腫瘤壞死因子-α通過Wnt通路對(duì)腦卒中小鼠缺血再灌注后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響研究

曹杰，曾輝，黃旭華

1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000；2.南康區(qū)第一人民醫(yī)院，江西 贛州 341400

腦卒中是由于腦內(nèi)血管破裂或者阻塞引起的局部大腦血液供應(yīng)不足，腦組織發(fā)生病變壞死的一種腦部疾病，其中大部分為缺血性腦卒中［1］。腦卒中發(fā)病人數(shù)多，有較高的死亡率和復(fù)發(fā)率。腦卒中對(duì)人機(jī)體損傷極大，每年患者不斷增多。但治療方式還十分缺乏，主要還是以預(yù)防為主［2］。近年來，抑制缺血再灌注導(dǎo)致的血腦屏障損傷已成為治療腦卒中的新思路［3］，但近幾年來未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。探討腫瘤壞死因子-α（TNF-α）對(duì)腦卒中小鼠缺血再灌注后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響的機(jī)制，對(duì)腦卒中的治療有一定幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級(jí)C57BL 小鼠80 只，6 周齡，體質(zhì)量范圍20～25 g，雌雄各半，購自武漢萬千佳興公司。飼養(yǎng)環(huán)境為（1）符合國標(biāo)的生活環(huán)境；（2）符合國標(biāo)的飼料；（3）無致病菌或無菌的飲用水。ELISA試劑檢測(cè)盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；Evans blue 染色劑（上海躍騰生物技術(shù)有限公司）；RTPCR 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠隨機(jī)分為A 組（缺血0 min）、B 組（缺血時(shí)間30 min）、C 組（缺血時(shí)間45 min）、D 組（缺血時(shí)間60 min）。除A 組外小鼠利用線栓法［4］構(gòu)建缺血再灌注小鼠模型。首先，刮掉小鼠頸部的毛，切開皮膚，分離周圍組織使左側(cè)頸總動(dòng)脈顯露，結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈近心端，插線栓入頸內(nèi)動(dòng)脈主干，緩緩?fù)七M(jìn)，血流讀數(shù)驟降停止推進(jìn)，固定栓線。缺血時(shí)間到達(dá)之后，立即取出線栓，蘇醒后根據(jù)Longas 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行評(píng)分，1～3 分的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。1 d 后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 ELISA 檢測(cè)血清TNF-α 表達(dá) 每組各選取10只小鼠，取靜脈血1 mL，按照ELISA 試劑盒說明書測(cè)定其中TNF-α 的水平。

1.3.2 Evans blue 法 每組另選取10 只小鼠，從眼窩靜脈竇注射濃度為2%的Evans blue 至正常小鼠和腦卒中模型小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射200 μL。體內(nèi)循環(huán)1 d，處死小鼠，取大腦并拍照。拍照之后，立即將大腦勻漿。通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD620和OD740），計(jì)算出正常小鼠和腦卒中小鼠的腦內(nèi)Evans blue 的濃度。

1.3.3 免疫組化檢測(cè) Wnt3a 表達(dá)用Wnt3a 單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。步驟：脫蠟、抗原修復(fù)，3%H2O2孵育10 min，滴加封閉用正常血清，PBS洗3 遍，室溫孵育1 h，滴加1∶50 稀釋的一抗，4℃過夜。PBS 沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記二抗，室溫1 h，PBS 沖洗，DAB 顯色劑顯色。顯微鏡下拍攝，陽性表達(dá)呈棕黃色。

1.3.4 qPCR 技術(shù)檢測(cè)Axin2、APCDD1 表達(dá) 提取總RNA 后，RT-PCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。通過熒光定量PCR 擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s、62 ℃退火/延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清TNF-α 水平以及腦內(nèi)Evans blue 濃度

A 組TNF-α 水平較低，B、C、D 組水平逐漸上升（F=2 064.955，P＜0.001）。A 組左腦Evans blue 濃度較低，B、C、D 組濃度逐漸上升（F=242.961，P＜0.001）。B 組與A 組、C 組與A 組、D 組與A 組在TNF-α 水平和左腦Evans blue 濃度均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組右腦Evans blue 濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.335，P=0.800）。見表2。

表1 小鼠血清TNF-α水平以及腦內(nèi)Evans blue濃度（）

表1 小鼠血清TNF-α水平以及腦內(nèi)Evans blue濃度（）

表2 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Axin2、APCDD1 mRNA相對(duì)表達(dá)（）

表2 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Axin2、APCDD1 mRNA相對(duì)表達(dá)（）

2.2 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Wnt3a 的表達(dá)

Wnt3a 主要以胞核表達(dá)為主。A 組小鼠Wnt3a表達(dá)很少，B、C、D 組表達(dá)依次增多。詳見圖1。

圖1 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Wnt3a的表達(dá)（化學(xué)染色，×400）

2.3 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Axin2、APCDD1 mRNA的表達(dá)

A、B、C、D 組Axin2、APCDD1 mRNA 相 對(duì)表達(dá)依次增多（F=292.512，1 237.411，P＜0.001）。B 組 與A 組、C 組 與A 組、D 組 與A 組 在Axin2、APCDD1 mRNA 的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

3 討論

腦卒中多發(fā)于中老年人群體，且缺血性腦卒中發(fā)病率最高［7］。部分患者通過治療雖然能夠好轉(zhuǎn)，但往往會(huì)產(chǎn)生一定程度的后遺癥，并且預(yù)后狀況也不佳。缺血性腦卒中使血腦屏障功能降低，并增加腦出血和腦水腫的風(fēng)險(xiǎn)［8］。研究表明，閉塞的腦血管在疏通之后再灌注，短時(shí)間內(nèi)就能激活一系列的生化反應(yīng)，引起神經(jīng)興奮毒性、炎性因子分泌增多等［9］。炎癥因子（TNF-α）進(jìn)一步激活腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，使淋巴細(xì)胞進(jìn)入血腦屏障，分泌促炎因子，從而引起大腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞大量死亡。本研究結(jié)果顯示，隨著缺血時(shí)間的增加，小鼠機(jī)體產(chǎn)生的TNF-α 增多，提示腦卒中會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生促炎因子TNF-α，且TNF-α 水平呈缺血時(shí)間依賴性，另外左腦的Evans blue 濃度上升，表明隨缺血時(shí)間的上升血腦屏障功能下降。

Wnt 通路與腦血管生成、血-腦脊液屏障的形成及其生物學(xué)特征維持有重要聯(lián)系。Wnt3a 為Wnt信號(hào)通路的起始蛋白［10］,其表達(dá)可激活Wnt 信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Wnt3a的表達(dá)逐漸上升。提示腦卒中小鼠的Wnt 通路被異常激活，隨著缺血時(shí)間的增加，Wnt 通路被激活的情況更加嚴(yán)重。

Wnt 通路的靶基有Axin2、APCDD1。Axin 是一種構(gòu)架蛋白,它能激發(fā)?-catenin 磷酸化，又能被泛素蛋白酶體分解，導(dǎo)致Wnt 通路保持低活性［11］。APCDD1 因子是與Wnt 信號(hào)通路密切相關(guān)的膜結(jié)合糖蛋白［12］。APCDD1 作為內(nèi)源性因子可激活或抑制經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，腦卒中小鼠Axin2、APCDD1 的表達(dá)逐漸增加。提示W(wǎng)nt 通路被抑制，隨著缺血時(shí)間的增加，Wnt 通路的活性越低。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)腦卒中小鼠伴隨著TNF-α 水平異常增加，Wnt 通路異常激活，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能下降，Wnt 通路的靶基因表達(dá)上升。TNF-α 可能參與到調(diào)控Wnt 通路的活性來影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。