷和鑒別，其水平降低常預示著人體出現(xiàn)重癥慢性腎炎、貧血、甲狀腺機能不全等，說明腓骨骨折小鼠術后愈合情況不佳；BGP是骨代謝中常用的生化標志物，其由成牙質細胞、骨細胞合成，少量由增生的軟骨細胞合成，可調節(jié)骨鈣代謝，其水平降低不利于骨性骨痂的生成及骨折的愈合。且造模后2周、3周時觀察組小鼠的血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平均低于對照組，造模后2周、3周時觀察組小鼠的血清鈣離子濃度均高于對照組。這說明Ihh基因敲除后骨折中晚期骨折區(qū)域內VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平表達均降低，會抑制骨痂成骨，影響骨折預后，這與既往研究中的結果相似。進一步探究發(fā)現(xiàn)，ABH染色圖片顯示造模后1周兩組骨痂可見較多軟骨成分；造模后2周兩組軟骨成分相似，對照組出現(xiàn)骨性骨痂；由圖可見與造模后1周、2周相比，造模3周觀察組僅出現(xiàn)少量骨性骨痂，骨小梁形狀明顯小于對照組，且形狀不規(guī)則，而對照組的骨小梁形狀較觀察組規(guī)則、粗大。這可能與骨折區(qū)域的VEGF、TGF-β1、ALP、BGP表達相關，而Ihh基因敲除后上述因子表達水平降低，因此損傷區(qū)域血管新生受到抑制，纖維骨痂軟骨內成骨抑制[25]。

綜上所述，Ihh基因敲除會抑制腓骨骨折小鼠血管增生，降低鈣磷水平，進而影響骨性骨痂的生成，延緩骨折的愈合。但是本研究中尚未明確其具體作用機制，今后仍需進一步探究和完善，以提高臨床應用性。