楓香黑色素提取工藝優(yōu)化及其對(duì)糯米的染色特性研究*

弘子姍，王君毅，劉俊佑，龔加順

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

楓香樹(shù)(Liquidambar formosanaHance)又名楓樹(shù)、大葉楓、黑飯木，是金縷梅科楓香屬落葉喬木[1-2]。楓香性平，味辛、苦，具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛和解毒之功效[3]。楓香常被民間用作食物著色的色素原料[4]，用其汁液染制糯米，蒸出的米飯烏黑發(fā)亮，味道誘人，是云南和貴州等地少數(shù)民族的特色食品“五彩飯”之一[5]。楓香樹(shù)葉黑色素是一種多酚類物質(zhì)[6-7]，具有抗氧化[8-9]、抗衰老[10]、抗病毒[11]、抗炎[12-13]、降血壓[14]和抗過(guò)敏[15]等生物活性。

針對(duì)植物天然色素提取及其抗氧化活性的研究很多，如鄒青飛等[16]和黃建蓉等[17]對(duì)不同植物色素的提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行了研究；也有針對(duì)楓香黑色素的研究，如張莉等[18]研究得出楓香樹(shù)葉黑色素的最佳提取工藝條件為60%提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、微波功率700 W、料液比為1∶30、提取時(shí)間55 s；謝宇奇等[19]對(duì)楓香樹(shù)葉黑色素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的清除DPPH自由基能力，且清除能力大于二丁基羥基甲苯 (BHT)。但目前在天然色素對(duì)糯米染色方面的研究極少，特別是針對(duì)地方特色“五彩飯”中楓香色素對(duì)糯米的染色作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。楓香色素染制大米，除賦予大米天然色澤外，染色后的米可能具有抗氧化活性等功能，這可能是少數(shù)民族熱衷于利用天然植物制作“五彩飯”的主要原因之一。徐塬等[20-22]對(duì)烏飯樹(shù)葉色素對(duì)大米蛋白和淀粉的相互作用進(jìn)行研究，認(rèn)為烏飯樹(shù)葉色素與大米蛋白之間以疏水作用和氫鍵作用進(jìn)行結(jié)合，因此，理論上認(rèn)為楓香色素與糯米淀粉和蛋白質(zhì)等的相互作用存在類似情況。

本研究以云南產(chǎn)的人工種植楓香樹(shù)葉為原料，采用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)楓香黑色素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化；通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)，評(píng)價(jià)楓香提取物和糯米在染色前后的抗氧化活性變化；以氣味、外觀結(jié)構(gòu)、適口性、滋味和冷飯質(zhì)地等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)楓香黑米飯感官品質(zhì)進(jìn)行綜合比較；通過(guò)掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)初步研究?jī)?yōu)化提取的色素對(duì)糯米的染色表觀性能。綜合以上結(jié)果以期獲得楓香色素最佳提取工藝，明確染色糯米的抗氧化活性，初步揭示楓香色素染色糯米的作用，為楓香染制糯米的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和楓香色素的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，為少數(shù)民族特色食品“五彩飯”的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

楓香樹(shù)葉：采自云南省曲靖市師宗縣人工栽培的楓香，楓香鮮葉于30 ℃低溫干燥，避光于室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。糯米?019年產(chǎn)自云南昆明，購(gòu)于云南滇鵬產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

參照謝宇奇等[23]的研究結(jié)果，以60%乙醇溶液為提取溶劑，以270 nm處的吸光度為指標(biāo)，考察提取時(shí)間 (1～8 h)、提取溫度 (30～70 ℃)和料液比 [1∶25～1∶50 (g/mL)]等3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，確定最佳工藝的因素水平。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) (表1)對(duì)楓香黑色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1 Independent variables and their levels used in response surface analysis

1.2.3 楓香黑米飯制作及其感官評(píng)價(jià)

(1) 樣品制備

參考傳統(tǒng)民間植物染飯工藝，經(jīng)多次試驗(yàn)確定楓香黑米飯的制作流程。按照確定的最優(yōu)色素提取工藝提取色素溶液(即染料)，將染料加熱至60 ℃，稱取原料糯米，淘洗干凈后倒入染料于室溫下浸泡染色30 min，倒出米，將染料加熱至60 ℃，再次倒入米浸泡染色，重復(fù)3次后將米濾干，于100 ℃蒸制15 min，以備感官評(píng)價(jià)。

(2) 楓香黑米飯感官評(píng)價(jià)

楓香黑米飯及對(duì)照白米飯感官評(píng)價(jià)參照GB/T 15682—2008進(jìn)行并略作修改，由氣味(20分)、外觀結(jié)構(gòu)(30分)、適口性(25分)、滋味(20分)和冷飯質(zhì)地(5分)等5個(gè)部分組成，分別設(shè)立評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以有效地對(duì)楓香黑米飯產(chǎn)品感官品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)比。每組產(chǎn)品由10位品評(píng)員評(píng)分，并以平均分作為產(chǎn)品的最終得分。

1.2.4 楓香黑糯米的微觀形貌分析

樣品制備同1.2.3節(jié)。觀察未染色生糯米和糊化糯米及楓香樹(shù)葉黑色素染色生糯米和糊化糯米的微觀結(jié)構(gòu)。用刀片將糯米橫向切斷，米粒的斷面朝上，用離子衍射儀 (Cressington 108，英國(guó))在糯米橫斷面表面進(jìn)行噴金和固定。色素粉末均勻地分散在樣品處理臺(tái)上，采用S-4800 SEM在10.0 kV工作電壓下分別放大200、5 000和10 000倍觀察并記錄。

1.2.5 楓香黑糯米的抗氧化活性評(píng)價(jià)[24-27]

樣品制備同1.2.3節(jié)。以Trolox 作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程，DPPH自由基清除能力回歸方程為：y=0.055x+8.636，R2=0.995；ABTS自由基清除能力回歸方程為：y=0.136x+24.664，R2=0.993；鐵離子還原能力(FRAP)回歸方程為：y=0.004x+0.098，R2=0.991；氧自由基吸收能力(ORAC)回歸方程為：y=0.421x+7.477，R2=0.998。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的抗氧化活性，結(jié)果以每克樣品所需Torlox 的量表示 (μmol/g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；利用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析和顯著性分析；采用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面分析；采用Origin 9.1和Graphpad Prism 6.01作圖。所有試驗(yàn)重復(fù)3 次以上，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對(duì)楓香樹(shù)葉黑色素提取效果的影響

由圖1可知：楓香黑色素提取效果隨料液比、提取溫度和提取時(shí)間的增加而均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶40 (g/mL)時(shí)提取效果最好，且與其他料液比相比差異顯著(P<0.05)；當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)提取效果最好，且與其他提取溫度相比差異顯著(P<0.05)；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)提取效果最好，且與除提取時(shí)間7 h外的其他提取時(shí)間相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同提取條件對(duì)色素提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction factors on the yield of pigments

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化楓香樹(shù)葉黑色素提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到吸光度與提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)的二次方程模型為：Y=0.073 8+0.467 3X1-0.037 1X3+0.000 6X1X2-0.001 0X1X3+0.000 2X2X3-0.039 7X12-0.000 1X22+0.000 4X32?；貧w模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of response surface analysis

由表3可知：模型中一次項(xiàng)X1對(duì)色素提取效果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，X2對(duì)色素提取效果達(dá)到顯著水平(P<0.05)；模型中交互項(xiàng)X2X3對(duì)色素提取效果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，X1X3對(duì)色素提取效果達(dá)到顯著水平(P<0.05)；模型中二次項(xiàng)X12和X32對(duì)色素提取效果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。楓香黑色素提取工藝回歸模型顯著性檢驗(yàn)P<0.000 1，說(shuō)明該模型達(dá)到極顯著水平；楓香黑色素提取工藝回歸模型失擬項(xiàng)檢驗(yàn)=0.386 9>0.05，可以認(rèn)為所選提取二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性充分模型失擬不顯著。試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜎Q定系數(shù)R2=0.978 6，表明方程的擬合度良好，可用于預(yù)測(cè)楓香黑色素提取效果。離散系數(shù)(CV值)為1.014 6%，表明試驗(yàn)的可靠性較高。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測(cè)楓香黑色素提取工藝，說(shuō)明試驗(yàn)操作可信度高。由回歸系數(shù)顯著性表明：在所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)楓香黑色素提取工藝影響的順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>提取溫度>料液比。

表3 楓香黑色素提取效果回歸模型方差分析表Tab.3 Analysis of variance analysis of degree of the effect of pigments

2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

響應(yīng)面圖中越陡峭顯示該因素對(duì)其影響越明顯，反之，越平坦則影響不明顯[28]。由圖2a、2b可知：提取時(shí)間和提取溫度交互作用的等高線圖呈圓形，響應(yīng)面曲面坡度較平緩，表示兩因素交互作用不顯著；而圖2c、2d中提取時(shí)間和料液比、圖2e、2f中提取溫度和料液比交互作用的等高線圖和響應(yīng)面曲面呈馬鞍形，表示兩因素交互作用顯著[29]。在提取溫度和料液比交互作用的等高線圖中，等高線沿料液比的增加方向密集、降低方向稀疏，說(shuō)明增加料液比會(huì)更顯著地影響色素提取效果。同理，增加提取時(shí)間會(huì)更顯著地影響色素提取效果。

圖2 各兩因素交互作用對(duì)色素提取率的響應(yīng)面Fig.2 The response surface interaction of various factors to the yield of pigments

二次回歸模型擬合結(jié)果顯示：提取時(shí)間5.74 h、提取溫度69.55 ℃、料液比1∶49.98 (g/mL)時(shí)預(yù)測(cè)吸光度為0.766 3。為了驗(yàn)證模型的有效性并考慮到實(shí)際情況，將最佳工藝條件改進(jìn)為提取時(shí)間6 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶50 (g/mL)，并在此條件下的6 次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明吸光度為0.734，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明模型準(zhǔn)確可靠。

2.3 楓香黑米飯的抗氧化活性評(píng)價(jià)

由圖3可知：楓香染料具有較強(qiáng)的抗氧化活性，隨著染色時(shí)間的增加，其抗氧化活性逐漸降低，其DPPH、ABTS、FRAP和ORAC活性顯著降低(P<0.001)，而糯米經(jīng)染色后其抗氧化活性極顯著增加(P<0.001)。此外，空白組(空白水溶液、白糯米)的ABTS、FRAP和ORAC變化均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此，糯米在染色后可以從楓香黑色素中得到較強(qiáng)的抗氧化能力，且差異極顯著(P<0.001)。

圖3 樣品的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of samples

2.4 楓香黑米飯感官評(píng)價(jià)及其微觀形貌分析

2.4.1 楓香黑米飯染色感官評(píng)價(jià)

由表4可知：染色糯米飯的氣味和滋味、彈性和粘性以及總體評(píng)分均顯著低于白米飯 (P<0.05)。

表4 米飯感官評(píng)定結(jié)果Tab.4 Results of sensory evaluation for rice

2.4.2 楓香黑米飯的SEM分析

(1) 楓香黑色素微觀形貌

在SEM掃描電鏡下觀察楓香黑色素的形貌如圖4所示：楓香黑色素顆粒不規(guī)則且多樣，呈現(xiàn)棉絮狀、扁片狀等。

圖4 楓香黑色素顆粒微觀結(jié)構(gòu)(10 000×)Fig.4 Microstructure of melanin from Liquidambar formosana

(2) 生糯米染色前后微觀形貌變化

未染色糯米(簡(jiǎn)稱“白糯米”)和楓香樹(shù)葉黑色素染色糯米(簡(jiǎn)稱“黑糯米”)的微觀形態(tài)見(jiàn)圖5。由圖5c可以明顯看出胚乳細(xì)胞顆粒表面有碎屑，可能是淀粉粒與色素發(fā)生相互作用所致。由圖5b、5d可看出：淀粉粒表面由光滑變成皺縮、凹凸不平、粗糙且不均勻，且淀粉粒尺寸明顯增大。

圖5 染色前后生糯米胚乳細(xì)胞表面微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 Microstructure of albuminous cells of raw glutinous rice before and after dyeing

(3) 糊化糯米染色前后微觀形貌變化

糊化白糯米和糊化黑糯米的微觀形態(tài)見(jiàn)圖6。由圖6c可看出：糯米胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍處于完整未分解狀態(tài)，而圖6a無(wú)胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)，說(shuō)明相同處理?xiàng)l件的白糯米糊化度明顯高于黑糯米，因此可以推斷色素對(duì)淀粉粒的附著包埋會(huì)降低糯米粒的吸水作用，阻礙淀粉分子散開(kāi)，減慢糊化進(jìn)程。由圖6d可以看出：黑糯米的淀粉粒糊化是混亂無(wú)序的，糯米胚乳細(xì)胞截面孔洞大小不一，裂縫為撕裂形態(tài)，與白糯米形成整齊的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)完全不同。

圖6 染色前后糊化糯米胚乳細(xì)胞表面微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of albuminous cells of gelatinized glutinous rice before and after dyeing

3 討論

楓香黑色素作為天然色素具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。ZHANG等[30]研究發(fā)現(xiàn)：楓香樹(shù)葉提取物中含有豐富的酚類和單寧物質(zhì)，其DPPH和ABTS自由基清除能力分別為IC5012.04 μg/mL和IC5017.11 μg/mL；WANG等[31]對(duì)楓香葉提取物進(jìn)行抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)：所有提取物均有較高的抗氧化活性，且抗氧化活性強(qiáng)弱為：乙醇提取物>水提物>丙酮提取物。本研究表明：楓香黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其對(duì)DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力和氧自由基吸收能力分別為(798.516±13.544)、(494.664±0.957)、(993.000±20.418)和(2 202.293±51.375) μmol/g，與上述研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)：糯米經(jīng)染色后，其抗氧化能力隨著染色時(shí)間的增加而極顯著增加 (P<0.001)，楓香色素染制糯米不僅對(duì)糯米賦色，還賦予糯米抗氧化功效。少數(shù)民族“五彩飯”中其他顏色可能存在類似功效，還需進(jìn)行后續(xù)研究。

楓香黑米飯感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明：糯米經(jīng)楓香染色后，對(duì)糯米飯的感官品質(zhì)有一定影響，其感官評(píng)分與白糯米飯相比顯著下降 (P<0.05)，特別是氣味和滋味，需要進(jìn)一步改進(jìn)。原因可能是楓香植物中具有獨(dú)特的氣味物質(zhì)成分，部分人不能接受其氣味和風(fēng)味。因此，對(duì)楓香黑米飯染色工藝進(jìn)行優(yōu)化，特別是對(duì)染色糯米飯風(fēng)味物質(zhì)的研究尤其重要，染色米飯中影響感官品質(zhì)氣味和滋味的問(wèn)題亟待解決。本研究還發(fā)現(xiàn)：染色米飯的粘性和彈性也顯著下降(P<0.05)，且染色米飯的糊化程度明顯較白米飯低，表明多酚類物質(zhì)與淀粉的結(jié)合會(huì)顯著降低淀粉的糊化及消化[32-34]。楓香黑色素的吸附導(dǎo)致黑糯米在相同處理?xiàng)l件下的糊化度較低，從而影響其粘性和彈性，因此，后續(xù)研究需考慮如何避免此情況引起的染色糯米飯感官品質(zhì)下降。

前人主要通過(guò)多酚或黃酮類物質(zhì)與淀粉或蛋白之間的相互作用對(duì)天然色素進(jìn)行研究。徐塬等[20-22]對(duì)烏飯樹(shù)葉色素對(duì)大米蛋白和淀粉的相互作用進(jìn)行研究，認(rèn)為烏飯樹(shù)葉色素與大米蛋白之間以疏水作用和氫鍵作用進(jìn)行結(jié)合。劉立增等[35]研究發(fā)現(xiàn)：羥基紅曲紅色素分子與淀粉顆粒間的吸附是以氫鍵為主的物理吸附。AMOAKO等[36]研究發(fā)現(xiàn)：直鏈淀粉和聚合原花青素之間形成II型半結(jié)晶V型包合物。TAKAHAMA等[37]在研究淀粉與花青素—兒茶素色素的相互作用中發(fā)現(xiàn)：淀粉與多酚絡(luò)合物的疏水作用可能會(huì)抑制淀粉消化。楓香黑色素屬于多酚類物質(zhì)，其對(duì)糯米的染色與糯米淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的相互作用存在類似情況，但目前針對(duì)“五彩飯”中楓香色素對(duì)糯米的染色作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究用楓香對(duì)糯米進(jìn)行染色，通過(guò)觀察其微觀結(jié)構(gòu)確定其與色素發(fā)生了相互作用，為后期與淀粉和蛋白互作的研究提供了基礎(chǔ)。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)：經(jīng)染色后糯米淀粉粒由表面光滑變?yōu)榘櫩s、凹凸不平、粗糙且不均勻，在同一放大倍數(shù)下，糯米胚乳細(xì)胞中淀粉粒粒徑明顯增大，這一現(xiàn)象與劉立增等[35]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)色素吸附會(huì)影響淀粉的糊化，糊化程度降低，導(dǎo)致淀粉粒糊化狀態(tài)由三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)變?yōu)榛靵y無(wú)序的撕裂狀態(tài)，原因可能是色素的吸附影響了蒸制過(guò)程中淀粉的吸水作用，阻礙淀粉分子散開(kāi)，使糊化進(jìn)程減慢，但在此過(guò)程中分子是如何推動(dòng)這些現(xiàn)象的發(fā)生亟待深入研究。

4 結(jié)論

提取楓香黑色素的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃、提取時(shí)間6 h、料液比1∶50 (g/mL)，此條件下楓香黑色素的吸光度可達(dá)0.734。楓香黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，糯米在染色后可以從楓香黑色素中獲得較強(qiáng)的抗氧化性。染色對(duì)糯米的感官品質(zhì)有一定影響，特別是氣味和滋味。糯米淀粉粒與色素發(fā)生相互作用，導(dǎo)致淀粉粒形態(tài)改變，尺寸增大，染色后糯米糊化度降低。