徐州地區(qū)土壤中放線菌的分離鑒定

◇江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校 郭慶宇 朱中原 陳 曦

采集徐州范圍不同類型土壤，從中分離培養(yǎng)放線菌。統(tǒng)計各類型土壤樣本中放線菌含量及種類，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌占大多數(shù)，還有部分小單孢菌類。農(nóng)作物地和植物地及城市荒地中放線菌含量豐富，在沙地等貧瘠土地中含量較少。挑出有特點的菌落進行單菌種培養(yǎng)，得到一株稀有放線菌，用埋片法觀察該株放線菌形態(tài)特征，并做電鏡掃描，初步鑒定為小雙孢菌。將此菌株接種在不同常規(guī)培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)在各種培養(yǎng)基上均能生長，但未產(chǎn)生可溶性色素。

放線菌種類繁多，代謝功能各異，是非常有實用價值的一類菌，受到極大重視[1]。當前發(fā)現(xiàn)的放線菌只占自然界的10%～20%，所以改進分離方法、尋找新的放線菌，是放線菌資源調(diào)查開發(fā)的一個重要方面[2]。土壤是放線菌習居的良好場所，土壤理化性質(zhì)和土壤形成的環(huán)境條件強烈影響并決定著土壤放線菌的種類、數(shù)量及生理生化性質(zhì)[3]。

1 研究內(nèi)容

從徐州地區(qū)采集不同類型的土壤樣本，選擇性培養(yǎng)放線菌，從中篩選長勢良好的放線菌，并進行定向富集培養(yǎng)，鑒定菌種，總結(jié)不同土壤中放線菌含量與種類的規(guī)律。

2 實驗設計

2.1 實驗儀器

HZQ-C 空氣浴振蕩器，電子天平，無菌工作臺，1 mL、10 mL移液管，40 μL、100 μL微量注射器，全自動壓力蒸汽滅菌鍋，100目篩。

2.2 實驗試劑

硫酸鎂，硫酸亞鐵，硝酸鉀，磷酸氫二鉀，氯化鉀，硫酸銨，碳酸鈣，重鉻酸鉀，瓊脂，可溶性淀粉，蔗糖，葡萄糖，牛肉汁，酵母浸膏。

2.3 實驗設計

（1）土樣采集。選擇江蘇徐州范圍內(nèi)不同類型土壤，挖出地表土以下約5厘米土壤，裝入潔凈信封，共采集12處土樣。

（2）土樣處理。①風干粉碎。將采集好的土樣進行編號，分別為1～12號，室溫下風干10填。土樣風干可以大大降低細菌的數(shù)量。風干后，將土樣研成細粉狀，過100目篩，每份10克，備用。②土樣干熱。放線菌的孢子一般比非產(chǎn)芽孢的細菌抗熱性要強，120 ℃加熱1 h就會迅速減少細菌和部分鏈霉菌的數(shù)量，而小雙孢菌和鏈孢囊菌只有輕微減少。因此，將土樣在120 ℃恒溫箱中干熱處理1小時。

（3）放線菌分離培養(yǎng)。①土樣稀釋液配制。取潔凈試管48支，每4支為一組，共12組。每只試管加蒸餾水9 mL，121.3 ℃滅菌。先將1號土放入第一組試管的第一支中，震蕩混勻，待稍沉淀后，用1 mL無菌移液管取1 mL土壤懸液加入第二只試管中，震蕩搖勻后再取1 mL加入第三只試管，第四只類推。所以第三只、第四只試管分別是該土樣的103、104稀釋液。按上述方法，分別用12份土樣做成稀釋液。②放線菌分離培養(yǎng)。重鉻酸鉀能強烈抑制細菌和真菌的生長，而放線菌幾乎不受影響。在高氏一號瓊脂培養(yǎng)基每500 mL中加入重鉻酸鉀抑制劑0.4 mL，滅菌后倒平板。用1 mL無菌移液管分別吸取上步中103、104稀釋液0.2 mL，每種濃度的稀釋液涂2個平板，每一份土樣涂4個平板，總計48個平板。

將涂布好的平板在28 ℃恒溫環(huán)境培養(yǎng)7天，平板上長出各種放線菌菌絲，對每種土壤中放線菌的數(shù)量和種類進行統(tǒng)計。

（4）稀有放線菌的初篩。配制燕麥瓊脂培養(yǎng)基1800 mL，滅菌，分裝270個試管斜面。用接種針從前一階段涂布培養(yǎng)的平板上挑取形狀奇特、生長較小或產(chǎn)生色素的放線菌，將其接種在試管斜面上。每份土挑取10～20份菌，并編號，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天。

（5）稀有放線菌的擴大培養(yǎng)。在燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上，將篩選出的稀有放線菌進行涂布，每種涂布兩個平板。每種再用兩個平板做埋片法培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天，進行稀有放線菌的形態(tài)觀察及生理生化測定。①形態(tài)觀察。將用埋片法培養(yǎng)的放線菌蓋玻片取下，于載玻片上用光學顯微鏡和電子顯微鏡分別觀察形態(tài)特征和培養(yǎng)特征，形態(tài)特征記錄菌絲形態(tài)，氣生菌絲和基內(nèi)菌絲生長情況；菌絲體是否產(chǎn)生孢子絲及孢子絲的排列方式、形狀；孢子絲形狀和大?。绘吣业挠袩o、形狀、大小及形成方式等。培養(yǎng)特征記錄孢子絲、菌絲顏色及是否產(chǎn)生可溶色素。②生理生化測定。使用高氏一號瓊脂培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、貝奈特瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基及無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基平板，用平板劃線法將分離出的稀有放線菌分別接種在以上平板上，每種培養(yǎng)基兩個，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天，觀察放線菌在不同培養(yǎng)基平板上的生長狀況并作出統(tǒng)計。

3 實驗結(jié)果

3.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

使用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)分離放線菌，28 ℃培養(yǎng)7天后，觀察到培養(yǎng)基上長滿各種放線菌菌落，直徑較小，大多數(shù)產(chǎn)生色素，見圖1。

圖1 分離出的土壤放線菌

取稀釋104倍的平板對每種土壤樣本放線菌菌落進行計數(shù)，并初步分類，見表1。

表1 每種土壤樣本放線菌數(shù)量和分類

表中Mim代表小單孢菌放線菌類群，Acm代表馬杜拉放線菌類群，Apl代表游動放線菌類群，Str代表鏈霉菌。

對表1中的數(shù)據(jù)進行分析，首先將12種樣本分為荒地、沙地、農(nóng)作物地和普通植物地四種土壤類型，分別作其中放線菌含量和種類的統(tǒng)計，見表2。

表2 不同土壤類型放線菌含量和種類比例

由表2可以看出，荒地的土壤放線菌含量最高，達到130×104個/克土。農(nóng)作物地和城市普通植物地的放線菌含量也較高，分別為84×104個/克土和31.33×104個/克土，而沙地中放線菌含量極微，只有5×104個/克土。原因是沙地土壤貧瘠，營養(yǎng)成分少，不利于放線菌生長。農(nóng)村農(nóng)作物地和城市中普通植物地由于肥料充分，放線菌生長較好。而城市荒地多為草皮覆蓋，有較多的養(yǎng)分積累，放線菌生長也較好。四種類型土壤中鏈霉菌占大多數(shù)，其次是小單孢菌類和馬杜拉菌類，游動放線菌類最少。并且后兩種菌類在沙地土壤中未檢出。

3.2 稀有放線菌初篩結(jié)果

用接種針挑取形狀奇特、生長較小或產(chǎn)生色素的放線菌，接種在燕麥瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上。每份土挑取10～15份菌，編號，共挑取153個放線菌。恒溫培養(yǎng)后，對長成的放線菌進行鑒定，得到1株類似稀有放線菌，在5號土壤中，編號為01號菌。

3.3 稀有放線菌形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)

培養(yǎng)7天后，觀察各種菌在燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上生長情況如下：

氣生菌絲乳白色，茂盛?；z少，乳白色。無可溶色素。

將使用埋片法培養(yǎng)的01號菌種標本進行電鏡觀察，拍攝到的電鏡圖片如圖2所示。

圖2 01號放線菌掃描電鏡圖

將01放線菌制片后放光鏡下觀察，形態(tài)特征如下：

單軸分枝的氣絲上形成縱隊排列的雙孢子，孢子表面光滑，呈半球形，向內(nèi)凹陷，交替生長在側(cè)枝兩側(cè)，經(jīng)電鏡觀察，氣生菌絲直徑0.2 μm～0.3 μm。初步鑒定為小雙孢菌。

將01號菌分別在幾種常用培養(yǎng)基上用平板劃線法進行接種，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天后，觀察在各平板上生長狀況如表3所示。

表3 01號放線菌在不同培養(yǎng)基上的生長狀況

4 結(jié)論

（1）從徐州地區(qū)土壤樣本分離出土壤放線菌，經(jīng)分類統(tǒng)計其大多數(shù)屬于鏈霉菌類，有一部分小單孢放線菌類，有少量馬杜拉放線菌類和游動放線菌類。城市荒地和種植作物的土壤放線菌含量多，沙地放線菌含量稀少。

（2）從分離出的放線菌中得到1株稀有放線菌，經(jīng)單菌種培養(yǎng)并電鏡鑒定為小雙孢菌類，可能為新種，需進一步分析。

（3）將此種菌分別在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)培養(yǎng)基上長勢良好。