HPLC-ELSD 法測定腎康寧顆粒中黃芪甲苷含量

龍白堅，夏國漢，黃東，吳良發(fā)

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

腎康寧顆粒由黃芪、丹參等八味中藥組成，方中君藥為黃芪，黃芪甲苷為主要活性成分之一［1-3］，處方中含黃芪的制劑大多以黃芪甲苷作為含量檢測成分，目前未有關(guān)于測定腎康寧顆粒中黃芪甲苷含量的文獻報道。由于黃芪甲苷只在201 nm 波長處有弱的紫外末端吸收，其它波長無明顯的紫外吸收，選用高效液相色譜-紫外檢測器方法或者薄層掃描法測定，檢測結(jié)果不穩(wěn)定［4-6］。參考相關(guān)文獻［7-14］，本文建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）法測定腎康寧顆粒中黃芪甲苷的含量，經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法重現(xiàn)性好，準確率高，可作為腎康寧顆粒質(zhì)量控制的技術(shù)手段之一。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀HPLC（型號：Agilent 1100），蒸發(fā)光散射檢測器ELSD（型號：Alltech-2000）。黃芪甲苷對照品（含量測定用）購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201314。乙腈為色譜純級，試驗用水為超純水，其它試劑均為分析純。腎康寧顆粒：江西山高制藥有限公司（批號：20100101、20100201、20110501、20110502、20100504，規(guī)格：每袋5 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.4 mg 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

取樣品內(nèi)容物，研細，取約12 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加水50 mL 分次溶解殘渣，用水飽和的正丁醇溶液振搖提取4 次，每次30 mL，合并正丁醇溶液，用氨試液反復(fù)洗滌2 次，每次50 mL，取正丁醇溶液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備

除不加黃芪藥材外，取其他七味藥材按制法制成陰性樣品，按照“2.2”項下方法制備陰性樣品溶液,即得。

2.4 色譜條件

以Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）為色譜柱，柱溫設(shè)為30 ℃；以水-乙腈（65∶35）為流動相，流速為1.0 mL/min；ELSD 參數(shù)設(shè)置：漂移管溫度設(shè)為105 ℃，載氣流速設(shè)為2.5 L/min；進樣量為10 μL。按上述色譜條件進樣分析，待測成分分離效果好，測定色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）、供試品（B）、陰性樣品（C）色譜圖

2.5 線性范圍

取對照品溶液適量，用甲醇配制成濃度依次為0.040 4、0.202、0.404、0.808、1.212 mg/mL 的系列對照品溶液，分別精密吸取10 μL 進樣測定，以對照品進樣量（X）的常用對數(shù)值為橫坐標，以峰面積（Y）的常用對數(shù)值為縱坐標，進行線性回歸分析，得到線性方程lgY=1.315 9lgX+5.833 6，r=0.999 9。結(jié)果表明黃芪甲苷在0.404～12.12 μg 之間與峰面積呈良好的對數(shù)線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

取“2.1”項下對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6 次，每次10 μL，測定峰面積，結(jié)果峰面積RSD 為1.8%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

樣品配制0，6，12，18，24 h 后精密吸取同一供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，結(jié)果測定峰面積RSD 為1.6%，表明供試品溶液在24 h 之內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

制備供試品溶液6份，分別進樣10 μL測定含量，結(jié)果平均含量為0.135 6 mg/g，RSD 為1.9%。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（含量為0.135 6 mg/g），研細，取6 份，每份約6 g，精密稱定，加入濃度為0.016 16 mg/mL 的黃芪甲苷對照品甲醇溶液50 mL，按“2.2”項下方法制備加標溶液，按上述色譜條件，分別精密吸取10 μL，進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.10 樣品測定

取5 批樣品，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件測定黃芪甲苷峰面積，采用回歸方程計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中黃芪甲苷含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 提取方法的考察

通過對不同提取方式（超聲、回流、振搖）、溶劑種類（甲醇、50%甲醇、水）和正丁醇振搖提取次數(shù)（1、2、3、4、5 次）等影響因素的考察，發(fā)現(xiàn)樣品用甲醇超聲處理30 min 后，再加正丁醇振搖提取4 次，氨試液洗滌2 次，色譜峰雜質(zhì)干擾較少，黃芪甲苷含量最高，故采用“2.2”項下方法制備供試品溶液。

3.2 蒸發(fā)光散射檢測器條件的考察

影響蒸發(fā)光散射檢測器信號響應(yīng)的主要因素是載氣流量和漂移管溫度，經(jīng)對載氣流量和漂移管溫度對基線和峰面積影響的考察，確定載氣流量為2.5 L/min、試驗溫度為105 ℃時分離效果好，基線穩(wěn)定。

3.3 樣品測定結(jié)果分析

表2 表明不同批號的樣品黃芪甲苷含量有差異，腎康寧顆粒為獨家品種，樣品來源相同的前提下，批間差異可能是黃芪原藥材或者生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定造成的。因此，固定黃芪原藥材產(chǎn)地，保障藥材質(zhì)量和工藝穩(wěn)定性可以有效減少批間差異，提高藥品質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性。經(jīng)調(diào)研，黃芪甲苷在成品中的平均轉(zhuǎn)移率約為30%，《中國藥典》2020 年版一部規(guī)定黃芪中黃芪甲苷的含量不得低于0.080%，若按0.080%計算，則本品每袋含黃芪甲苷應(yīng)不少于0.43 mg，《中國藥典》2020 年版一部收載的腎康寧顆粒規(guī)定的黃芪甲苷含量限度偏低。