5種不同醬油抗氧化活性的對比分析

馮拓，單培，盛明健，王澤建，王博，張智宏，高獻禮*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）（2.湖州老恒和釀造有限公司，浙江湖州 313000）（3.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

醬油是以大豆/豆粕、小麥/面粉、麩皮、食鹽等為原料，原料經(jīng)預處理、制曲、醬醪發(fā)酵、淋油及加熱配制等程序釀制而成的液態(tài)調味品[1-3]。醬油特有的香氣、滋味和色澤不僅能夠改善菜肴的風味，還能賦予菜肴特有的色澤[3-5]，經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的小分子肽等物質則更有利于人體的吸收與代謝[6-9]。大量研究表明，醬油具有抗癌作用[10-13]、抗氧化活性[3,8,14]、抗過敏活性和低致敏性[15]和抗菌活性[16]等。因此，醬油是一種具有保健活性的重要調味品。

黑豆和黃豆同屬豆科蝶形花亞科大豆屬，都含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、礦物質、膳食纖維等營養(yǎng)物質，不同的是黃豆中含有少量的胡蘿卜素，而黑豆中含有大量黑色素等花色苷類物質[11-13]。黃豆中粗蛋白的含量約為 34%～40%，而黑豆蛋白含量可達49.8%，明顯高于黃豆，黑豆中所含的人體必須氨基酸更加均衡，是優(yōu)質的膳食蛋白質[13]。黑豆中脂肪含量約16%，不飽和脂肪酸含量70%以上[11,13]，且含有一定量黃豆所不具備的磷脂，有助于降低血液中膽固醇含量[11]。黑豆中的鐵和硒含量也高于黃豆[11,12]。因此，相比于黃豆，黑豆的營養(yǎng)價值更高。此外，《本草綱目》記載“黑豆有補腎養(yǎng)血、清熱解毒、活血化瘀、烏發(fā)明目、延年益壽功效”，表明黑豆還具備藥用功效。

農(nóng)學著作《齊民要術》（公元420-589年）中記載中國最早的醬油是以黑豆為主要原料制成的[17]。目前，在中國、日本、韓國和東南亞國家，醬油主要是以大豆或脫脂豆粕為主要原料生產(chǎn)的，根據(jù)生產(chǎn)工藝、含鹽量、發(fā)酵時間的不同可分成不同的種類[17]。近年來，隨著人們對黑豆營養(yǎng)和功能活性的深入認識及健康意識和生活水平的提高，以黑豆為主要原料生產(chǎn)的黑豆醬油已成為高端醬油市場的新寵。與黃豆醬油相比，國內外對黑豆醬油的研究和報道較少。最近，Gao等[17]對黑豆醬油關鍵香氣活性化合物進行了分離、鑒定和驗證，共從黑豆醬油中鑒定出41種關鍵香氣化合物，其中40種與黃豆醬油中的關鍵香氣化合物相同，但兩種醬油中部分關鍵香氣化合物的含量存在顯著差異，這是導致兩種醬油香氣存在差異的主要原因。前期研究表明黃豆醬油具有顯著的清除 DPPH、ABTS自由基的能力及良好的金屬離子螯合力和還原力[14]，但有關黑豆醬油抗氧化活性的研究很少見到系統(tǒng)報告。

因此，本研究首先系統(tǒng)分析了黑豆醬油和黃豆醬油的活性成分和抗氧化活性，然后對醬油的活性成分和抗氧化活性進行相關性分析以闡明醬油中抗氧化活性物質與抗氧化活性之間的內在關系，最后采用聚類分析和主成分分析來對 5種醬油的綜合品質進行評價，以期為醬油抗氧化機制的深入研究和消費者選擇合適的醬油提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黑豆醬油、黃豆生抽、黃豆老抽、太油和無鹽醬油，均由湖州老恒和釀造有限公司提供，具體樣品信息見表1。

福林酚、三氯乙酸、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2′-聯(lián)氨-雙二 胺 鹽 （ 2,2′-azino-bis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、沒食子酸、鐵氰化鉀、菲咯嗪、蘆丁和奎諾二甲基丙烯酸酯（水溶性維生素 E，6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox），購自美國Sigma公司；其他化學藥品為分析純，購自國藥集團有限公司。

表1 醬油樣品信息Table 1 Information of soy sauce samples

1.2 儀器與設備

EX223型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；電子萬用爐，通州實驗儀器廠；MD SpectraMax M2型多功能酶標儀，Molecular Devices；pH計，METTLER TOLEDO；高效液相色譜儀，美國Agilent公司；78-1型磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本活性成分的測定

1.3.1.1 總酚的測定

參照Xu等[18]的方法略作修改用以測定醬油中的總酚含量。使用沒食子酸作為標準品，并根據(jù)沒食子酸標準曲線計算醬油中的總酚含量，該結果以 μg gallic acid equivalent/mL醬油（μg GAE/mL醬油）表示。

1.3.1.2 總黃酮的測定

使用蘆丁作為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定醬油中總黃酮的含量。根據(jù)蘆丁標準曲線計算醬油中的總黃酮含量，該結果以μg rutin equivalent/mL醬油（μg RE/mL醬油）表示。

1.3.1.3 氨基酸態(tài)氮與總酸的測定

氨基酸態(tài)氮與總酸的測定方法參照 GB/T 5009.40-2003。

1.3.1.4 還原糖的測定

還原糖的測定方法參照GB/T 5009.7-2003。

1.3.1.5 總糖的測定

取一定量的醬油于 250 mL錐形瓶中，加水 10 mL，6 mol/L HCl 2 mL，70 ℃水浴加熱15 min。冷卻后加入甲基紅指示液2～3滴，用NaOH溶液（5 mol/L）滴定至紅色消失，冷卻后備用。其他步驟參照還原糖的測定方法。

1.3.1.6 色深物質的測定

根據(jù)Gao等[14]的方法略作修改以測定醬油中色深物質的相對含量，用蒸餾水將醬油樣品稀釋100倍及以上，再用0.45 μm孔徑的微孔過濾器過濾后，于420 nm處測定其吸光度A420nm，稀釋倍數(shù)為k，以A420nm×k來表示醬油中色深物質的相對含量。

1.3.1.7 無鹽固形物的測定

無鹽固形物的測定方法參照 GB 18186-2000方法，將醬油樣品置于烘箱中，在105 ℃下烘干至恒重，計算出醬油樣品的總固形物含量，將總固形物含量減去醬油中所含的氯化鈉含量即為無鹽固形物的含量。

1.3.1.8 游離氨基酸的測定

根據(jù)Gao等[7]的方法來測定游離氨基酸。將醬油樣品用10 g/100 mL三氯乙酸等體積稀釋，再用0.45 μm孔徑的微孔過濾器過濾，通過柱前衍生化后上機分析。采用 PICO·TAG 氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm），測定波長為254 nm，溫度為38 ℃，洗脫液流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，用氨基酸標準樣品來定量。

1.3.2 抗氧化活性的測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力

在Brand-Williams等[19]的方法基礎上稍加修改用以測定醬油對DPPH自由基清除能力。并使用以下公式計算醬油對DPPH自由基清除能力：

式中：

A0——僅含DPPH的空白溶液的吸光度；

A1——含DPPH的醬油的吸光度；

As——不含DPPH的醬油的吸光度。

1.3.2.2 ABTS自由基清除能力

參照 Lee等[20]的方法略作修改用以測定醬油對ABTS自由基清除能力，使用Trolox為標準品，該結果以μmol Trolox equivalent/mL醬油（μmol TE/mL醬油）表示。

1.3.2.3 還原力測定

根據(jù) Tchabo等[21]的方法稍加修改用以測定醬油的還原力，使用抗壞血酸為標準品，該結果以 μg ascorbic acid equivalent/mL醬油（μg AAE/mL醬油）表示。

1.3.2.4 金屬離子螯合能力測定

參照Zheng等[22]的方法稍加修改用以測定醬油的金屬離子螯合能力，使用乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）為標準品，該結果以μg EDTA equivalent/mL醬油（μg EE/mL醬油）表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均測定 3次，以平均值±標準偏差的形式表示各測定數(shù)據(jù)。運用SPSS 18.0軟件（SPSS公司，美國）進行單因素方差分析、相關性分析（相關系數(shù)為Pearson）、聚類分析（采用的聚類方法為組間聯(lián)接；度量標準下區(qū)間采用的平方Euclidean距離）以及主成分分析（采用因子分析）。

2 結果與分析

2.1 基本活性成分的比較

2.1.1 總酚和總黃酮

總酚分析結果如表2所示，各醬油樣品的總酚含量范圍為 4.69 mg GAE/mL（無鹽醬油）～16.23 mg GAE/mL（黑豆醬油），且各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。張歡歡等[23]研究表明經(jīng)過150 d的發(fā)酵，黑豆醬油的總酚含量能夠達到550.75 mg/100 mL，黃豆醬油的總酚含量為344.22 mg/100 mL，兩種醬油的總酚含量均低于本研究所測醬油的多酚含量，而Gao等[14]也測定了發(fā)酵醬油中的總酚含量，結果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過超聲處理與經(jīng)過超聲處理的醬油的總酚含量分別為1.61、2.04 mg GAE/mL，同樣也低于本研究所測醬油的總酚含量，一方面可能因為本研究所選擇的是工廠所生產(chǎn)的產(chǎn)品醬油，而張歡歡等[23]與Gao等[14]所用的是在實驗室條件下所釀造的醬油，成曲條件、不同的大曲鹽水比例以及釀造環(huán)境等可能會影響豆類中總酚物質的溶出率，另一方面可能由于本研究所選擇的醬油中有更多除酚類化合物外含酚羥基的物質，例如酪氨酸，從而導致采用Folin-Ciocalteu法測得的醬油總酚含量更高[23]。

總黃酮分析結果如表2所示，各醬油樣品的總黃酮含量范圍為0.31 mg RE/mL（無鹽醬油）～1.25 mg RE/mL（黑豆醬油），除黃豆老抽與黃豆生抽間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。Gao等[14]測定的未經(jīng)過超聲處理與經(jīng)過超聲處理的醬油的總黃酮含量分別為 0.17、0.19 mg rutin/mL，明顯低于本研究所測醬油的總黃酮含量，而張歡歡等[23]測定的黑豆醬油與黃豆醬油的總黃酮含量分別為57.32、38.21 mg/100 mL，顯著高于本研究所測醬油的總黃酮含量，3項研究所測醬油的總黃酮含量差異性顯著，造成這一現(xiàn)象的原因在于較長的發(fā)酵周期、較高的溫度以及光照等因素容易使黃酮類化合物趨于不穩(wěn)定，繼而降解[24]。

2.1.2 色深物質

色深物質分析結果如表2所示，各樣品的色深物質范圍為33.61（無鹽醬油）～160.68（黑豆醬油），除太油與黃豆老抽間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。黑豆醬油的色深物質顯著多于其他醬油，甚至于黃豆老抽醬油，一方面可能是因為在發(fā)酵中后期，黑豆醬油中含有更多的氨基化合物和羰基化合物，它們通過羰胺反應生成了更多的棕色、黑色的美拉德反應產(chǎn)物，使醬油的顏色加深，另一方面可能在于黑豆含有遠高于黃豆的花色苷類物質[11-13]，并且黑豆的主要著色成分是矢車菊素-3-半乳糖苷，屬于黑豆紅色素的其中一種（另外兩種分別為矢車菊素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷），而花色苷作為一類水溶性色素，能夠在一定程度上使醬油的顏色加深[25,26]。

2.1.3 氨基酸態(tài)氮、還原糖、總糖和總酸

氨基酸態(tài)氮分析結果如表2所示，各樣品的氨基酸態(tài)氮范圍為1.23 g/100 mL（黃豆生抽）～1.71 g/100 mL（黑豆醬油），均高于釀造醬油的特級醬油標準（0.80 g/100 mL），除黑豆醬油與太油、黃豆老抽與黃豆生抽間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。還原糖分析結果如表2所示，各樣品的還原糖范圍為2.53 g/100 mL（太油）～6.43 g/100 mL（黑豆醬油），除無鹽醬油與黃豆老抽、黃豆生抽與太油間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。總糖分析結果如表2所示，各樣品的總糖范圍為3.80 g/100 mL（黃豆生抽）～8.85 g/100 mL（黑豆醬油），除黃豆老抽與太油間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）?？偹岱治鼋Y果如表2所示，各樣品的總酸范圍為0.88 g/100 mL（太油）～2.93 g/100 mL（黑豆醬油），除黃豆生抽與黃豆老抽間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。

吳星茹等[27]對其所挑選的 26種老抽醬油樣品進行了各種理化指標的測定，結果發(fā)現(xiàn)各樣品的氨基酸態(tài)氮含量范圍為0.28 ～1.00 g/100 mL，還原糖含量范圍為2.20 ～9.64 g/100 mL，總酸含量范圍為0.78 ～1.80 g/100 mL，可以很明顯發(fā)現(xiàn)黑豆醬油在氨基酸態(tài)氮、還原糖和總酸等基本活性成分方面均優(yōu)于其他醬油樣品，根據(jù)張歡歡等[23]的研究結果發(fā)現(xiàn)，在制曲階段，相同條件下黑豆成曲中的中性蛋白酶活約為黃豆成曲的1.28倍，淀粉酶活約為黃豆成曲的1.11倍，更高的蛋白酶活及淀粉酶活更有利于大分子蛋白質和淀粉向小分子肽、氨基酸、寡糖、單糖等小分子物質轉化，另外，黑豆中更多的蛋白質和淀粉為各種蛋白酶和淀粉酶提供更多的作用底物，從而使黑豆醬油中氨基酸態(tài)氮、還原糖和總糖含量顯著高于其他以黃豆為原料釀造的醬油。另外，黑豆醬油的總酸含量顯著高于其他醬油樣品，可能原因是在發(fā)酵中后期，黑豆醬油中有機酸類物質的生成速度是要快于其轉化為醇等其他物質的速度。

2.1.4 無鹽固形物

表2 5種醬油活性成分的比較Table 2 Comparison of active ingredients in five kinds of soy sauces

表3 5種醬油游離氨基酸組成的比較Table 3 Comparison of free amino acid compositions in five kinds of soy sauces

無鹽固形物分析結果如表2所示，各樣品的無鹽固形物范圍為25.06（無鹽醬油）～29.11 g/100 mL（黑豆醬油），除黑豆醬油，太油與黃豆老抽、黃豆老抽與黃豆生抽、黃豆生抽與無鹽醬油間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。吳星茹等[27]測定 26種醬油樣品的可溶性無鹽固形物含量范圍為15.16～44.89 g/100 mL，本研究所測5種醬油樣品的無鹽固形物含量均在其中，即與吳星茹等[27]研究結果不沖突。另外，無鹽固形物主要包括醬油中蛋白質、氨基酸、肽、糖類等基本營養(yǎng)成分，除去人為加入的添加劑，無鹽固形物含量越高，醬油的綜合品質也就越高，如表2所示，無鹽固形物含量的順序依次為黑豆醬油＞太油＞黃豆老抽＞黃豆生抽＞無鹽醬油，據(jù)此大體可以判斷出這5種醬油的品質順序依次為黑豆醬油＞太油＞黃豆老抽＞黃豆生抽＞無鹽醬油。

2.1.5 游離氨基酸

5種醬油游離氨基酸組成如表3所示，黑豆醬油、黃豆生抽、黃豆老抽、太油和無鹽醬油中的總游離氨基酸含量分別為47.89、39.70、39.19、46.85和42.21 mg/mL，黑豆醬油的總游離氨基酸含量高于其他醬油，原因可能在于制曲階段黑豆大曲中更高的蛋白酶活[23]以及黑豆含有更多可用于蛋白酶作用的底物-蛋白質[13]，使得更多的蛋白質被酶活更高的蛋白酶快速降解成更多的氨基酸。馮云子等[28]研究了日式醬油和中式醬油（特級釀造醬油味極鮮）的游離氨基酸組成，結果顯示日式醬油和中式醬油的總游離氨基酸含量分別為5579.69 mg/100 mL和394.54 mg/100 mL，與本研究的結果有所差異，可能原因在于盡管這些醬油樣品都是采用高鹽稀態(tài)工藝釀造出來的，但是不同廠家對于釀造原料（黃豆/脫脂豆粕、面粉/小麥等）的選擇與要求大體上是不同的，釀造工藝上的細分之處（釀造溫度、鹽水比例、醬丕制作等）可能也不盡相同。

2.2 黑豆醬油和黃豆醬油抗氧化活性的比較

DPPH自由基清除能力分析結果如表4所示，在所有醬油樣品均稀釋1600倍的情況下，DPPH自由基的清除能力在9.23%（無鹽醬油）～36.60%（黑豆醬油）之間，除黃豆老抽與太油間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。Gao等[14]測定了發(fā)酵醬油對DPPH自由基的清除能力，結果發(fā)現(xiàn)稀釋100倍后未經(jīng)過超聲處理與經(jīng)過超聲處理的醬油對DPPH自由基的清除能力分別為63.20%、72.61%，與本研究結果存在顯著差異，可能原因是在測試過程中對醬油的稀釋倍數(shù)不同，但黃豆老抽對DPPH自由基的清除能力顯著高于黃豆生抽，這與李瑩等[29]研究結果相符。

ABTS自由基清除能力分析結果如表4所示，各醬油樣品的 ABTS自由基清除能力的范圍為 98.72 μmol TE/mL（無鹽醬油）～278.87 μmol TE/mL（黑豆醬油），除黃豆老抽與黃豆生抽間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。李瑩等[29]測定了41種醬油樣品的ABTS自由基清除能力，結果發(fā)現(xiàn)各醬油樣品對ABTS自由基清除能力的范圍為102.55～636.76 mmol trolox/mL，這與本研究結果存在顯著差異，可能是由于兩項研究對于ABTS自由基清除能力的計算標準不同，從而導致最終的結果差異顯著。另外，黃豆老抽與黃豆生抽在ABTS自由基清除能力方面沒有顯著差異，這與李瑩等[29]研究結果相符；黑豆醬油對ABTS自由基清除能力顯著高于其余黃豆醬油，這與張歡歡等[23]研究結果相符。

還原力分析結果如表4所示，各醬油樣品的還原力的范圍為4.39 mg AAE/mL（無鹽醬油）～12.08 mg AAE/mL（黑豆醬油），除黃豆老抽與黃豆生抽、黃豆生抽與無鹽醬油等樣品間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。黑豆醬油的還原力顯著高于其余黃豆醬油，這與張歡歡等[23]研究結果相符。Gao等[14]也研究了超聲處理醬油對醬油還原力的影響，結果表明經(jīng)過超聲處理的醬油還原力顯著高于未作超聲處理的醬油，且經(jīng)過超聲處理與未經(jīng)超聲處理的醬油還原力分別為 2783.97、2239.87 μg AAE/mL醬油，與本研究結果有所差異，可能原因是所測試的醬油種類不同，還原力也會有所差異。

金屬離子螯合能力分析結果如表4所示，各醬油樣品的金屬離子螯合能力的范圍為 53.61 μg EE/mL（無鹽醬油）～3433.24 μg EE/mL（太油），且各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。太油的金屬離子螯合能力最強，約為黑豆醬油的1.35倍，黃豆老抽的6.12倍，黃豆生抽的12.10倍，無鹽醬油的64.04倍，這可能要歸因于恒和太油特殊的釀造工藝，太油一般需要經(jīng)過長達五年時間的精心釀造，每年將上一年釀造出來的頭伏醬油替代鹽水加到新一年的醬丕中，重新釀造，如此反復四次后方能灌瓶出廠，長時間的釀造及特殊的工藝使恒和太油富含具有強金屬離子螯合能力的物質，從而使恒和太油的金屬離子螯合能力顯著高于其他醬油樣品。黑豆醬油的金屬離子螯合能力僅次于太油，是黃豆老抽的4.55倍，黃豆生抽的8.99倍，無鹽醬油的47.59倍，黑豆醬油能夠具備如此優(yōu)異的金屬離子螯合能力可能要歸因于其含有遠高于黃豆的花色苷類物質，袁利鵬等[30]研究表明南方地區(qū)的黑豆總花色苷含量比黃豆高42.5倍，北方地區(qū)的黑豆總花色苷含量比黃豆高57.8倍，并且曹柏營等[31]通過優(yōu)化黑豆花青素提取工藝條件使黑豆花青素得率達到了 1.101 mg/g，同時測定了黑豆花青素的體外抗氧化活性，結果表明當黑豆花青素濃度為50 μg/mL時，其對鐵離子螯合能力能夠達到93.09%，對DPPH自由基的清除能力能夠達到84.32%，綜合上述研究，黑豆含有更多具備優(yōu)異鐵離子螯合能力和強DPPH自由基清除能力的花青素等花色苷類物質，以致于黑豆醬油在金屬離子螯合能力和DPPH自由基的清除能力方面顯著高于其他黃豆醬油。

表4 5種醬油抗氧化活性的比較Table 4 Comparison of antioxidant activities in five kinds of soy sauces

2.3 相關性分析結果

大量研究表明，多酚類化合物具有較好的抗氧化活性以及清除各種自由基的能力[23]，大豆異黃酮具有較強的抗氧化能力，且游離型的異黃酮強于糖苷型的異黃酮[3]。李瑩等[32]研究結果表明，對41種市售醬油樣品的抗氧化活性起主要貢獻的兩個指標是醬油總固形物和褐變指數(shù)，Gao等[14]研究表明在醬醪發(fā)酵過程中，進行超聲處理釋放的更多游離氨基酸顯著增強了醬油對DPPH自由基的清除能力（尤其是丙氨酸、亮氨酸和蘇氨酸）和金屬離子螯合能力（尤其是精氨酸、亮氨酸和賴氨酸）。綜合上述研究結果，本研究選用總酚、總黃酮、色深物質和游離氨基酸作為5種不同醬油中的主要抗氧化活性成分。

對5種醬油樣品的抗氧化活性［DPPH自由基清除能力（DPPH radical scavenging activity，DRSA）、ABTS自由基清除能力（ABTS radical scavenging activity，ARSA）、還原力（reducing power，RP）和金屬離子螯合能力（metal ion chelating activity，MICA）］與抗氧化活性成分（總酚、總黃酮、色深物質和游離氨基酸）之間進行相關性分析，結果見表5所示。

由表5可知，5種醬油中總酚含量與DRSA、ARSA和RP呈極顯著性正相關（p＜0.01），相關系數(shù)分別為0.972、0.995和0.992?？傸S酮含量與ARSA和RP呈極顯著性正相關（p＜0.01），相關系數(shù)分別為 0.953、0.984、0.960；與DRSA呈顯著性正相關（p＜0.05），相關系數(shù)為0.953。色深物質含量與DRSA呈極顯著性正相關（p＜0.01），相關系數(shù)為0.968；與ARSA和RP呈顯著性正相關（p＜0.05），相關系數(shù)分別為0.933、0.909。僅游離氨基酸含量與DRSA、ARSA和RP均無顯著相關性。表5結果表明醬油中總酚、總黃酮和色深物質是造成5種醬油抗氧化活性存在顯著差異的主要原因，影響大小的順序依次為總酚＞總黃酮＞色深物質，并且總酚和色深物質具有極強的DPPH自由基清除能力，總酚和總黃酮具有極強的ABTS自由基清除能力和還原力，而游離氨基酸僅與4種抗氧化活性呈正相關性，與Gao等[14]的研究結果有所不同，可能原因在于Gao等[14]主要研究了超聲處理對醬油抗氧化活性的影響，結果表明超聲處理顯著促進了游離氨基酸和總酚的釋放，而對總黃酮的釋放和色深物質的生成沒有顯著影響，所以游離氨基酸和總酚是造成經(jīng)超聲處理與未經(jīng)超聲處理醬油的抗氧化活性存在顯著差異的主要原因，與本研究的研究結果不沖突。另外，對于醬油中具備極強金屬離子螯合能力的具體物質尚不明確，還有待進一步的研究。

表5 醬油中抗氧化活性成分與抗氧化活性之間的相關性Table 5 Correlation between antioxidant components and antioxidant activities in soy sauces

2.4 聚類分析結果

對 5種醬油樣品的 4種抗氧化活性（DRSA、ARSA、RP和MICA）和4種抗氧化活性成分（總酚、總黃酮、色深物質和游離氨基酸）進行系統(tǒng)的聚類分析，采用平方Euclidean距離為度量準則，得到聚類分析如圖1所示。

當距離大于5小于25時，可將5種醬油樣品很好地分為2大類，其中黑豆醬油和太油為第1類，黃豆老抽、黃豆生抽和無鹽醬油為第2類。結合具體數(shù)據(jù)與分析所得可知，根據(jù)綜合的抗氧化能力和抗氧化活性成分進行排序為：第1類＞第2類，也即黑豆醬油和太油這兩種醬油的綜合抗氧化能力較好，綜合抗氧化活性成分較多。

2.5 主成分分析結果

對測定所得到的包括抗氧化活性（DRSA、ARSA、RP和MICA）和抗氧化活性成分（總酚、總黃酮、色深物質和游離氨基酸）這8個變量的原始數(shù)據(jù)進行主成分分析，為了保證信息的完整性和可靠性，累計方差貢獻率應該達到80%以上，結果見表6、表7、表8。

由表6可知，第1個主成分的特征值大于1，方差貢獻率達到了 86.603%，其余主成分的特征值均小于1。毫無疑問，第1主成分（PC1）是最重要的，特征值是6.928，解釋了86.603%的變異。如表7所示，總酚、總黃酮、色深物質、游離氨基酸、DRSA、ARSA、RP、MICA在PC1上有較高的載荷，說明第1主成分基本反映了這些指標的信息。由于提取第1個主成分可以基本反映全部指標的信息，因此決定用1個新變量（PC1）來代替原來的8個變量（總酚、總黃酮、色深物質、游離氨基酸、DRSA、ARSA、RP、MICA）。通過計算得出PC1得分，也即綜合得分，如表8所示，結果表明，黑豆醬油綜合得分排名第一，其次是太油、黃豆老抽、黃豆生抽、無鹽醬油。

表6 主成分的初始特征值及累積方差貢獻率Table 6 Initial eigenvalue and cumulative variance contribution rate of principal components

表7 第1主成分的變異來源Table 7 Source of variation for the first principal component(PC1)

表8 醬油樣品主成分得分和綜合得分Table 8 Main component score and comprehensive score of soy sauce samples

3 結論

本研究通過對5種醬油進行活性成分和抗氧化活性測定，發(fā)現(xiàn)除氨基酸態(tài)氮、無鹽固形物、游離氨基酸外，黑豆醬油的總酚、總黃酮、色深物質、還原糖、總糖和總酸等活性成分含量均顯著高于其余4種黃豆醬油（p＜0.05）；除金屬離子螯合能力外，黑豆醬油的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力等抗氧化活性均顯著高于其余 4種黃豆醬油（p＜0.05）；相關性分析結果表明醬油中總酚、總黃酮和色深物質是造成5種醬油抗氧化活性存在顯著差異的主要原因，其影響抗氧化活性大小的順序依次為總酚＞總黃酮＞色深物質，并且總酚和色深物質具有極強的DPPH自由基清除能力，總酚和總黃酮具有極強的ABTS自由基清除能力和還原力；聚類分析結果和主成分分析結果均表明黑豆醬油的綜合品質高于其余 4種黃豆醬油。本研究證明了黑豆醬油的抗氧化能力和活性成分基本都顯著高于其余4種黃豆醬油，并闡明了5種醬油的抗氧化活性成分與抗氧化活性之間的內在關系，可為黑豆醬油抗氧化活性的深入研究和消費者選擇合適的醬油提供數(shù)據(jù)支撐和科學依據(jù)。