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    次氯酸消毒液對(duì)豬源病原體的消殺效果

    2021-12-09 16:41肖琦趙霞玲錢雯嫻朱家平張馮禧尹力鴻溫立斌何孔旺
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年21期
    關(guān)鍵詞:次氯酸細(xì)菌消毒

    肖琦 趙霞玲 錢雯嫻 朱家平 張馮禧 尹力鴻 溫立斌 何孔旺

    摘要:為評(píng)價(jià)次氯酸消毒液(以下簡(jiǎn)稱消毒液)對(duì)豬源病原體的消殺作用,以豬場(chǎng)常見的5種病原菌和5種病毒為研究對(duì)象,測(cè)試消毒液在不同濃度和不同作用時(shí)間下的消殺效果。懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明,消毒液原液(次氯酸含量為210 mg/L)和1 ∶2倍稀釋消毒液(次氯酸含量為105 mg/L),作用30 s即可殺滅豬鏈球菌2型(SS2)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)、副豬嗜血桿菌(HPS)、豬丹毒桿菌(ER)和豬大腸桿菌(ETEC);1 ∶4倍稀釋消毒液(次氯酸含量為52.5 mg/L)作用1 min能殺滅HPS、ER和ETEC,作用5 min能殺滅SS2和APP,殺滅對(duì)數(shù)值均>7.00,殺滅率均為100%。病毒滅活試驗(yàn)結(jié)果表明,消毒液原液作用1 min對(duì)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬細(xì)小病毒(PPV)的平均滅活對(duì)數(shù)值均≥5.00,殺滅率均≥99.999%;1 ∶2倍稀釋消毒液作用1 min對(duì)PEDV的平均滅活對(duì)數(shù)值為4.00、殺滅率為99.990%;消毒液原液作用5 min和10 min,對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的殺滅率為99.899%,對(duì)豬偽狂犬病病毒(PRV)的殺滅率為92.921%,對(duì)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的殺滅率為90.00%。表明次氯酸消毒液在推薦濃度下對(duì)豬場(chǎng)常見病原菌有快速高效的消殺效果,對(duì)PEDV和PPV等病毒亦有良好的消殺作用。

    關(guān)鍵詞:次氯酸;豬;細(xì)菌;病毒;消毒

    中圖分類號(hào):S855.99 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2021)21-0170-04

    收稿日期:2021-05-15

    基金項(xiàng)目:江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(編號(hào):JATS[2020]382);江蘇省農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃(編號(hào):2019-SJ-009-04-01)。

    作者簡(jiǎn)介:肖 琦(1980—),女,遼寧丹東人,博士,助理研究員,主要從事豬病與人獸共患病防控研究。E-mail:xiaoqi_2122@163.com。

    通信作者:何孔旺,碩士,研究員,主要從事豬病與人獸共患病防控研究。E-mail:kwh2003@263.net。

    消毒是豬場(chǎng)重要的生物安全措施之一。豬場(chǎng)常用的消毒方法有物理消毒法、化學(xué)消毒法和生物消毒法等,其中化學(xué)消毒法最為常用[1]。化學(xué)消毒劑的正確選擇和使用是決定豬場(chǎng)消毒效果的關(guān)鍵。含氯類消毒劑是一種高效消毒劑,對(duì)細(xì)菌和病毒有強(qiáng)大的殺滅作用[2]。臨床常用的含氯消毒劑包括次氯酸鈉(如84消毒液)、次氯酸鈣(漂白粉)、二氯異氰尿酸鈉、三氯異氰尿酸鈉等[3]。次氯酸消毒液是一種新型的含氯消毒劑,不僅具有廣譜抗菌、殺菌效率高的特點(diǎn),而且具有腐蝕性小、極少刺激性氣味、高安全性、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[4-5],有望替代刺激性較強(qiáng)的次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉等傳統(tǒng)含氯消毒劑。高曉東等使用次氯酸消毒液對(duì)社區(qū)及醫(yī)院內(nèi)皮膚軟組織感染的病原體殺滅率進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌、分枝桿菌和厭氧菌均能達(dá)到7個(gè)lg值的殺滅率[6]。劉文等在規(guī)?;i舍內(nèi)用次氯酸消毒液(微酸性電解水,有效氯濃度為90 mg/L)噴霧消毒,可有效減少空氣中金黃色葡萄球菌的數(shù)量,消毒后的豬舍內(nèi)空氣微生物在3 d內(nèi)能維持較低的水平[7]。但目前次氯酸消毒液在豬場(chǎng)的使用還不廣泛,也缺乏次氯酸消毒液對(duì)豬源病原菌和病毒殺滅效果的相關(guān)研究。本試驗(yàn)以次氯酸含量為210 mg/L的消毒液為研究對(duì)象,在試驗(yàn)條件下研究其對(duì)豬場(chǎng)常見的豬鏈球菌2型(SS2)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型(APP5)、副豬嗜血桿菌4型(HPS4)、豬丹毒桿菌(ER)、豬大腸桿菌(ETEC)等5種病原菌和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等5種病毒的殺滅作用,為豬場(chǎng)消毒劑的選擇和使用提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 次氯酸消毒液

    易凱歐次氯酸消毒液(以下簡(jiǎn)稱消毒液)由鶴鳴(上海)環(huán)境科技有限公司生產(chǎn)并提供,生產(chǎn)日期為2020年9月6日,次氯酸含量為210 mg/L,pH值為6.2。

    1.2 菌株、毒株及細(xì)胞

    豬鏈球菌2型ZY05株(SS2 ZY05株)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型KL株(APP5 KL株)、副豬嗜血桿菌4型JS株(HPS4 JS株)、豬丹毒桿菌ES株(ER ES株)、豬大腸桿菌O139株(ETEC O139株)、豬圓環(huán)病毒2型P58株(PCV2 P58株)、豬偽狂犬病毒B株(PRV B株)、豬流行性腹瀉病毒JS2012株(PEDV JS2012株)、豬細(xì)小病毒BJ株(PPV BJ株)以及PK15細(xì)胞、Marc145細(xì)胞、ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞,均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗毒GDr180株(PRRSV GDr180株)由廣東永順生物制藥股份有限公司提供。

    1.3 主要試劑

    Todd Hewitt肉湯(THB)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司,THB培養(yǎng)基、THB+0.01%NAD培養(yǎng)基、THB+0.01%NAD+5%小牛血清培養(yǎng)基、THB+5%小牛血清培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基按照配方配制;高糖DMEM培養(yǎng)液、胰酶購(gòu)自Gibico公司;新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司;Champagne Taq DNA Polymerase、2×AceQ qPCR Probe Master Mix、Green Taq Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;Premix Ex Taq(Probe qPCR)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;HiPure Total RNA Mini Kit 總RNA小提試劑盒(雙柱型)、HiPure Universal DNA Kit 通用型DNA抽提試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司;硫代硫酸鈉購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,用無(wú)菌ddH2O將硫代硫酸鈉配制成終濃度為10.5%的中和劑原液,用0.22 μm的濾膜過(guò)濾,備用。

    1.4 懸液定量殺菌試驗(yàn)

    試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行,所有液體使用前恢復(fù)至室溫。參照文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。每組重復(fù)3次,取平均值。

    1.4.1 菌種復(fù)蘇 取50 μL凍存菌液,接種到 5 mL 液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)。

    1.4.2 試驗(yàn)組 每種受試菌共設(shè)9個(gè)消毒液+菌懸液的試驗(yàn)組。1~3組為消毒液原液,4~6組為用無(wú)菌ddH2O進(jìn)行1 ∶2倍稀釋的消毒液,7~9組為用無(wú)菌ddH2O進(jìn)行1 ∶4倍稀釋的消毒液,每組取消毒液4.5 mL,加入0.5 mL菌液,在混勻儀上混勻,作用一定時(shí)間后(1、4、7組作用30 s,2、5、8組作用1 min,3、6、9組作用5 min),加入250 μL中和劑原液,使中和劑的終濃度為0.5%,混勻,作用 10 min 后,菌液計(jì)數(shù)。

    1.4.3 對(duì)照組 共設(shè)4個(gè)對(duì)照組。稀釋液+菌懸液對(duì)照組(陽(yáng)性對(duì)照):取無(wú)菌ddH2O 4.5 mL,加入0.5 mL菌液,作用5 min后,加入250 μL無(wú)菌ddH2O,作用10 min后,菌液計(jì)數(shù)。

    中和劑+菌懸液對(duì)照組:取無(wú)菌ddH2O 4.5 mL,加入0.5 mL菌液,作用5 min后,加入 250 μL 中和劑原液,混勻,作用10 min后,菌液計(jì)數(shù)。

    (消毒液+中和劑)+菌懸液對(duì)照組:取消毒液原液4.5 mL,加入0.5 mL無(wú)菌ddH2O,加入250 μL中和劑原液,混勻,作用10 min后,加入0.5 mL菌懸液,作用5 min后,菌液計(jì)數(shù)。

    稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基對(duì)照組(陰性對(duì)照):取無(wú)菌ddH2O 4.5 mL,加入0.5 mL培養(yǎng)基,加入250 μL中和劑原液,作用10 min后,菌液計(jì)數(shù)。

    1.5 病毒滅活試驗(yàn)

    試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行,所有液體使用前恢復(fù)至室溫。參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。每組重復(fù)3次,取平均值。

    1.5.1 病毒培養(yǎng) 將PCV2、PRV、PEDV、PPV、PRRSV毒株分別在PK15細(xì)胞、ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞、PK15細(xì)胞、Marc145細(xì)胞上培養(yǎng),并測(cè)定各毒株的TCID50。

    1.5.2 試驗(yàn)組 每種病毒共設(shè)9個(gè)試驗(yàn)組。1~3組使用消毒液原液,4~6組使用用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行1 ∶2倍稀釋的消毒液,7~9組使用用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行1 ∶4倍稀釋的消毒液,每組取消毒液40 μL,加入40 μL病毒原液,在混勻儀上混勻,作用一定的時(shí)間后(1、4、7組作用1 min,2、5、8組作用5 min,3、6、9組作用 10 min),迅速加入9倍體積(720 μL)病毒培養(yǎng)液,作為10-1稀釋組,然后用病毒培養(yǎng)液依次做10倍倍比稀釋,每個(gè)稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個(gè)孔,每孔150 μL,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),測(cè)TCID50。

    1.5.3 對(duì)照組 共設(shè)3個(gè)對(duì)照組。

    病毒對(duì)照組(陽(yáng)性對(duì)照):取40 μL病毒培養(yǎng)液,加入40 μL病毒原液,加入9倍體積(720 μL)病毒培養(yǎng)液,作為10-1稀釋組,然后用病毒培養(yǎng)液依次做10倍倍比稀釋,每個(gè)稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個(gè)孔,每孔150 μL,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),測(cè)TCID50。

    消毒液對(duì)照組:取消毒液原液40 μL,加入 40 μL 病毒培養(yǎng)液,加入9倍體積(720 μL)病毒培養(yǎng)液,接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個(gè)孔,每孔 150 μL,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

    空白細(xì)胞對(duì)照組(陰性對(duì)照):驗(yàn)證不接毒細(xì)胞是否可以正常生長(zhǎng)。未接種病毒的細(xì)胞,在含有2%小牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 懸液定量殺菌試驗(yàn)

    由表1可見,消毒液原液(次氯酸含量為 210 mg/L)和1 ∶2倍稀釋消毒液(次氯酸含量為 105 mg/L),作用30 s、1 min、5 min,對(duì)SS2 ZY05株、APP5 KL株、HPS4 JS株、ER ES株和ETEC O139株的殺滅對(duì)數(shù)值均>7.00,殺滅率均為100%;1 ∶4倍稀釋消毒液(次氯酸含量為52.5 mg/L)作用 1 min 對(duì)HPS4 JS株、ER ES株和ETEC O139株,作用 5 min 對(duì)SS2ZY05株和APP5 KL株,殺滅對(duì)數(shù)值亦均>7.00,殺滅率均為100%。

    2.2 病毒滅活試驗(yàn)

    由表2可見,消毒液原液(次氯酸含量為 210 mg/L)與病毒液作用1、5、10 min對(duì)PEDV JS2012株和PPV BJ株的平均滅活對(duì)數(shù)值均≥5.0、殺滅率≥99.999%;1 ∶2倍稀釋的消毒液(次氯酸含量為105 mg/L)作用5 min和10 min、1 ∶4 倍稀釋的消毒液(次氯酸含量為52.5 mg/L)作用10 min對(duì)PEDV JS2012株的平均滅活對(duì)數(shù)值亦均為5.00、殺滅率為99.999%;1 ∶2倍稀釋的消毒液作用 1 min 對(duì)PEDV JS2012株的平均滅活對(duì)數(shù)值為4.00、殺滅率為99.990%。而消毒液原液作用 5 min 和10 min對(duì)PRRSV GDr180株的平均滅活對(duì)數(shù)值為3.00,殺滅率為99.899%;對(duì)PRV B株的平均滅活對(duì)數(shù)值為1.15,殺滅率為92.921%;對(duì)PCV2 P58株的平均滅活對(duì)數(shù)值為1.00,殺滅率為90.00%。

    3 討論

    豬場(chǎng)常用的化學(xué)消毒劑主要有堿類消毒劑、含氯消毒劑、含碘消毒劑、季銨鹽類消毒劑、醛類消毒劑、過(guò)氧化物類消毒劑、酚類消毒劑、醇類消毒劑等[1]。其中,含氯消毒劑是指以次氯酸(有效氯)為主要?dú)⒕煞值囊活愊緞?,主要包括次氯酸鈉、次氯酸鈣、 液氯、二氯異氰脲酸鈉、三氯異氰脲酸和次氯酸等[3]。次氯酸消殺病原微生物的作用原理主要包括:對(duì)微生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜造成一定程度的破壞;破壞細(xì)胞內(nèi)存在的大量蛋白類物質(zhì),同時(shí),也可對(duì)細(xì)胞核中的核苷酸造成破壞;通過(guò)破壞微生物的電子傳遞鏈及各種代謝中的關(guān)鍵酶, 對(duì)微生物的代謝造成嚴(yán)重的影響;次氯酸與微生物反應(yīng)后可生成活性氧物質(zhì)、氯胺,這些物質(zhì)同樣可對(duì)微生物造成殺滅作用[10]。但由于次氯酸鈉、二氯異氰脲酸鈉等傳統(tǒng)含氯消毒劑均具有較強(qiáng)的刺激性和腐蝕性,對(duì)消毒對(duì)象有一定的毒性,從而限制了含氯消毒劑的臨床廣泛應(yīng)用。因此,一種新型的含氯消毒劑——次氯酸消毒劑應(yīng)運(yùn)而生。次氯酸消毒劑又叫弱酸性次氯酸水或微酸性次氯酸水,中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《含氯消毒劑衛(wèi)生要求》中明確次氯酸消毒劑的定義為“消毒液原液中含有穩(wěn)定的次氯酸的消毒劑”[11],它可以廣譜抵抗微生物,在有效的抗菌濃度范圍內(nèi),對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)刺激性、無(wú)致敏、細(xì)胞毒性較低,而且環(huán)境友好[4]。而易凱歐次氯酸消毒液就是一種次氯酸消毒劑。

    一種消毒劑的殺滅效果,通常以殺滅對(duì)數(shù)值或殺滅率來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià),殺滅對(duì)數(shù)值是指當(dāng)微生物的數(shù)量以對(duì)數(shù)表示時(shí),消毒前后微生物減少的對(duì)數(shù)值;而殺滅率是指在微生物殺滅試驗(yàn)中,用百分率表示微生物數(shù)量減少的值。一種消毒劑在懸液定量殺菌試驗(yàn)中,細(xì)菌各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥5.00,相當(dāng)于傳染性喪失程度為99.999%時(shí),可判定該消毒劑對(duì)細(xì)菌消毒合格;而病毒消殺試驗(yàn)中,病毒各次試驗(yàn)的平均滅活對(duì)數(shù)值≥4.00時(shí),相當(dāng)于傳染性喪失程度為99.99%時(shí),可判定該消毒劑對(duì)病毒消毒合格。而殺滅率為99.9%、99%、和90%時(shí),則表明消毒劑的消殺能力依次降低[8,12]。而殺滅率低于90%時(shí)則表明該消毒劑消殺病原微生物能力很低,不能用于臨床消毒。本研究中,易凱歐次氯酸消毒液在次氯酸含量為105 mg/L時(shí),能在30 s內(nèi)高效殺滅所試5種常見豬源病原菌,殺滅對(duì)數(shù)值均≥7.00,而當(dāng)次氯酸含量為52.5 mg/L時(shí),延長(zhǎng)作用時(shí)間至1~5 min亦能高效殺滅常見豬源病原菌;而對(duì)5種豬源病毒,易凱歐次氯酸消毒液的滅活效果卻存在一定的差異,次氯酸含量為210 mg/L時(shí)消毒液可快速高效滅活PEDV和PPV,平均滅活對(duì)數(shù)值亦≥5.0;而對(duì)PRRSV、PRV和PCV2則表現(xiàn)為中效或低效滅活作用。表明次氯酸消毒液在推薦濃度下對(duì)豬場(chǎng)常見病原菌有快速高效的殺滅效果,對(duì)PEDV和PPV等病毒亦有良好的消殺作用,可用于豬場(chǎng)日常消毒。

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