• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    2株煙草根際芽孢桿菌的分子鑒定及抗菌促生作用

    2021-12-09 17:07:22曹毅李娟曾隕濤陸寧楊冬梅商勝華
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2021年21期
    關鍵詞:芽孢桿菌抑菌活性煙草

    曹毅 李娟 曾隕濤 陸寧 楊冬梅 商勝華

    摘要:為探究分離自煙草根際的2株芽孢桿菌的種類及其抑菌促生特性,利用16S rDNA和gyrB基因序列分析法,將菌株YC2006和YC2008分別鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株對煙草赤星病病原(Alternaria alternata)、煙草黑脛病病原(Phytophthora parasitica)和煙草立枯?。≧hizoctonia solani) 病原均具有明顯的抑制作用,對煙草立枯病病原的抑制率分別達到60.35%和68.08%。菌液浸種處理可顯著提高煙草種子發(fā)芽勢,在育苗基質(zhì)中添加菌劑可顯著提高煙苗的株高、莖圍、最大葉面積、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、總根長和總根表面積。2株芽孢桿菌對煙草主要真菌病原具有拮抗活性,同時兼具促進種子萌發(fā)和煙苗生長的作用,具有良好的研究開發(fā)應用前景。

    關鍵詞:芽孢桿菌;煙草;gyrB基因;抑菌活性;促生作用

    中圖分類號:S182;S572.01 ??文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2021)21-0241-06

    收稿日期:2021-03-05

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31660544);中國煙草總公司貴州省公司項目(編號:201603、2021XM12)。

    作者簡介:曹 毅(1982—),男,云南會澤人,博士,副研究員,從事微生物和植物保護研究。E-mail:yicao1001@163.com。

    煙草(Nicotiana tabacum L.)是我國廣泛種植的重要茄科經(jīng)濟作物,煙草病害嚴重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量,常年造成的平均產(chǎn)量損失達10%左右[1],一直是制約煙草生產(chǎn)的主要因素之一,而隨著氣候、耕作制度和栽培方式的變化,煙草病原種類及其危害程度呈增加和上升趨勢。長期以來,作物病害主要依賴化學藥劑,由此導致的藥害[2]、農(nóng)藥殘留、病原耐/抗藥性、生態(tài)環(huán)境影響等問題逐年凸顯,利用微生物制劑或其他環(huán)境友好措施控制作物病害受到各方廣泛關注。在各類生防微生物資源中,芽孢桿菌由于種類多樣、遺傳穩(wěn)定、環(huán)境抗逆性強[3],可通過改善植物營養(yǎng)物質(zhì)吸收、產(chǎn)生激素、誘導抗性和抑制病原生長等方式直接或間接促進植物生長、防治病害[4],國內(nèi)外研究者利用芽孢桿菌已開發(fā)出多種對植物病原具有防治效果的生物菌劑[5],并在作物病害防治中不斷發(fā)展和應用[6]。

    利用微生物防治作物病害雖已取得較大的進展,但在實際生產(chǎn)實踐中,由于外源生防菌在目標作物根系中定殖力低、土壤抑菌作用、施用成本等因素的影響,生防制劑往往防效低且不穩(wěn)定,篩選根際定殖能力強的菌株資源并研究適合作物生產(chǎn)特點的施用方法對提高生防菌劑施用效果具有重要意義。前人研究表明,利用有益微生物處理煙草種子,可明顯提高種子發(fā)芽勢、生長勢和種子活力,促進煙苗生長,增加其抗逆和抗病性[7];微生物添加進育苗基質(zhì)中,可改善其結構與理化性質(zhì)[8],提高養(yǎng)分供應能力,進而促進植物生長[9];同時,菌劑可在植物幼苗根部優(yōu)先形成“生物屏障”[10],維持根際微生物群落平衡并抵御病原攻擊[11-12]。煙草育苗集約化程度高,在種子萌發(fā)、育苗階段使用微生物菌劑具有經(jīng)濟和高效的特點,規(guī)模化推廣應用潛力大。目前,針對煙草和煙葉生產(chǎn)特點開發(fā)的微生物菌劑較少,以高效土著菌株為核心的煙用菌劑及配套使用技術仍較缺乏。

    本研究以前期分離獲得的2株煙草根際芽孢桿菌YC2006和YC2008為材料,采用16S rDNA和gyrB基因(DNA促旋酶B亞單位基因)序列分析法對菌株進行鑒定,通過室內(nèi)和溫室試驗評估2株芽孢桿菌的抗菌和促生能力,以期為煙草抗病促生菌劑的開發(fā)應用提供支撐。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株、培養(yǎng)基和煙草品種

    試驗所用煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、煙草立枯病菌(Rhizoctonia solani)、芽孢桿菌YC2006和YC2008均由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室分離并保存,LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基分別用于芽孢桿菌的活化和病原真菌培養(yǎng),試驗用煙草品種為K326,對照為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(云南星耀生物制品有限公司提供)。

    1.2 主要真菌病原拮抗活性測定

    用平板對峙培養(yǎng)法測定經(jīng)活化的YC2006和YC2008對煙草黑脛病、赤星病菌和立枯病等主要真菌病害病原菌的拮抗活性,挑取經(jīng)LB平板活化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,搖床振蕩培養(yǎng)(28 ℃、180 r/min)2 d得到培養(yǎng)液,吸取50 μL培養(yǎng)液緩慢滴入無菌空白濾紙片(索萊寶)中,于PDA平板中接入直徑6 mm 新鮮培養(yǎng)的病原菌菌餅,距菌餅約2.5 cm處等距放入含菌濾紙片,以未接菌的LB培養(yǎng)液為對照,3次重復,28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5~7 d后,測量病原菌菌落直徑,計算抑制率:

    抑制率=(1-接種處理病原菌菌落直徑/不接種處理病原菌菌落直徑)×100%。

    1.3 菌株gyrB基因和16S rDNA序列分析

    菌株基因組DNA采用試劑盒(DNeasy UltraClean Microbial Kit,Qiagen)并按說明書方法提取,引物由上海英駿生物技術有限公司合成:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),UP-1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)/UP-2r(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′),分別用于菌株16S rDNA 和gyrB基因[13]的擴增;PCR擴增體系為50 μL(GoTaqTM Green Master Mix 25 μL、27F/UP-1 1 μL、1492R/UP-2r 1 μL、模板 5 μL、無核酸酶去離子水18 μL)。16S rDNA基因擴增程序為:94 ℃預變性 4 min;94 ℃變性30 s,65 ℃ 退火40 s,72 ℃延伸90 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸 10 min;gyrB擴增條件:94 ℃預變性 4 min;94 ℃ 變性 1 min,60 ℃退火 1 min,72 ℃延伸 2 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序,利用中間引物UP-1s(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′)和UP-2rs(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′)測通gyrB基因全長,測序拼接序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對,下載同源性在99%以上的序列,利用Mega X軟件包進行多重序列比對,采用鄰接法(Neighbor-Joining,Bootstrap value=1 000)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.4 煙草種子萌發(fā)相關指標測定

    取活化的菌株,接入種子培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h后,制得種子液;以5% 接種量將種子液接種到2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃條件下發(fā)酵48 h,將菌株發(fā)酵液與適量CaCO3混合,噴霧干燥后獲得初制菌劑。利用平板稀釋法[14]測定含菌量,菌液YC2006和YC2008的濃度分別約為4.04×1010 CFU/mL和1.83×1011 CFU/mL。將菌液濃度與對照商品化菌劑濃度調(diào)至1×109 CFU/mL,備用。

    選取煙草種子(K326)放于試驗設置的菌劑溶液中浸種2 h,分別以清水和商品化枯草芽孢桿菌可濕性粉劑為對照,共11個處理(表1);浸種后,種子置于鋪有滅菌濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中,加入滅菌清水保濕,每皿放置30粒種子,每個處理重復3次。25 ℃、光照16 h/d的人工氣候室培養(yǎng),從種子置床之日起每天定時(早:09:00,晚:18:00)開蓋通氣2次,加入滅菌清水,保證發(fā)芽床濕潤。萌發(fā)指標以種子露白為準。種子萌發(fā)后逐日記錄發(fā)芽數(shù)量,共記錄10 d,測定并計算種子萌發(fā)指標。

    發(fā)芽率=(萌發(fā)結束時已發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

    發(fā)芽勢:從種子置于培養(yǎng)箱開始至第3天,統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)占供試種子總數(shù)的百分率。

    1.5 煙草幼苗農(nóng)藝性狀測定

    在前期試驗基礎上,設5個處理組,處理A:每100 g育苗基質(zhì)中拌入0.5 g枯草芽孢桿菌YC2006;處理B:每100 g育苗基質(zhì)中拌入2 g解淀粉芽孢桿菌YC2008;處理C:每100 g常規(guī)育苗基質(zhì)中拌入1 ∶1(質(zhì)量比)的1 g芽孢桿菌YC2006、YC2008;處理D:空白對照,育苗基質(zhì)中不拌入芽孢桿菌(CK1);處理E:每100 g育苗基質(zhì)中拌入0.5 g商品化枯草芽孢桿菌(CK2)。將種子分別播于試驗設置的不同基質(zhì)中,放置于人工氣候室培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境設為溫度25 ℃/18 ℃(晝/夜),光照16 h/d,相對濕度75%。播種45 d后,參照標準YC/T 142—2010[15],對煙苗株高、莖圍、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量及最大葉面積等指標進行測定,根系指標采用根系掃描儀(型號:EPSON 1680)及其配套的WinRhizo Pro 5.0根系分析軟件測定[16]。

    1.6 統(tǒng)計分析

    采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

    2 結果與分析

    2.1 菌株對主要煙草病原真菌的室內(nèi)拮抗活性的影響

    平板對峙試驗結果表明(表2),YC2006和YC2008菌株對病原菌菌絲的生長具有抑制作用,對2種病原菌的抑制率達45%以上,芽孢桿菌YC2006和YC2008對煙草立枯絲核菌的抑制率最為明顯,分別達60.35%和68.08%;其次為赤星病菌(鏈格孢菌)和黑脛病菌(煙草疫霉)(圖1)。

    2.2 菌株16S rDNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

    菌株YC2006和YC2008的16S rDNA基因測序結果經(jīng)序列拼接后,長度分別為1 420 bp和 1 410 bp,采用 NJ 法分別構建2株菌的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹,結果見圖2和圖3。從16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹看,菌株YC2006和YC2008與臨近的幾株芽孢桿菌親緣關系較為接近,初步將YC2006和YC2008歸為芽孢桿菌屬。

    菌株YC2006的gyrB基因測序結果拼接后獲得1 160 bp長度的序列,與GenBank 中已報道的多株枯草芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高,序列相似性均達99.5%以上,采用 NJ 法構建基于gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),從gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析,菌株YC2006與枯草芽孢桿菌G2菌株聚為一支,有較近的親緣關系,可信度97%,結合16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,將YC2006鑒定為枯草芽孢桿菌(B. subtilis);同樣的方法,菌株YC2008的gyrB基因(1 170 bp)與多株解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高,序列相似性均達99%以上,系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)表明菌株YC2008與解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens,AB829604)聚為一簇,有較近的親緣關系,結合16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,將YC2008鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

    2.3 菌株對煙草種子萌發(fā)的影響

    室內(nèi)種子發(fā)芽試驗結果(表3)顯示,種子經(jīng)不同濃度的芽孢桿菌液浸泡處理后,YC2006 0.5%處理發(fā)芽率顯著高于對照制劑;各處理發(fā)芽勢顯著提高,表明本試驗菌劑處理可加快煙草種子的萌發(fā)進程,煙草出苗快而整齊。

    2.4 菌株對煙草幼苗農(nóng)藝性狀的影響

    由表4可知,處理A、B、C對煙草株高有促生作用,分別比清水對照提高了188%、103%、30%;各處理間莖圍無顯著差異,最大葉面積比對照提高了101.30%、36.46%、0.84%,處理A、B地上部鮮質(zhì)量分別比對照提高了85.14%、40.09%;各處理地下部鮮質(zhì)量分別比對照提高了136.36%、203.03%、69.70%。

    由表5可知,處理A的平均根系直徑、總根體積與對照相比差異顯著,總根長和總根表面積均顯著高于對照,與無菌清水對照相比,分別提高了41.75%和38.95%。經(jīng)0.5% YC2006處理過的煙苗根長和根系表面積均高于對照,根系更為發(fā)達。

    3 結論與討論

    16S rDNA基因序列因其高度的保守性而被廣泛用于細菌分子鑒定,但對近緣種常常難以區(qū)分鑒別。gyrB基因存在于所有細菌中,其分子進化速率大于16S rDNA基因,且不同種細菌的gyrB基因存在較大差異,常作為用芽孢桿菌種水平鑒定的靶標基因[17],本研究同時根據(jù)16S rDNA和gyrB序列和系統(tǒng)發(fā)育分析結果,將菌株YC2006和YC2008初步鑒定為枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)。煙草立枯病、黑脛病和赤星病是當前煙草育苗和大田生長期的主要真菌性病害,本研究對菌株抑菌活性測試發(fā)現(xiàn),菌株YC2006和YC2008對供試的3種病原菌均有不同程度的抑制活性,抑制活性強度以立枯病病原最為明顯,煙草大田期靶斑病病原與立枯病病原屬同種不同融合群,推測本試驗菌株也可抑制煙草靶斑病病原,菌株抑菌譜等相關試驗有待進一步開展,以明確其抗病應用范圍。室內(nèi)種子萌發(fā)試驗和溫室幼苗盆栽試驗結果顯示,高濃度的菌株對煙草種子萌發(fā)和幼苗生長有抑制現(xiàn)象,與楊曉云等發(fā)現(xiàn)高濃度解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液對番茄種子萌發(fā)和幼苗植株生長有抑制作用結果相似,表明在實際應用中明確生防菌株濃度施用范圍十分重要,同時還需對加工工藝、劑型等下游技術開展研究,以便更好地發(fā)揮出生防菌的生防作用[18]。

    微生物促進植物生長一般可歸納為:一是通過其生長繁殖及代謝活動產(chǎn)物,促進土壤養(yǎng)分合成、分解與轉(zhuǎn)化,供植物生長利用,如芽孢桿菌代謝產(chǎn)生生長激素等促進植物吸收水分和養(yǎng)分物質(zhì),直接促進植物生長[19];二是通過營養(yǎng)競爭、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制有害微生物的生長,維持根系微生態(tài)平衡,減少病原菌的侵染而間接促進植物生長。吳亞勝等研究發(fā)現(xiàn),在育苗基質(zhì)中添加叢枝菌根真菌,菌根侵染率明顯提高,對辣椒幼苗的生長表現(xiàn)出顯著的促進作用[20];多黏類芽孢桿菌CF05發(fā)酵液對番茄幼苗有明顯的促生效果,鮮質(zhì)量增加272.0%,干質(zhì)量增加266.7%[21]。本研究在育苗基質(zhì)中添加枯草芽孢桿菌YC2006、解淀粉芽孢桿菌YC2008表現(xiàn)出了顯著的煙苗促生活性,添加0.5% YC2006,煙苗株高、最大葉面積、地上/地下部鮮質(zhì)量、總根長和總根表面積較商品化的枯草芽孢桿菌菌劑分別提高了149.44%、62.1%、60.55%、39.29%、71.60% 和 70.15%,菌株促生機理值得進一步研究。生防菌施用后,穩(wěn)定的定殖能力是其發(fā)揮生防、促生作用的關鍵因素[22],本試驗菌株為煙草根際分離所得,可能更適合在根際定殖并發(fā)揮作用,菌株YC2006和YC2008可通過拌種、基質(zhì)添加等使用方式促進煙草生長,同時,菌株對煙草主要真菌病原具有明顯的抑制作用,可作為優(yōu)良的菌種材料用于煙草專用微生物種衣劑、微生物菌劑和菌肥的開發(fā)。

    參考文獻:

    [1]朱賢朝.中國煙草病害[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002.

    [2]Tunsagool P,Leelasuphakul W,Jaresitthikunchai J,et al. Targeted transcriptional and proteomic studies explicate specific roles of Bacillus subtilis iturin A,fengycin,and surfactin on elicitation of defensive systems in mandarin fruit during stress[J]. PLoS One,2019,14(5):e0217202.

    [3]千慧敏,趙 輝,劉新濤,等. 生防細菌PA2101和PG3402抑菌和促生特性的研究[J]. 中國生物防治學報,2020,36(1):135-144.

    [4]Wagi S,Ahmed A. Bacillus spp.:potent microfactories of bacterial IAA[J]. PeerJ,2019,7:e7258.

    [5]荊卓瓊,郭致杰,徐生軍,等. 解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3的篩選鑒定及其防治番茄灰霉病效果的評價[J]. 草業(yè)學報,2020,29(2):31-41.

    [6]Pandey C,Bajpai V K,Negi Y K,et al. Effect of plant growth promoting Bacillus spp. on nutritional properties of Amaranthus hypochondriacus grains[J]. Saudi Journal of Biological Sciences,2018,25(6):1066-1071.

    [7]Aydinogˇlu B,Shabani A,Safavi S M. Impact of priming on seed germination,seedling growth and gene expression in common vetch under salinity stress[J]. Cellular and Molecular Biology,2019,65(3):18-24.

    [8]侯樂梅,孟瑞青,乜蘭春,等. 不同微生物菌劑對基質(zhì)酶活性和番茄產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J]. 應用生態(tài)學報,2016,27(8):2520-2526.

    [9]呂偉生,黃國強,邵正英,等. 接種菌劑腐熟稻草育秧基質(zhì)提高機插稻秧苗素質(zhì)及產(chǎn)量[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報,2017,33(11):195-202.

    [10]張明宇,劉高峰,李小龍,等. 施用生物有機肥對煙草根際土壤微生物區(qū)系的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報,2020,54(2):317-325.

    [11]Asari S,Tarkowská D,Rolcˇík J,et al. Analysis of plant growth-promoting properties of Bacillus amyloliquefaciens UCMB5113 using Arabidopsis thaliana as host plant[J]. Planta,2017,245(1):15-30.

    [12]Asari S,Matzén S,Petersen M,et al. Multiple effects of Bacillus amyloliquefaciens volatile compounds:plant growth promotion and growth inhibition of phytopathogens[J]. FEMS Microbiology Ecology,2016,92(6):fiw070.

    [13]Yamamoto S,Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains[J]. Applied and Environmental Microbiology,1995,61(3):1104-1109.

    [14]豆雅楠,牛世全,豆建濤,等. 芽孢桿菌拮抗蘋果樹腐爛病菌的篩選、鑒定及抑菌活性初探[J]. 微生物學通報,2018,45(12):2684-2694.

    [15]國家煙草專賣局.煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法:YC/T 142—2010[S]. 北京:中國標準出版社,2010.

    [16]王亞男,程立娟,周啟星.鳶尾對石油烴污染土壤的修復以及根

    系代謝分析[J]. 環(huán)境科學,2016,37(4):1531-1538.

    [17]賈慧慧,謝心悅,潘園園,等. 芽胞桿菌BJ-6的鑒定及對甜瓜細菌性果斑病的防治[J]. 微生物學報,2020,60(5):982-991.

    [18]楊曉云,陳志誼,蔣盼盼,等. 解淀粉芽孢桿菌B1619對番茄的促生作用[J]. 中國生物防治學報,2016,32(3):349-356.

    [19]張榮勝,戴秀華,劉永鋒,等. 解淀粉芽孢桿菌Lx-11的促水稻生長作用及促生長物質(zhì)分析[J]. 核農(nóng)學報,2018,32(6):1230-1238.

    [20]吳亞勝,王其傳,祁紅英,等. 育苗基質(zhì)中添加叢枝菌根真菌菌劑對辣椒幼苗生長和光合參數(shù)的影響[J]. 蔬菜,2018(7):12-16.

    [21]郭芳芳,謝 鎮(zhèn),盧 鵬,等. 一株多粘類芽孢桿菌的鑒定及其生防促生效果初步測定[J]. 中國生物防治學報,2014,30(4):489-496.

    [22]Martins S J,Medeiros F,Lakshmanan V,et al. Impact of seed exudates on growth and biofilm formation of bacillus amyloliquefaciens ALB629 in common bean[J]. Frontiers in Microbiology,2017,8:2631.

    猜你喜歡
    芽孢桿菌抑菌活性煙草
    煙草具有輻射性?
    兩株芽孢桿菌的生長特性及其對仿刺參的益生作用
    煙草依賴的診斷標準
    一株放線菌藍色素的提取及相關研究
    一株植物內(nèi)生放線菌次級代謝產(chǎn)物的提取及抑菌活性研究
    科技視界(2016年11期)2016-05-23 17:09:25
    煙草中茄酮的富集和應用
    生防芽孢桿菌的研究進展
    斷奶幼兔日糧中添加Tu—569菌劑對其生長性能及腸道微生物區(qū)系的影響
    櫻桃流膠病拮抗內(nèi)生細菌的篩選與初步鑒定
    魁蚶蛋白胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑菌活性
    亚洲av一区综合| 国产成人一区二区在线| 日本-黄色视频高清免费观看| av免费观看日本| 国国产精品蜜臀av免费| 精品人妻熟女av久视频| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 美女国产视频在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品伦人一区二区| 黄色一级大片看看| 日本wwww免费看| 国产精品女同一区二区软件| 青春草国产在线视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 插逼视频在线观看| 久久久久久久久大av| 久久韩国三级中文字幕| 国产在线一区二区三区精| 九草在线视频观看| 精品人妻视频免费看| 国产高清国产精品国产三级 | 国产精品人妻久久久影院| 国产精品久久久久久av不卡| av黄色大香蕉| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日韩大片免费观看网站| 婷婷色综合www| 又爽又黄a免费视频| 亚洲成色77777| 久久久久精品久久久久真实原创| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 五月玫瑰六月丁香| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲图色成人| 老司机影院毛片| 精品国产三级普通话版| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日日啪夜夜爽| 大话2 男鬼变身卡| 久久精品综合一区二区三区| 三级国产精品片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费看a级黄色片| 国产精品精品国产色婷婷| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美+日韩+精品| 91aial.com中文字幕在线观看| or卡值多少钱| 极品教师在线视频| 在线a可以看的网站| 婷婷六月久久综合丁香| 成人无遮挡网站| 日日啪夜夜爽| 国产高潮美女av| 欧美精品国产亚洲| 久99久视频精品免费| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品一区二区性色av| 777米奇影视久久| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品一区二区性色av| 免费电影在线观看免费观看| 插阴视频在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 色视频www国产| 亚洲,欧美,日韩| 久久国产乱子免费精品| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 99久久人妻综合| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 婷婷色综合大香蕉| 久久久久九九精品影院| 国产在线男女| 欧美日韩精品成人综合77777| 日日摸夜夜添夜夜爱| 高清毛片免费看| 国产精品一区二区在线观看99 | 久久草成人影院| 日韩国内少妇激情av| av国产免费在线观看| 欧美激情在线99| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av福利片在线观看| 国产成人91sexporn| 国产高清有码在线观看视频| av女优亚洲男人天堂| 久久这里有精品视频免费| 久久鲁丝午夜福利片| 久久99精品国语久久久| 好男人视频免费观看在线| 日韩欧美国产在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 久久精品久久精品一区二区三区| av黄色大香蕉| freevideosex欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 美女黄网站色视频| 一本一本综合久久| 99久久精品一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 久久精品国产自在天天线| 日韩制服骚丝袜av| 男女下面进入的视频免费午夜| 人人妻人人看人人澡| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品久久久久久av不卡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 联通29元200g的流量卡| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品无大码| 国产成人福利小说| 好男人视频免费观看在线| 日本黄色片子视频| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲av二区三区四区| 国产精品国产三级专区第一集| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 六月丁香七月| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人一区二区在线| 日韩欧美三级三区| 国产69精品久久久久777片| 国产成人精品福利久久| 精品午夜福利在线看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美人与善性xxx| 日韩精品有码人妻一区| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 禁无遮挡网站| 欧美人与善性xxx| 久久久成人免费电影| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲第一区二区三区不卡| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产av码专区亚洲av| 少妇的逼好多水| 干丝袜人妻中文字幕| 成年版毛片免费区| av一本久久久久| 晚上一个人看的免费电影| 人体艺术视频欧美日本| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久久久久大尺度免费视频| 最近中文字幕2019免费版| 高清av免费在线| 亚洲成人一二三区av| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久国产一区二区| 欧美丝袜亚洲另类| 99视频精品全部免费 在线| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美性感艳星| 国产精品久久久久久久久免| 成年av动漫网址| 97热精品久久久久久| 99热6这里只有精品| 成人一区二区视频在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 综合色av麻豆| 男人狂女人下面高潮的视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 天堂影院成人在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 五月伊人婷婷丁香| 精品久久久久久久久av| 亚洲成人久久爱视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲av成人av| 亚洲国产色片| 国产成人精品一,二区| 91久久精品电影网| 国产成人福利小说| 美女cb高潮喷水在线观看| 99热这里只有精品一区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 99久久人妻综合| 免费av不卡在线播放| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 最近中文字幕2019免费版| 我的女老师完整版在线观看| 婷婷色综合www| 国产 一区 欧美 日韩| 九草在线视频观看| 看非洲黑人一级黄片| 最后的刺客免费高清国语| 一级爰片在线观看| 国产黄色免费在线视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| videos熟女内射| 国产爱豆传媒在线观看| 一个人免费在线观看电影| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成年女人看的毛片在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 美女高潮的动态| av天堂中文字幕网| 亚洲av成人av| 少妇熟女欧美另类| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 最后的刺客免费高清国语| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产亚洲最大av| 超碰97精品在线观看| 精品酒店卫生间| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 在线 av 中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜福利在线在线| 亚洲av福利一区| 国产片特级美女逼逼视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 一级二级三级毛片免费看| 国产精品一区www在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 成人二区视频| av在线亚洲专区| 免费观看a级毛片全部| 国产黄片视频在线免费观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 黄片wwwwww| 天天躁日日操中文字幕| 天堂网av新在线| 中文字幕av成人在线电影| 久久精品综合一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产午夜精品论理片| 国产真实伦视频高清在线观看| 丝袜美腿在线中文| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产有黄有色有爽视频| 又大又黄又爽视频免费| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲人成网站高清观看| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av.av天堂| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 97超碰精品成人国产| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产综合精华液| 久久久久久久国产电影| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品熟女久久久久浪| a级一级毛片免费在线观看| 91av网一区二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产在线一区二区三区精| 欧美区成人在线视频| 热99在线观看视频| 亚洲国产色片| 日本熟妇午夜| 精品久久久久久电影网| 国模一区二区三区四区视频| 色尼玛亚洲综合影院| 女人久久www免费人成看片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 男人和女人高潮做爰伦理| 99久久精品一区二区三区| freevideosex欧美| 亚洲国产欧美人成| 亚洲精品第二区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 一级二级三级毛片免费看| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产高清三级在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 又爽又黄无遮挡网站| 麻豆成人av视频| 国产黄色免费在线视频| 91久久精品国产一区二区成人| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩欧美国产在线观看| 色5月婷婷丁香| 日本-黄色视频高清免费观看| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲最大成人手机在线| 中文资源天堂在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成年人午夜在线观看视频 | 久久久久久久久久成人| av免费观看日本| 亚洲高清免费不卡视频| 国产成人a区在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 一边亲一边摸免费视频| 春色校园在线视频观看| 国产在视频线在精品| 国产免费一级a男人的天堂| 少妇的逼好多水| 久久精品国产亚洲网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲av成人av| 亚洲精品456在线播放app| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美性感艳星| 中文在线观看免费www的网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 青青草视频在线视频观看| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品国产av成人精品| 国产色婷婷99| 亚洲av中文av极速乱| 国产黄片视频在线免费观看| 国产高清三级在线| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av免费高清在线观看| 高清视频免费观看一区二区 | 成人鲁丝片一二三区免费| 大香蕉久久网| 日韩欧美三级三区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美最新免费一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品一区www在线观看| av在线亚洲专区| 国产精品久久久久久精品电影| 日本欧美国产在线视频| 看免费成人av毛片| 在线免费观看的www视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费观看在线日韩| 青春草亚洲视频在线观看| 日日啪夜夜爽| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美高清成人免费视频www| av免费观看日本| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩欧美一区视频在线观看 | 免费av毛片视频| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美激情久久久久久爽电影| av又黄又爽大尺度在线免费看| 乱系列少妇在线播放| 国产午夜精品论理片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久97久久精品| 又爽又黄a免费视频| 精品一区二区三区人妻视频| av在线播放精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品.久久久| 精品午夜福利在线看| 一区二区三区乱码不卡18| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日韩大片免费观看网站| 国产视频内射| 特级一级黄色大片| xxx大片免费视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 边亲边吃奶的免费视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 午夜视频国产福利| 亚洲综合色惰| 亚洲av电影不卡..在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一级毛片我不卡| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜激情福利司机影院| 国产熟女欧美一区二区| 丝袜美腿在线中文| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 在线免费观看的www视频| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜福利高清视频| 国产成人a∨麻豆精品| 免费av观看视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 成人亚洲精品av一区二区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 老司机影院成人| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美一区二区亚洲| 日本一本二区三区精品| 日韩伦理黄色片| 久久99热6这里只有精品| 91久久精品电影网| 精品久久久精品久久久| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久人人爽人人爽人人片va| 中文字幕免费在线视频6| 国产爱豆传媒在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产欧美日韩精品一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品伦人一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 国内精品宾馆在线| 成年版毛片免费区| 午夜激情久久久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产高清不卡午夜福利| 18禁在线播放成人免费| 黄色欧美视频在线观看| 99久久精品热视频| 99久国产av精品| 永久免费av网站大全| 成人无遮挡网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产成人精品久久久久久| 青春草亚洲视频在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产成年人精品一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| av免费观看日本| 在现免费观看毛片| 91狼人影院| 日韩三级伦理在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 伦精品一区二区三区| 亚洲最大成人av| 中国美白少妇内射xxxbb| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲av.av天堂| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲成人av在线免费| 国产视频首页在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲国产最新在线播放| 久久久久久久久久久免费av| 日韩三级伦理在线观看| 如何舔出高潮| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 毛片女人毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 中国国产av一级| 赤兔流量卡办理| 综合色av麻豆| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产av不卡久久| 国产在视频线在精品| 五月伊人婷婷丁香| 超碰97精品在线观看| 国产精品无大码| 欧美3d第一页| 深夜a级毛片| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品日韩av片在线观看| 简卡轻食公司| 国产午夜福利久久久久久| 成人无遮挡网站| 免费无遮挡裸体视频| 日韩av在线大香蕉| 精品酒店卫生间| av一本久久久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩欧美精品v在线| 成人av在线播放网站| 中文资源天堂在线| 国产不卡一卡二| 国产成人aa在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 我要看日韩黄色一级片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一区二区三区高清视频在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲在线观看片| 久久这里只有精品中国| 一级黄片播放器| 国产有黄有色有爽视频| av卡一久久| 人人妻人人看人人澡| 国产成人免费观看mmmm| 午夜激情欧美在线| 亚洲电影在线观看av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 黄色配什么色好看| 18禁在线播放成人免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产 亚洲一区二区三区 | 欧美激情在线99| 欧美人与善性xxx| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 好男人在线观看高清免费视频| 国产老妇女一区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄色配什么色好看| 久久6这里有精品| 精品酒店卫生间| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产一级毛片在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久精品夜色国产| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日韩在线高清观看一区二区三区| 少妇的逼好多水| 丝袜喷水一区| 美女国产视频在线观看| 国产91av在线免费观看| 日韩精品青青久久久久久| 午夜精品在线福利| av.在线天堂| av国产久精品久网站免费入址| 免费无遮挡裸体视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产淫语在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产精品一及| 99热这里只有是精品50| 精品午夜福利在线看| 午夜精品一区二区三区免费看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲在线观看片| 免费电影在线观看免费观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久精品免费免费高清| xxx大片免费视频| 黄色欧美视频在线观看| 高清av免费在线| 联通29元200g的流量卡| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品乱久久久久久| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久久久久国产a免费观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 免费大片18禁| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久久久九九精品影院| 大话2 男鬼变身卡| 国产成人aa在线观看| 深夜a级毛片| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品乱久久久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产高清国产精品国产三级 | 久久久久九九精品影院| 午夜福利网站1000一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 久久久久精品久久久久真实原创| 又爽又黄a免费视频| 国产成人福利小说| 免费看光身美女| 一本久久精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产一级毛片在线| 亚洲av男天堂| 久久这里有精品视频免费| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲av二区三区四区| 精品一区二区三区视频在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲内射少妇av| 亚洲精品一二三| 91久久精品国产一区二区成人| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 五月天丁香电影| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 丰满人妻一区二区三区视频av| 中文字幕av在线有码专区| 色播亚洲综合网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 色视频www国产| 日韩制服骚丝袜av| 国产淫语在线视频| 一夜夜www| 国产免费福利视频在线观看| 秋霞在线观看毛片|