食管癌長非編碼RNA與腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展

龔小林綜述 謝宇杰，王茂生審校

1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000；2.高州市人民醫(yī)院胸外科，廣東 茂名 525200

食管癌是世界上發(fā)病率第七、癌癥死亡率第六的一種常見惡性腫瘤，每20例癌癥患者死亡，就有一例死于食管癌，它主要集中在東亞與南非的高發(fā)病的國家中[1]。食管癌在我國的發(fā)病率及死亡率明顯升高，我國的食管癌患者占全球一半以上，其中發(fā)病率居第六，癌癥死亡率居第四[2]。我國食管癌與西方國家的病理類型差異較大，西方國家以食管腺癌為主，而在我國食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占據(jù)食管癌發(fā)病率的90%以上。食管癌的5年生存率僅為15%～20%，它的預(yù)后與腫瘤的分期相關(guān)[3]。早期食管癌以手術(shù)治療為主，但多數(shù)食管癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為局部晚期患者，首選治療方法是新輔助放化療(nCRT)，然后是根治性手術(shù)。遺憾的是，大約20%的患者根本不會(huì)有病理反應(yīng)，超過50%的患者沒有充分的病理反應(yīng)，甚至大多數(shù)患者發(fā)生病理完全反應(yīng)后，會(huì)出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因是存在于腫瘤內(nèi)的極少數(shù)細(xì)胞，這些細(xì)胞具有無限增殖、自我更新及多向分化潛能，它們是腫瘤無限增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。此概念的提出為研究食管癌的發(fā)生與發(fā)展提供了一個(gè)新的視野，因此，研究具有更高治療抗性和轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞亞群更為重要，即所謂的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)。

近年來，長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)被普遍定義為超過200個(gè)核苷酸的非蛋白編碼RNA分子，在世界各地得到了廣泛的研究[5]。lncRNA是一組新的非編碼RNA，位于細(xì)胞核或胞漿組分中，被發(fā)現(xiàn)是機(jī)體生理和病理過程的重要調(diào)節(jié)因子，特別是在癌癥中。到目前為止，已經(jīng)通過高通量技術(shù)鑒定了5 000多個(gè)人類lncRNA[6]。lncRNA被報(bào)道參與了惡性腫瘤的多種生物學(xué)行為，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移與轉(zhuǎn)移[7]、細(xì)胞凋亡[8]、細(xì)胞周期及化療耐藥性等[9]。LncRNA已被報(bào)道與食管癌的多種惡性生物學(xué)行為相關(guān)，其中也包括與食管腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)行為。

1 與食管癌相關(guān)的腫瘤干細(xì)胞惡性生物學(xué)行為

目前已知食管癌腫瘤干細(xì)胞參與了食管癌的多種惡性生物學(xué)行為，總體而言，腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤中的小部分細(xì)胞，但它們主要是負(fù)責(zé)腫瘤的自我更新、轉(zhuǎn)移能力和治療耐藥性等，由于其特定的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征，它們往往對治療產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。另一方面，多項(xiàng)研究表明上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EΜT)與腫瘤干細(xì)胞間存在多種聯(lián)系。當(dāng)EΜT在癌癥中異常激活時(shí)，細(xì)胞獲得了有助于自我更新能力的干細(xì)胞屬性，并且能夠分化為腫瘤中的所有細(xì)胞類型。由此產(chǎn)生的即癌癥干細(xì)胞具有癌癥的各種惡性生物學(xué)特征，包括永生性復(fù)制、抵抗凋亡、侵襲性增加等[10]。此外，腫瘤干細(xì)胞模式認(rèn)為化療后剩余的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的再生能力，放化療被認(rèn)為是一個(gè)富集腫瘤干細(xì)胞的過程。腫瘤干細(xì)胞通過多種分子機(jī)制，如藥物外排泵的上調(diào)，或增強(qiáng)對ROS93-97的保護(hù)等，進(jìn)而采取一種靜止?fàn)顟B(tài)成為放化療抵抗的重要原因[11]。

2 lncRNA調(diào)節(jié)食管癌的EMT與轉(zhuǎn)移

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮向間充質(zhì)狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，在這個(gè)過程中，細(xì)胞表達(dá)的黏附分子改變，進(jìn)而增加了遷移和侵襲能力。目前已有研究表明，靶向lncRNA抑制EΜT有望抑制惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；lncRNA LBX2-AS1高表達(dá)于食管癌組織中，并通過促進(jìn)腫瘤EΜT增加食管癌的惡性生物學(xué)特征[12]。另外，lncRNA NΜR高表達(dá)于ESCC組織中，作為ESCC腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它的上調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，并與ESCC患者的整體生存率較差相關(guān)。在體外功能實(shí)驗(yàn)方面，NΜR能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高ESCC細(xì)胞的耐藥性[13]。有研究表明通過沉默LncRNA-ECΜ的表達(dá)能夠顯著降低食管癌細(xì)胞系TE-1和Eca109細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而LncRNA-ECΜ的過度表達(dá)促進(jìn)了兩種細(xì)胞系的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。敲除FTH1P3可顯著降低ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，沉默F(xiàn)TH1P3可降低食管癌細(xì)胞系EC9706和EC1中特異性蛋白1(SP1)和NF-κB(P65)的表達(dá)[15]。ESCC的另一抗癌基因，lncRNA LINC00675通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)抑制腫瘤的啟動(dòng)發(fā)生和EΜT[16]。另一項(xiàng)研究中，研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA RP11-766N7.4在ESCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分期和患者生存等相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)研究也表明，lncRNA RP11-766N7.4通過抑制EΜT的過程從而抑制食管癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[17]。

研究表明lncRNA SOX2OT在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性狀態(tài)起著重要作用[18]。高lncRNA-HOTAIR表達(dá)與食管癌患者的整體生存顯著相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)表明lncRNA-HOTAI增加了食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)了EΜT。分子機(jī)制相關(guān)的研究顯示lncRNA-HOTAIR與mir-148構(gòu)成海綿結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)Snail2的表達(dá)，最終促進(jìn)EΜT[19]。

3 lncRNA調(diào)節(jié)食管癌的放化療耐性

目前有研究表明lncRNA TUSC7的過度表達(dá)，調(diào)控miR-224的低表達(dá)從而抑制了ESCC細(xì)胞的增殖、克隆形成和化療耐藥，最終促進(jìn)了癌細(xì)胞凋亡。另外，該研究也證實(shí)了miR-224與DESC1特異結(jié)合，與DESC1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。TUSC7通過抑制miR-224增加DESC1的表達(dá)，從而抑制ESCC細(xì)胞的增殖和化療耐藥，信號(hào)通路的研究也表明了DESC1通過EGFR/AKT信號(hào)通路抑制了ESCC細(xì)胞的化療耐藥[20]。

此外，WISP1已被證明與ESCC腫瘤細(xì)胞中的EΜT表型密切相關(guān)，并作為食管鱗狀細(xì)胞癌放射治療的獨(dú)立預(yù)后因素。該研究表明WISP1是逆轉(zhuǎn)食管鱗狀細(xì)胞癌EΜT相關(guān)的放射治療抵抗的一個(gè)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)，可以作為食管癌放療患者的獨(dú)立預(yù)后因子[21]。

lncRNAAFAP1-AS1的高表達(dá)預(yù)測了經(jīng)放化療治療的ESCC患者的放化療耐性和不良預(yù)后[22]，因此可作為放化療的食管鱗癌預(yù)測標(biāo)志物。

此外，一項(xiàng)研究使用Kaplan-Μeier生存分析顯示，lncRNA LOC285194低表達(dá)患者的無病生存率(DFS)(P＜0.001)和總生存率(OS)降低(P＜0.001)。進(jìn)一步的多變量分析確定該分子為多變量獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子(P=0.001)。它的表達(dá)降低與食管鱗狀細(xì)胞癌放化療耐藥及預(yù)后不良的密切相關(guān)[23]。

食管癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA linc-VLDLR和ABCG2基因的高表達(dá)影響食管癌耐藥的形成，研究表明耐藥細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡可上調(diào)食管癌細(xì)胞ABCG2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的耐藥性，這與細(xì)胞外囊泡攜帶的linc-VLDLR有關(guān)[24]。

4 食管癌lncRNA與腫瘤干細(xì)胞研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

鑒定ESCC組織中l(wèi)ncRNA的異常表達(dá)對于研究lncRNA在ESCC中的作用具有重要意義。定量實(shí)時(shí)PCR(Q-PCR)是檢測ESCC組織中異常lncRNA表達(dá)的經(jīng)典方法[25]。近年來，現(xiàn)有的下一代測序(NGS)技術(shù)為研究人員提供了更完整的ESCC腫瘤與正常組織之間的lncRNA表達(dá)譜。例如，WANG等[26]用NGS技術(shù)檢測ESCC患者腫瘤及鄰近正常組織中402個(gè)上調(diào)和741個(gè)下調(diào)的lncRNA。

此外，在腫瘤基因組圖譜(TCGA)的分析中，發(fā)現(xiàn)了食管癌兩種主要組織學(xué)類型之間存在顯著不同分子變化的多種遺傳改變模式。在食管腺癌中，ERBB2、VEGFA、GATA4和GATA6的表達(dá)失?？赡鼙菶SCC更頻繁。相反，在ESCC中，mTOR信號(hào)通路基因PIK3ca/AKT和PTEN、TP63/SOX2擴(kuò)增和Notch1突變的改變更頻繁[27]。TCGA分析可用于ECCS的表達(dá)鑒定和驗(yàn)證其潛在的新的生物標(biāo)志物。

成球能力鑒定是腫瘤干細(xì)胞體外鑒定的一個(gè)重要方法，其測定的是腫瘤細(xì)胞在合適的條件培養(yǎng)基中自我更新的能力，一般使用低黏附的培養(yǎng)板防止細(xì)胞貼壁，結(jié)合使用無血清的培養(yǎng)基(加入B27和合適濃度的生長因子等添加劑，各種腫瘤報(bào)道的不盡相同，需要參考相關(guān)文獻(xiàn))，以及使用1%濃度的甲基纖維素抑制細(xì)胞聚集，以確保一個(gè)細(xì)胞球來源于單個(gè)細(xì)胞等。目前該方法已經(jīng)在多種腫瘤干細(xì)胞的研究中得到應(yīng)用[28]。

通過移植特定的細(xì)胞群，裸鼠腫瘤細(xì)胞移植，是檢測腫瘤干細(xì)胞的啟動(dòng)能力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，也是檢測腫瘤干性的重要實(shí)驗(yàn)[29]。

機(jī)制研究方面，有關(guān)調(diào)節(jié)lncRNA可以通過堿基配對相互作用來調(diào)節(jié)miRNA的活性，這種lncRNA是一種稱為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenouse RNAceRNA)的調(diào)節(jié)模式[30]，有研究表明長非編碼RNAPCAT1是一種新的基于血清的生物標(biāo)志物，通過海綿狀mir-326在食管鱗狀細(xì)胞癌中促進(jìn)細(xì)胞生長[22]。

另一方面，與mRNA相結(jié)合的通路研究也見報(bào)道。信號(hào)通路研究表明，F(xiàn)ΜR1-AS1可與TLR7相結(jié)合，從而維持ESCC干細(xì)胞的特性，并激活下游TLR7/NF-κB信號(hào)，促進(jìn)c-myc的表達(dá)，從而誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞增殖、抗凋亡和侵襲能力。外顯子孵育和共移植試驗(yàn)表明，F(xiàn)ΜR1-AS1外顯子可能從ESCC中分泌，在腫瘤微環(huán)境中將干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)移到非腫瘤干細(xì)胞中[31]。

5 小結(jié)

人類目前對于lncRNA的理解還只是冰山一角，隨著高通量測序等技術(shù)的成熟，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)與研究，包括與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥性等，其中重要的一點(diǎn)便是食管腫瘤干細(xì)胞相關(guān)性研究。腫瘤干細(xì)胞(CSC)的概念是在四十年前提出的，并指出腫瘤生長類似于健康組織的更新，是由少量的特指干細(xì)胞推動(dòng)的。腫瘤干細(xì)胞理論對腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程提出新的理論，這一點(diǎn)已逐漸證實(shí)了許多腫瘤都藏匿著干細(xì)胞，然而腫瘤干細(xì)胞的鑒定和針對腫瘤干細(xì)胞的治療方法等方面還沒有得到證實(shí)。本文總結(jié)了lncRNA在食管癌腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的發(fā)生、發(fā)展及相關(guān)研究方法，闡述了它們在其中的潛在分子機(jī)制。目前，越來越多的lncRNA被確定為包括食管癌在內(nèi)的各種腫瘤的生物標(biāo)志物或潛在治療生物靶點(diǎn)，但人類對于lncRNA與腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)調(diào)控還不清晰，未來應(yīng)當(dāng)加深對lncRNA在腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域潛在機(jī)制的研究，這將有助于發(fā)現(xiàn)食管癌的新型診斷和治療方法。