北柴胡內(nèi)生真菌分離鑒定及其生防促生活性分析

杜衎，高德民，孫燕，馮筱涵，曹海祿，張穎穎

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 山東濟(jì)南 250355；2. 恒德本草(北京)農(nóng)業(yè)科技有限公司，北京 100071；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 山東濟(jì)南 250355)

內(nèi)生真菌普遍存在于植物健康組織中，且顯著影響植物中代謝產(chǎn)物的形成。 內(nèi)生真菌作為生物肥料的重要來源，具有受外界環(huán)境影響小、對宿主防衛(wèi)反應(yīng)耐受度高等優(yōu)點(diǎn)，探索植物和內(nèi)生真菌之間的相互作用是推動農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一種有效策略[1－3]。 近10 年來，超過83 科212 種藥用植物被分離出376 屬以上的內(nèi)生真菌，其中一些內(nèi)生真菌已經(jīng)被利用于植物栽培、生防菌研發(fā)、土壤生態(tài)修復(fù)等[4]。 植物內(nèi)生真菌的生防和促生功能研究已成為一大熱點(diǎn)，Chen 等[5]研究表明，內(nèi)生真菌卷葉毛霉(Mucor circinelloidesDF20)可顯著提高丹參酮生物合成途徑中某些重要酶基因(DXS、DXR、HMGR、GPPS)的表達(dá)水平，促進(jìn)根中丹參酮的生物合成和積累；Schmidt 等[6]發(fā)現(xiàn)混合接種內(nèi)生真菌能顯著促進(jìn)芒草在重金屬污染土壤上的生長；王海霞等[7]從燕麥中分離出的降解淀粉芽孢桿菌對炭疽病防治效果顯著。

北柴胡(Bupleurum chinenseDC.)為《中國藥典》規(guī)定的柴胡基源植物，具有抗癌、抗炎、抗菌等藥理作用，是我國大宗藥材和國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材品種之一[8，9]。 隨著新型冠狀病毒肺炎防治的正?；凸残l(wèi)生要求的提高，北柴胡國內(nèi)外市場需求量和種植面積迅速增加[10]。 根腐病、銹病嚴(yán)重影響北柴胡品質(zhì)與產(chǎn)量[11]。 目前北柴胡病害的防治主要依靠化學(xué)方法，化學(xué)藥劑的長期使用導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題突出。 因此，利用北柴胡有益內(nèi)生真菌發(fā)展北柴胡綠色、標(biāo)準(zhǔn)化栽培具有很大潛力[12]。 目前關(guān)于北柴胡內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及功能菌株的研究未見報道，因此本試驗(yàn)以組織塊分離法對北柴胡內(nèi)生真菌進(jìn)行分離并鑒定，初步分析北柴胡內(nèi)生真菌多樣性，并對內(nèi)生菌株進(jìn)行抑菌活性及促生活性測定，篩選出11 株優(yōu)良菌株并進(jìn)行ITS 分子鑒定，以期為進(jìn)一步研究、開發(fā)與利用北柴胡內(nèi)生菌資源用于生物防治與植物促生研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 北柴胡植株為一年生栽培品成熟期植株，生長地年均日照時數(shù)為2 446.6 h，年均氣溫14.4℃，年均降水量661.7 mm，土壤類型為棕壤土。 于2021 年8 月下旬采自山東中醫(yī)藥大學(xué)百草園(36°33′24.73″N，116°47′50.24″E)，并經(jīng)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心鑒定為北柴胡。 新鮮植株用冰袋低溫保存，在2 h 內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生菌分離試驗(yàn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、阿須貝氏(Ashby)培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基，參考周德慶和徐德強(qiáng)[12]的配制方法；無機(jī)磷、有機(jī)磷與解鉀菌篩選培養(yǎng)基均參考孫玉[13]的方法配制；產(chǎn)葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶活性篩選培養(yǎng)基配制參考李雪艷等[14]的配方。

1.1.3 病原指示菌 大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作為指示細(xì)菌，由山東中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室張穎穎教授提供；層生鐮刀菌(Fusarium proliferatum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusarium solain)作為指示真菌，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫文研究員提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌分離和純化 參考柳靖婷[15]的方法，結(jié)合北柴胡組織特點(diǎn)，采用組織塊分離法對北柴胡內(nèi)生真菌進(jìn)行分離。 主要消毒條件:75%乙醇浸泡(根、莖5 min，葉3 min)及5% NaClO 溶液浸泡(葉5 min，根、莖10 min)。

1.2.2 內(nèi)生真菌鑒定 參考《真菌鑒定手冊》[16]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。 將篩選的菌株純化后，在無菌狀態(tài)下挑取菌絲，置于研缽中用液氮充分研磨菌絲體至粉末狀，采用DNA 提取試劑盒提取菌株DNA，采用引物ITS4－R(5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′)和ITS5－1737F(5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′)擴(kuò)增北柴胡內(nèi)生真菌的5.8S rDNA－ITS 片段，擴(kuò)增體系(50 μL):10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，dNTPs(2 mmol/L)4 μL，正向和反向引物(5 μmol/L)各2 μL，Taq酶(2 U/μL) 1 μL，DNA 模板(10 ng/μL)2 μL，加ddH2O 至50 μL。 委托廣東美格基因科技有限公司進(jìn)行測序，在NCBI 網(wǎng)站的Genbank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，分析內(nèi)生真菌多樣性。 通過MEGA 7.0 軟件中的鄰接法(neighbor－joining methods， NJ)、基于Kimura 2－parameter 距離構(gòu)建抑菌和促生活性菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，并以自展法(bootstrap)進(jìn)行檢測，自展次數(shù)設(shè)為1 000次[17]。

1.2.3 抑菌活性菌株篩選與測試 初篩選參考袁林等[18]的方法進(jìn)行。 北柴胡內(nèi)生真菌對細(xì)菌指示菌的抑菌活性測試采用瓊脂塊法，對真菌指示菌的抑菌活性測試采用平板對峙法。 參考趙龍飛等[19]的方法采用牛津杯法測定初期篩選的活性強(qiáng)的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)物上清液抑制能力，菌株發(fā)酵上清液150 μL 注入牛津杯中，每平板放置3個無菌牛津杯，每菌株設(shè)置3 個重復(fù)。

活性菌株產(chǎn)真菌細(xì)胞壁降解酶能力測試:采用平板透明圈法[14]測試拮抗菌產(chǎn)膠體幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纖維素酶能力，分別將待測菌株瓊脂塊放置4 種酶測試平板上，每處理4 個重復(fù)，以0.1%剛果紅溶液浸漬培養(yǎng)基上表面20 min后沖洗，測量透明圈大小。

1.2.4 促生菌株篩選與測試 IAA 分泌能力菌株篩選:分泌植物生長素(IAA)能力測定所用PC 比色液和S2比色液的配制參考李振東等[20]的方法，北柴胡內(nèi)生真菌分泌IAA 能力的定性測定采用Salkowski 比色法[21]。 PC 比色液顯色則表明該菌液IAA 濃度為低濃度，S2比色液顯色則為高濃度。采用標(biāo)準(zhǔn)品繪制兩組IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測試，第一組濃度梯度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L，第二組濃度梯度為25、50、75、100、125、150 mg/L。 各菌株菌液采用相應(yīng)顯色液顯色，在OD530波長條件下使用紫外－可見光分光光度計(jì)測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線最終確定其IAA分泌量。

溶磷菌株篩選參考王貴生[22]的方法。 在無機(jī)磷篩選平板、有機(jī)磷篩選平板分別接種各待測菌株，觀察是否有溶磷透明圈產(chǎn)生，定性測試陽性菌株。 以鉬銻抗比色法于無機(jī)磷篩選液體培養(yǎng)基和有機(jī)磷篩選液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵液中測定可溶性磷含量。 潛在固氮能力菌株篩選參考Viuar等[23]的方法，于阿須貝氏(Ashby)培養(yǎng)基固體平板接種各待測菌株，觀察菌株是否生長及產(chǎn)生暗白色光暈，采用綜合元素分析儀測定活性菌株于相應(yīng)液體培養(yǎng)基發(fā)酵液中的可溶性氮含量[23]。解鉀能力菌株篩選參考于發(fā)蓮[24]的方法，將待測菌株接種于解鉀固體培養(yǎng)基平板上，采用四苯硼酸鉀重量法測定活性菌株于相應(yīng)液體培養(yǎng)基發(fā)酵液中的可溶性鉀含量。 產(chǎn)鐵載體菌株篩選參考雷平等[25]的方法。

以上篩選試驗(yàn)均做4 個重復(fù)，定量試驗(yàn)待測菌株接種量為0.1 mL(105～106cfu/mL)，培養(yǎng)時間為5 d，以接種無菌PDA 培養(yǎng)基瓊脂塊為空白對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

抑菌率(%)＝(對照菌落生長直徑－處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100；分離率(%)＝分離內(nèi)生真菌數(shù)/組織塊數(shù)×100；分離頻率(%)＝樣本中分離到的某種內(nèi)生真菌數(shù)/分離到的總菌株數(shù)×100；多樣性指數(shù)(H′)＝－ΣPi×lnPi，其中Pi是指特定部位某種真菌的菌株數(shù)占分離到真菌菌株總數(shù)的比值。

采用SPSS 17.0 對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌組織分布

從植株的345 個組織塊中共分離得到270 株菌株，其中從根、莖、葉中分別分離到87、122、61株內(nèi)生真菌，北柴胡內(nèi)生真菌在莖中的分離率(84.14%)與多樣性指數(shù)(1.31)最高(表1)。

表1 植株內(nèi)生真菌分離結(jié)果

結(jié)合形態(tài)學(xué)和顯微特征，270 株菌株共鑒定為17 屬(表2)。 從根中共分離得到10 屬，其中青霉屬(Penicillium)與生赤殼屬(Bionectria)為優(yōu)勢屬，分離頻率分別為9.26%和8.88%；莖中內(nèi)生真菌共12 屬，鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢屬，分離頻率分別為10.37%和10.00%，而根中并未分離得到這兩屬內(nèi)生真菌。葉中共分離到8 屬內(nèi)生真菌，青霉屬(Penicillium)和生赤殼屬(Bionectria)為優(yōu)勢屬，分離頻率分別為8.88%和5.92%。 內(nèi)生真菌與北柴胡組織器官長期共存，共同進(jìn)化形成一種穩(wěn)定的共生關(guān)系，內(nèi)生真菌根、莖、葉分布具有明顯的組織特異性與一定的相似性。

表2 根、莖、葉內(nèi)生真菌屬組成

2.2 抑菌活性菌株篩選

2.2.1 初篩選結(jié)果 結(jié)合北柴胡內(nèi)生真菌形態(tài)與顯微特征，挑選出差異較大的54 株代表性菌株進(jìn)行活性篩選。 結(jié)果表明(表3)，北柴胡內(nèi)生真菌具有抑菌活性的菌株比例較高，有46%的測試菌株對6 種指示菌中至少一種病原指示菌表現(xiàn)出抑菌活性，BCR－097、BCR－098、BCR－458、BCS－428、BCS－500、BCL－009、BCL－449、BCR－427、BCS－420、BCS－591 對5 種及5 種以上指示菌具有抑菌活性，抑菌譜較廣，其中BCS－428 抑菌活性最高，對3 種細(xì)菌指示菌抑菌圈直徑達(dá)到16 mm 以上，對兩種真菌指示菌抑菌率達(dá)到70%以上。

表3 北柴胡內(nèi)生真菌抑菌活性篩選結(jié)果

2.2.2 復(fù)篩選結(jié)果 對初篩試驗(yàn)中具有拮抗作用的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵并通過離心取上清液進(jìn)行抑菌活性測試，結(jié)果表明(表4)，對金黃色葡萄球菌抑菌活性最強(qiáng)的為BCR－458，對大腸桿菌、銅綠假單胞菌及茄病鐮刀菌抑菌活性最強(qiáng)的為BCS－428，對層生鐮刀菌抑菌活性最強(qiáng)的為BCL－449，對尖孢鐮刀菌抑菌活性最強(qiáng)的為BCR－097。

表4 內(nèi)生真菌發(fā)酵液抑菌活性

2.2.3 產(chǎn)真菌細(xì)胞壁降解酶能力測試 對初篩具較高抑菌活性的菌株進(jìn)行產(chǎn)真菌細(xì)胞壁降解酶能力測試，結(jié)果(表5)表明，BCR－097、BCR－098、BCR－458、BCS－420、BCS－500、BCL－009 能夠產(chǎn)生4 種酶，BCR－098 產(chǎn)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶能力最強(qiáng)，BCS－591 產(chǎn)葡聚糖酶能力最強(qiáng)，BCL－449 產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)。

表5 酶解透明圈外徑(mm)

2.3 促生活性菌株篩選

2.3.1 內(nèi)生真菌分泌IAA 能力定性與定量分析通過繪制IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得到IAA 分泌量測定公式為y ＝0.0393x－0.0051(R2＝0.9947)和y ＝0.0224x＋0.0960(R2＝0.9956)。 本試驗(yàn)結(jié)果表明(表6)，在54 株測試菌株中，具有分泌IAA 能力的菌株共有18 株，占總測試北柴胡內(nèi)生菌株的33%，其中11 株合成IAA 為色氨酸途徑，BCS－493 在沒有添加色氨酸和添加色氨酸兩種情況下都發(fā)生了顏色反應(yīng)，證明其可通過兩種途徑合成IAA。 在所有測試菌株中BCS－591、BCS－500 IAA分泌量較高，分別為59.55 mg/L 和76.16 mg/L，具有較高的植物促生研究價值。

圖1 IAA 分泌量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

表6 內(nèi)生真菌IAA 分泌定性與定量篩選結(jié)果

2.3.2 內(nèi)生真菌固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體活性菌株篩選 在54 株待測菌株中，共12 株在解鉀固體平板上產(chǎn)生黃色光暈。 對12 株解鉀活性菌株進(jìn)行定量測試，結(jié)果表明(圖2A)，測試菌株BCR－513 與BCR－098 菌液所產(chǎn)可溶性鉀含量最高，相比空白培養(yǎng)液，增量分別為26.76 mg/L 和20.90 mg/L。 在BCS－420 與BCS－467 菌液培養(yǎng)過程中，顯微鏡發(fā)現(xiàn)兩菌株菌絲能有效吸附鉀長石礦粉顆粒形成真菌－礦物聚集體，產(chǎn)生動態(tài)溶解－吸收過程[26]，當(dāng)菌株吸收量大于溶解量時導(dǎo)致菌液中可溶性鉀含量反而低于空白菌液，這種現(xiàn)象在固氮與溶磷菌株定量測試過程中也被發(fā)現(xiàn)。

圖2 北柴胡內(nèi)生真菌解鉀(A)、固氮(B)、溶磷(C)、產(chǎn)鐵載體(D)活性測定

共9 株測試菌株在阿須貝氏(Ashby)培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生暗色圈，顯示出固氮活性，其BCS－467、BCS－500 與BCL－449 在定量測試過程中菌液可溶性氮含量增加量較高，具有較強(qiáng)的固氮活性，其中BCL－449 增量最高，為111.51 mg/L(圖2B)。

共8 株菌株在無機(jī)磷篩選固體平板和有機(jī)磷篩選固體平板上產(chǎn)生透明圈，BCS－420、BCR－513與BCR－427 在溶解無機(jī)磷活性篩選定量測試中菌液可溶性磷含量增加量較高，具有較強(qiáng)的無機(jī)磷溶解活性，其中BCS－420 較空白培養(yǎng)液增量最大，為55.79 mg/L。 BCR－427、BCR－513、BCS－420、BCL－436 與BCL－449 在溶解有機(jī)磷活性篩選定量測試中菌液可溶性磷含量增量較大，具有較強(qiáng)的有機(jī)磷溶解活性，其中BCR－427 較空白培養(yǎng)液增量最大，為72.18 mg/L(圖2C)。

共10 株待測真菌在CAS 平板上產(chǎn)生橙黃色光暈即噬鐵圈，其中BCS－420、BCL－009、BCL－499 噬鐵圈直徑較大，分別為23.50、24.88 mm 及24.56 mm，具有較高產(chǎn)鐵載體活性(圖2D)。

2.4 分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

綜合抑菌活性及促生活性篩選結(jié)果，將高活性菌株5.8S rDNA－ITS 擴(kuò)增片段在NCBI 網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，主要功能菌株鑒定結(jié)果如表7 所示，挑選出吻合度超過99%的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。 活性菌株根據(jù)組群親緣關(guān)系可以將除去Coprinus arachnoideus及Coprinellus xanthothrix剩余的菌株分成3 個種群，自檢支持率分別為30%、81%和54%。

圖3 基于5.8S rDNA－ITS 序列由鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表7 主要功能菌株鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

內(nèi)生真菌一般存在于藥用植物組織和器官中，具有產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)劑類物質(zhì)、提高宿主植物生理活性和抗逆性等功能，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[27]。 本研究從大田栽培北柴胡根、莖、葉中分離得到270 株內(nèi)生真菌，青霉屬(Penicillium)與生赤殼屬(Bionectria)為根、葉部內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬，鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為莖部內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬，這與野生柴胡內(nèi)生真菌根、莖、葉內(nèi)生真菌分布具有一定的差異性[28]。

內(nèi)生真菌分布不僅受宿主種類的影響，表現(xiàn)出宿主的特異性和組織的特異性，還受宿主植物生長環(huán)境、生長年限、生長階段等因素的影響[29，30]。 如石斛內(nèi)生真菌豐富度隨石斛生長年限的增加而增加，不同地區(qū)的丹參內(nèi)生真菌群落具有顯著差異[31，32]；單葉蔓荊在沿海地區(qū)內(nèi)生真菌腐生菌豐富度較大，這種變化能促進(jìn)宿主在沙子掩埋期間增加營養(yǎng)吸收[33]；Martin 等[34]發(fā)現(xiàn)從自然發(fā)生病害的植物系統(tǒng)中更容易發(fā)現(xiàn)有效生防與促生作用菌株；內(nèi)生真菌與宿主植物屬于長期協(xié)同進(jìn)化的共生關(guān)系，當(dāng)宿主植物受到環(huán)境應(yīng)激時，釋放信號類似物可吸引某種微生物。 在制備內(nèi)生真菌分離菌株材料時，可以以目標(biāo)活性為導(dǎo)向選擇或制造特定的應(yīng)激環(huán)境。

北柴胡栽培生長過程中易感染多種疾病，尤以根腐病最為嚴(yán)重[35]。 研究發(fā)現(xiàn)非致病性的尖孢鐮刀菌是天然真菌拮抗劑，也是潛在的生物防治劑，其釋放的揮發(fā)性物質(zhì)β－Caryophyllene 經(jīng)研究證明具有促進(jìn)植物生長的作用[36，37]。 茄腐鐮刀菌代謝產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)是發(fā)揮抑菌性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，接種茄腐鐮刀菌的番茄對病原微生物的防御作用明顯增強(qiáng)[38，39]，其發(fā)酵產(chǎn)物具有作為生物技術(shù)應(yīng)用的拮抗劑和抗菌劑的潛力。 本研究中BCR－097(茄腐鐮刀菌)表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性，BCS－591(尖孢鐮刀菌)則同時表現(xiàn)出較強(qiáng)的IAA分泌活性，這與以上研究存在相同點(diǎn)。

產(chǎn)生IAA 等植物生長激素和促進(jìn)植物對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收是內(nèi)生真菌促進(jìn)植物生長主要作用方式[40]。 深綠木霉與哈茨木霉已被證明除生防作用外也具有較高促生活性，被廣泛用于生物菌肥的開發(fā)[41]，但作為北柴胡內(nèi)生菌，哈茨木霉與深綠木霉與北柴胡之間的作用機(jī)制仍值得進(jìn)一步探索。 本研究中BCS－500(草酸青霉)、BCR－513(嗜松籃狀菌)、BCR－098(輻毛小鬼傘菌)等表現(xiàn)出較強(qiáng)的促生活性。 有研究證明草酸青霉可顯著提高水稻的抗旱能力[42]。 嗜松籃狀菌具有產(chǎn)生β－葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、鐵載體及吲哚乙酸等活性，是近年來除木霉屬真菌可用作生物增強(qiáng)劑的新型真菌[43]。 研究證明Coprinellus radians可有效降解鄰苯二甲酸二丁酯及鄰苯二甲酸二辛酯，可對污染土壤進(jìn)行修復(fù)[44]。 綜上，開發(fā)本研究中內(nèi)生真菌用于北柴胡生物菌肥具有巨大潛力。

目前植物內(nèi)生真菌用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)仍面臨諸多挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在微生物接種劑持久性短、適用面窄、波動性大等，而栽培管理措施、土壤條件、本土微生物菌落的拮抗作用都會對微生物接種劑效果產(chǎn)生影響[45]。 下一步應(yīng)加強(qiáng)待開發(fā)菌株宿主相關(guān)昆蟲影響的研究、組合不同優(yōu)良菌株等措施進(jìn)一步提高菌株開發(fā)水平和田間作用效果。