分子對接和熒光光譜法研究保泰松與人血清白蛋白的相互作用及機制

侯利杰，張澤，申炳俊，金麗虹

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

保泰松（Phenylbutazone，PBZ）又名布他酮，化學名為1，2-二苯基-4-正丁基吡唑烷-3，5-二酮，是二十世紀四十年代合成的唑酮類非甾體類抗炎藥物，具有一定的解熱鎮(zhèn)痛和顯著的抗炎作用。在臨床上PBZ被廣泛用于治療炎癥性疾病，如風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、強直性脊椎炎、絲蟲病急性淋巴管炎和急性痛風等[1-3]。作為一種解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物，PBZ在醫(yī)療上曾發(fā)揮過巨大的作用。然而，PBZ的副作用較大，若長期服用或劑量過大，輕者出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、便秘等癥狀，重者可致消化性潰瘍，可抑制骨髓功能引起粒細胞減少，再生障礙性貧血，甚至死亡[4-5]。因此，二十世紀九十年代開始，隨著新的止痛和消炎藥物的發(fā)現(xiàn)，PBZ的使用量逐漸下降，但PBZ在臨床上的優(yōu)勢依舊未減。隨著相關研究人員的不懈努力，近年來PBZ及其衍生物的新生物活性相繼被發(fā)現(xiàn)。研究表明，4-羥基羥基保泰松具有良好的抗炎增強免疫作用和抗HIV活性，挪威Aviral公司正在進行Ⅱ期臨床試驗。由于PBZ在治療結核病、急性血吸蟲病和惡性腫瘤引起的發(fā)燒方面比其他解熱鎮(zhèn)痛藥更有效，這為PBZ提供了新的市場。目前，PBZ臨床用藥安全和劑量設計重新引起了人們的廣泛關注。

人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）約占血漿總蛋白的60%，是人血漿中含量最高的胞外蛋白質。HSA帶有較多的極性基團，能顯著可逆結合內源性和外源性化合物，在體液中承擔多種物質的儲存和運輸功能。藥代動力學研究表明，口服PBZ能迅速吸收進入血液，其血漿蛋白結合率高達98%。Sudlow和Birbett等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，HSA有SiteⅠ（位點Ⅰ）、SiteⅡ（位點Ⅱ）和SiteⅢ（位點Ⅲ）三個配體結合位點。其中，SiteⅠ位于ⅡA亞域疏水腔中，該疏水腔相對較大且具有良好的彈性，SiteⅠ結合的化合物多為體積較大的分子，2個不同配體分子亦可同時結合于SiteⅠ；而SiteⅡ和SiteⅢ均位于ⅢA亞結構域。作為SiteⅠ標記探針之一，PBZ被廣泛用于藥物分子與蛋白質結合位點的研究中。目前，PBZ與牛血清白蛋白（BSA）結合研究已有文獻報道[7]，但PBZ與HSA相互作用的系統(tǒng)研究甚少，有關PBZ結合位點處的熱點殘基、作用力類型以及對HSA構象影響尚未明確。本研究利用分子對接技術結合三維、內源和同步多種熒光光譜法，在分子水平上研究了PBZ與HSA間鍵和模式及作用機理，獲得了兩者間結合常數(shù)、結合位點及周圍熱點氨基酸殘基信息、結合距離、結合力以及對作用過程中HSA構象變化等信息。研究結果對于闡明PBZ體內儲藏運輸、指導臨床合理用藥提供更多的參考信息。

圖1 PBZ分子結構式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-280型熒光分光光度計（天津港東科技發(fā)展有限公司）；UV-2550型雙光束紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；DC-4006型高精度低溫恒溫槽（上海菁?？萍加邢薰荆籇ELTA320型pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

PBZ（純度≥99%，南通飛宇生物科技有限公司）用無水乙醇配制成2.0 mmol/L儲備液，使用前用無水乙醇稀釋成0.1 mmol/L。HSA（純度≥99%，Sigma公司）儲備液用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.40，0.1 mol/L NaCl）配制，濃度為0.1 mmol/L。實驗用水為18 MΩ/cm超純水，所用其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子對接模擬

PBZ的3D結構由有機小分子生物活性數(shù)據(jù)（Pub Chem數(shù)據(jù)庫）獲得，其CID編號為4781。HSA的晶體結構取自蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank），PDB編號為1H9Z。使用Auto Dock 4.2.5.1軟件對PBZ和HSA進行分子對接模擬，應用 Lamarckian Genetic Algorithm（LGA）遺傳算法得到PBZ與HSA結合構象，用PyMOL2.3.1.0軟件對藥物和蛋白質分子構象進行可視化分析。

1.2.2 三維熒光光譜

室溫下，在兩個Tris-HCl緩沖體系中分別加入 0、240 μL 1.0×10-4mol/L PBZ 溶液以及 40 μL HSA儲備液，獲得HSA∶PBZ（濃度比）為1∶0和1∶6混合液，總體積為4 mL。充分混合后靜置30 min，測量三維熒光光譜。激發(fā)波長（λex）和發(fā)射波長（λem）范圍分別為210～340 nm和250～500 nm，激發(fā)波長和發(fā)射波長間隔均為5 nm。

1.2.3 熒光光譜和同步熒光光譜

配置 HSA∶PBZ（濃度比）分別為 1∶0，1∶1，1∶3，1∶5和 1∶7混合液，總體積為 4 mL，溶液獲得過程同三維熒光光譜。充分混合，在298 K（或310 K）恒溫水浴中靜止30 min，測量熒光光譜或同步熒光光譜。其中，熒光光譜測量條件為：激發(fā)波長（λex）為282 nm或295 nm，發(fā)射波長（λem）范圍為290～410 nm或310～430 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為10 nm/5 nm；同步熒光光譜測量條件為：發(fā)射和激發(fā)波長間隔（Δλ）為15 nm（或60 nm），發(fā)射波長范圍285～375 nm（或310～410 nm）。

1.2.4 結合距離

1.0 μmol/L HSA 和 PBZ Tris-HCl溶液分別測量熒光光譜和吸收光譜，熒光光譜測量參數(shù)同1.2.3節(jié)，吸收光譜波長范圍290～410 nm。

2 結果與分析

2.1 分子對接模擬

分子模擬是研究分子之間特別是生物分子復合物（如藥物與受體）之間相互作用的一種有效方法，它能獲得配體和受體結合構象、位點和作用力等信息[8-10]。圖2（a）為 PBZ 在 HSA 的亞結構區(qū)域ⅡA的對接圖，圖2（b）直觀顯示HSA疏水腔內有足夠的空間容納PBZ，疏水作用力在穩(wěn)定復合物方面應起到了重要作用。PBZ周圍4.0 ?范圍內存在44個對結合作用貢獻較大的活性氨基酸殘基，圖2（c）為PBZ與HSA部分氨基酸結合截圖。44個活性氨基酸殘基涉及，HSAⅡA結構域的氨基酸殘基有，ⅡA-h1的Gln196、Leu198、Lys199和 Ser202，ⅡA-h1和ⅡA-h2間伸展鏈的 Phe206，ⅡA-h2的 Arg209、Ala210、Phe211、Lys212、Ala213、Trp214、Ala215、Val216、Arg218、Leu219和 Arg222，Ⅱ A-h3的Ser232、Val235、Thr236、Leu238和 His242，ⅡA-h4的 Arg257、Leu260和 Ala261，ⅡA-h6的 Ser287、Ile290和Ala291，除ⅡA結構域5個α螺旋中的27個氨基酸殘基外，WF周圍4.0 ?區(qū)域還涉及ⅠB、ⅡB、ⅢA亞結構域17個氨基酸殘基，其在HSA二級結構中的具體分布為：ⅠB-h3的Glu153，ⅠB-h4的 Lys195，ⅡB-h2的Asp324、Leu327、Gly328和 Leu331，ⅡB-h3的 Leu347、Ala350和 Lys351，ⅡB-h3和ⅡB-h4間β-轉角的 Glu354，ⅢA-h4的Glu450、Asp451和 Ser454，ⅢA-h5和ⅢA-h6間伸展 鏈 的 Ser480、Leu481和 Val 482，ⅢA-h6的Asn483。

圖2 PBZ與HSA的分子對接結構模型圖

2.2 HSA與PBZ體系的三維熒光

三維熒光具有高選擇性，它能夠獲得化合物的完整熒光信息，可用于HSA構象及微環(huán)境的分析。1.0 μmol/L HSA與PBZ作用前、后的三維熒光光譜如圖3和圖4所示?？梢钥闯觯琀SA有兩個熒光譜峰（峰1和峰2）和一級瑞利散射（峰a，λex=λem）[11]。其中，峰1（λex/λem/Intensity，230 nm/340 nm/153.0）反映的是蛋白質多肽鏈結構等信息，峰 2（λex/λem/Intensity，285 nm/340 nm/1 329.8）則反映了HSA色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為。隨著PBZ的加入，峰a強度較HSA有所增加，這應是由于溶液中溶質粒徑增大所致；峰1和峰2熒光峰強度均顯著降低，其值分別為106.1和968.8，兩者比值1∶9.13，有別于HSA的1∶8.69；最大發(fā)射波長都藍移了1.0 nm。說明PBZ與HSA發(fā)生相互作用，導致HSA構象略微改變，使HSA中熒光基團微環(huán)境非極性有所增加，蛋白質粒徑變大。

圖3 HSA的三維熒光光譜

圖4 HSA與PBZ作用后的三維熒光光譜

2.3 PBZ與HSA的熒光猝滅光譜及作用機制確定

HSA含有色氨酸（1個）、酪氨酸（18個）和苯丙氨酸（30個），這些具有芳香結構氨基酸令其具有內源熒光[12]。由于苯丙氨酸熒光量子效率（φ=0.04）遠低于酪氨酸（φ=0.1）和色氨酸（φ=0.2），而酪氨酸離子化時其熒光幾乎被猝滅，HSA內源熒光主要來源于ⅡA亞域疏水腔的色氨酸（Trp214）。不同濃度PBZ對HSA熒光光譜影響結果如圖5（a-e）所示，而PBZ則無明顯內源熒光（見圖5曲線f）。由圖5可知，λex=282 nm時，HSA在340 nm處內源熒光強度隨PBZ濃度增加呈現(xiàn)有規(guī)律的下降，峰形雖沒有明顯變化，但熒光發(fā)射峰位藍移4.8 nm（激發(fā)波長為295 nm時，PBZ-HSA體系的熒光光譜與其類似），表明PBZ使HSA生色團微環(huán)境極性降低，PBZ與HSA間發(fā)生了作用。

圖5 PBZ對HSA熒光發(fā)射譜的影響（298 K）

PBZ誘導HSA內源熒光猝滅機理可以根據(jù)Stern-Volmer方程進行描述[13-14]：

式中，F(xiàn)0和F分別為PBZ加入前、后HSA內源熒光強度；Kq為雙分子碰撞過程速率常數(shù)；τ0為HSA熒光壽命，約為1×10-8s；[Q]為 PBZ平衡濃度（μmol/L）；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

282 nm和295 nm兩激發(fā)波長下，由PBZ-HSA體系F0/F對[Q]的Stern-Volmer曲線圖可計算獲得猝滅常數(shù)（KSV），其結果如表1所示。

表1 PBZ與HSA作用的猝滅常數(shù)

可以看出，隨著溫度升高，PBZ-HSA體系的熒光猝滅常數(shù)KSV減少；文中實驗條件下，雙分子猝滅速率常數(shù)（Kq）數(shù)量級在1012，該值大于2×1010L/（mol·s）（各類猝滅劑對生物大分子的Kq）。由此推斷，PBZ對HSA內源熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅，兩者間形成了復合物。

根據(jù)F?rster理論，熒光物質與受體間發(fā)生非輻射能量轉移亦可能導致HSA內源熒光猝滅原因之一[15]。圖6為 1 μmol/L HSA 和 PBZ的熒光發(fā)射譜、吸收光譜的重疊圖，采用矩形分割法可求得298 K時兩光譜重疊區(qū)的重疊積分為J=2.06×10-16（cm3·L）/mol，臨界距離R0=1.046 nm，能量轉移效率E=0.105，結合距離r=0.65 nm。由于r<7 nm，且0.5R0

圖6 HSA的熒光發(fā)射譜和PBZ的吸收光譜

2.4 PBZ與HSA作用的結合常數(shù)和結合位點數(shù)

熒光物質與猝滅體之間形成非熒光復合物時 ，可利用Lineweacr-Burk雙對數(shù)方程[16]（lg[（F0-F）/F]=lgKA+nlg[Q]）得到結合常數(shù)KA和結合位點數(shù)n（如表2所示）。298 K和310 K下，結合常數(shù)KA數(shù)量級均在104，說明PBZ與HSA之間作用力適中，兩者形成了較為穩(wěn)定的復合物。結合位點n近似為1，表明PBZ和HSA間結合類型為1∶1。

表2 PBZ與HSA作用的結合常數(shù)及結合位點數(shù)

2.5 熱力學參數(shù)及作用力

藥物分子與HSA間可逆結合化學鍵主要涉及：靜電作用、氫鍵、范德華力和疏水鍵[17]。由范特霍夫方程[18]（lnKA=-ΔH/RT+ ΔS/R，ΔG=ΔH-TΔS）計算PBZ和HSA作用的熱力學參數(shù)焓（ΔH）、熵（ΔS）和吉布斯自由能（ΔG），結果如表 3所示。由表 3可知，ΔG<0，ΔH<0，ΔS>0，說明PBZ與HSA間相互作用是一個自發(fā)吸熱的過程，亦是一個熵增加的過程，二者作用的主要驅動力為疏水作用力，這與分子對接以及文獻[7]結果一致。

表3 PBZ與HSA作用的熱力學參數(shù)

2.6 PBZ對HSA二級結構的影響

同步熒光光譜被廣泛用于多組分物質分析，它可以提供關于色氨酸（Trp214，Δλ=60 nm）和酪氨酸（Tyr，Δλ=15 nm）殘基的熒光團微環(huán)境變化的有用信息，而這些熒光團與蛋白質的構象變化密切相關[19-20]。圖7和圖8為PBZ和HSA作用的同步熒光光譜，兩步長（60 nm和15 nm）熒光強度均隨PBZ濃度的增加而被明顯猝滅。代表色氨酸殘基的熒光猝滅程度（36.8%）明顯大于酪氨酸殘基（13.2%），表明HSA與PBZ結合部位更靠近色氨酸，這與PBZ為位點I的標記藥物結論相符。此外，色氨酸、酪氨酸殘基最大發(fā)射波長分別藍移1.2 nm和0.3 nm，表明與PBZ作用在一定程度上影響了HSA構象，主要引起兩熒光生色團微環(huán)境極性增加。

圖7 PBZ對HSAΔλ=15 nm同步熒光的影響（298 K）

圖8 PBZ對HSAΔλ=60 nm同步熒光的影響（298 K）

3 結論

綜上所述，通過多光譜技術與分子對接，研究了PBZ與HSA間的相互作用。結果表明，兩者間的疏水作用力推動了PBZ-HSA復合物的形成。結合過程使HSA構象改變，色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境極性均有所增加，兩者間結合距離為0.65 nm。此外，分子對接進一步解釋并驗證了光譜分析正確性，表明除ⅡA結構域28個氨基酸殘基外，PBZ周圍4.0 ?區(qū)域還存在ⅠB、ⅡB、ⅢA亞結構域17個氨基酸殘基。PBZ與HSA間結合常數(shù)為104數(shù)量級，其值適中。本研究對預測WF與HSA結合率和其安全性評估提供一定的參考數(shù)據(jù)。