不同質量濃度六氯苯脅迫下狹葉香蒲根系生物膜細菌群落結構研究*

陳海嬌，付如鵬，何秀梅，張晉瑞，鐘 媛，余嬌嬌

(玉溪師范學院 化學生物與環(huán)境學院，云南 玉溪 653100)

水生大型植物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，可吸收水體和沉積物中的養(yǎng)分和重金屬等無機或有機污染物[1]，對濕地生態(tài)系統(tǒng)水質的改善起著至關重要的作用[2]。六氯苯(hexaehlorobenzen，HCB)是淡水中的主要有機環(huán)境污染物之一，已被中國、日本和美國等多個國家優(yōu)先劃分為持久性有機污染物[3]。由于HCB具有親脂性，其隨空氣和廢渣等排放進入環(huán)境后易聚集在土壤和地下水中，并通過食物鏈進入生物體內，嚴重威脅人類健康和生態(tài)系統(tǒng)安全[4]。此外，HCB具有持久性，光解和化學方法很難對其降解。近年來，生物修復技術被廣泛應用于環(huán)境有害污染物的分解。研究結果顯示：濕地植被中HCB含量較低，50%的HCB降解時間約為28～58 d[5-6]。水生植物根際微生物在HCB污染修復中發(fā)揮了關鍵作用[7]。水培試驗表明：HCB脅迫下，水體中的優(yōu)勢菌是變形菌門和厚壁菌門，且與HCB 的根際降解密切相關[8]；研究人工濕地HCB根際降解過程中細菌群落的結構與功能發(fā)現(xiàn)：厚壁菌門在細菌群落中占主導地位，HCB 的降解菌主要有假單胞菌屬、產堿桿菌屬、伯克霍爾德桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和蠟狀芽孢桿菌屬，它們參與HCB的降解或具有降解HCB中間產物以及礦化低級氯化聯(lián)苯的功能[9-11]。張文靜等[12]從底泥篩選出對HCB具有高效降解能力的厭氧菌群，對1 mg/L HCB的降解率高達95.6%，且該混合菌群對HCB的耐受能力高達60 mg/L。這在一定程度上說明生物降解HCB可能需要多種微生物參與，細菌多樣性和豐富度越高，越有利于HCB降解[9]。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，細菌經常出現(xiàn)在如生物膜(又稱附生微生物)、湖泊或海雪表面[13]。與生物膜形成相關的細菌大量富集在可獲取養(yǎng)分的中間體，而低或高的營養(yǎng)條件都有利于浮游菌的生長[14]。生物膜不僅在非生物表面形成，也在水生植物和藻類等生物表面形成[15]。水生植物是空間異質性的重要組成部分，而空間異質性對水生生態(tài)系統(tǒng)生物膜的建立和發(fā)展至關重要[16]。生物膜的功能通常由其生物多樣性和細菌種類決定[16]。研究結果顯示：附生微生物具有多樣性和寄主特異性[17-18]，而大型水生植物的生長狀態(tài)和分泌物可以影響生物膜和沉積物中細菌的組成[15,19]。高通量測序結果顯示：附生生物膜中的細菌群落結構不同于周圍水體[20]。然而，在高通量測序水平上，鮮有關于濕地生態(tài)系統(tǒng)中水生植物根際生物膜菌群結構和功能的報道。

近年來，濕地通過種植大量水生植物對濕地生態(tài)系統(tǒng)進行修復，從而改善濕地水質和生物多樣性。為研究濕地水生植物根系生物膜的形態(tài)結構和細菌群落組成，本研究以常見水生凈化植物狹葉香蒲為濕地典型植物，構建人工濕地微系統(tǒng)，采集富營養(yǎng)化水體中經不同質量濃度HCB處理后的狹葉香蒲根系和沉積物，利用掃描電鏡和16S rDNA測序方法分析其生物膜的形成及根系菌群結構。本研究結果有助于進一步認識水生植物在濕地功能中的作用，可為富營養(yǎng)化水體有機污染物的去除機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 HCB污水制備

將HCB標準品1 g (分析純，純度99.50%)溶于正己烷1 000 mL中配制出1 000 mg/L的母液，再用富營養(yǎng)化水體(來自玉溪師范學院地海)稀釋得到質量濃度為38和760 μg/L的水體(即R38和R760)，充分混勻后室溫放置，使用時檢測水體中HCB的初始質量濃度分別為26和588 μg/L。

1.2 水生植物濕地系統(tǒng)構建及樣品采集

狹葉香蒲(Typha angustifolia)為選自玉溪師范學院溫室內長期繁育的種苗。選取5株高約20 cm的狹葉香蒲均一苗種植在40 cm×30 cm×50 cm (長×寬×高)的根箱中，根箱內自上而下依次為水層15 cm (用富營養(yǎng)化水補充其蒸發(fā)量)、直徑約0.3 cm的砂礫10 cm和直徑約3 cm的碎石20 cm。R38和R760處理各設置9個生物學重復，未添加HCB的富營養(yǎng)化水體設為對照組(CK)。在狹葉香蒲生長茂盛的7月采集樣品，用滅菌剪刀分別剪取R38、R760和CK處理的香蒲根系用于掃描電鏡觀察和高通量測序。

1.3 電鏡掃描觀察

取新鮮狹葉香蒲根系用滅菌刀片切成長約0.5 cm的小塊，用乙醇進行梯度脫水(乙醇含量依次為30%、50%、70%、80%、90%和100%)，每個梯度脫水15 min，最后用100%乙醇浸泡15 min后轉移到冷凍干燥儀中干燥約1 h[16]。將干燥的樣品用鑷子粘貼到觀察臺并真空噴金，用掃描電鏡(日立S-4800) 在放大倍數(shù)1 500×、3 000×和3 500×下對狹葉香蒲根系以及基質的生物膜形態(tài)進行觀察并拍照。

1.4 Illumina高通量測序

1.4.1 細菌16S rDNA-V3V4區(qū)的PCR擴增及測序

取新鮮狹葉香蒲根系，其生物膜的總DNA提取根據Power Biofilm DNA試劑盒(MoBio Laboratories,USA)的操作說明書進行，利用細菌V3V4區(qū)通用引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGC和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT擴增目的片段，PCR擴增體系50 μL：10×Buffer 5 μL，引物各1 μL，模板1 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，5 U/μL NEBTaq0.25 μL，無菌水37.75 μL。PCR擴增程序為：94 °C預變性3 min，30個擴增循環(huán)(94 °C變性30 s，55 °C退火45 s，72 °C延伸1 min)，72 °C再延伸10 min[16]。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海派森諾生物科技股份有限公司測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.4.2 數(shù)據處理和分析

測序原始數(shù)據利用滑動窗口法篩查質量，舍棄小于150 bp的低質量序列，使序列長度集中在401～450 bp。利用FLASH v1.2.7 (http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對通過質量篩查的序列進行配對連接，獲取每個樣品的有效序列。有效序列按97%的序列相似度進行可操作分類單元(OTU)劃分，對每個樣本的序列總數(shù)隨機抽樣，并將抽取到的序列數(shù)及其對應的OTU數(shù)繪制稀疏曲線。利用QIIME軟件計算樣品的Alpha多樣性指數(shù)(包括Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))，其中Chaol 指數(shù)和Shannon 指數(shù)值越高，分別代表群落物種的豐富度和多樣性越高。使用R軟件對豐度前50位的屬進行聚類分析并繪制熱圖。利用PICRUSt工具對16S rDNA基因測序數(shù)據與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據庫進行比對，預測根系生物膜中菌群的主要代謝功能。

2 結果與分析

2.1 狹葉香蒲根系生物膜中細菌的特征

如圖1所示：在富營養(yǎng)化水體中，對照根系表面棲息著少量細菌，形態(tài)主要呈橢圓形，少量呈桿狀；富營養(yǎng)化水體經38 μg/L HCB處理后，狹葉香蒲根系細菌數(shù)量急劇增加，大量細菌聚集分布，主要呈桿狀或橢圓形，少量呈中央凹陷的圓餅狀；富營養(yǎng)化水體經760 μg/L HCB處理后，狹葉香蒲根系同樣附著大量的微生物，分布散亂，主要呈桿狀，但數(shù)量明顯低于R38。此外，富營養(yǎng)化水體經不同質量濃度HCB處理后，水體中的基質表面未觀察到微生物附著。

圖1 狹葉香蒲根系和基質中細菌的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrographs of the epiphytic biofilm on the roots of Typha angustifolia and the sediment

2.2 狹葉香蒲根系生物膜多樣性分析

通過Illumina Miseq高通量測序并優(yōu)化后，R38和R760共獲得95 792條序列，序列長度主要集中在401～450 bp，占總序列數(shù)的99.70%。如圖2所示：2個處理的稀釋性曲線均趨于平緩，表明測序數(shù)據接近飽和，測序深度能全面覆蓋狹葉香蒲根系絕大多數(shù)細菌信息，測序數(shù)據能夠較好地反映根系樣品中細菌群落組成。

圖2 不同處理根系細菌OTU稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of root bacteria in different treatments

由表1可知：在富營養(yǎng)化水體中，R38樣品的 Chao 1指數(shù)高于對照和R760，說明同一水體中，不同質量濃度HCB處理導致生物膜細菌群落豐富度存在差異性變化；各樣品的Shannon 指數(shù)大小為 CK

表1 每個樣品的細菌豐富度和多樣性指數(shù)Tab.1 Bacterial abundance and diversity indexes of each sample

2.3 不同質量濃度HCB處理下狹葉香蒲根系細菌群落組成及功能預測

2.3.1 門水平上的細菌群落結構

在門水平上，CK、R38和R760處理分別獲得30、35和33個類群。將相對豐度<0.1%的類群歸類為其他，可獲得19個類群。由表2可知：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍藻菌門(Cyanobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為5個主要的優(yōu)勢細菌群落。進一步的比較分析顯示：R38處理中變形菌門、藍藻菌門和厚壁菌門的相對豐度分別比對照降低2.6%、3.9%和5.3%，其余多數(shù)類群的相對豐度均升高；R760處理中變形菌門、藍藻菌門、厚壁菌門和螺旋菌門(Spirochaetae)的相對豐度分別比對照降低6.2%、3.3%、5.1%和0.3%，其余多數(shù)類群的相對豐度也均升高；與R38處理相比，R760處理的變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門(Acidobacteria)、單糖菌門(Saccharibacteria)、螺旋菌門、懶桿菌門(Ignavibacteriae)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、儉菌總門(Parcubacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)的相對豐度均降低。

表2 不同質量濃度HCB處理細菌門水平組成Tab.2 Bacterial community composition at phylum level under different mass concentration of HCB %

2.3.2 屬水平上的細菌群落結構

由圖3可知：不同質量濃度HCB處理下狹葉香蒲根系生物膜菌群可聚為4類，菌屬的豐度均不同程度的受到HCB處理的影響。

圖3 樣品屬水平群落組成熱圖Fig.3 Heat map of top 50 genera in each sample

聚類1主要包括突柄微菌屬(Prosthecomicrobium)、CL 500-29_marine_group、微 絲 菌屬(Candidatus_Microthrix)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、嗜酸菌屬(Acidovorax)、厭氧粘細菌(Anaeromyxobacter)、Quadrisphaera、醋酸桿菌屬(Acetobacterium)以及水庫桿菌屬(Piscinibacter)。HCB處理后細菌結構的分布發(fā)生了明顯變化，這9個菌屬在對照和R38中的豐度均低于R760。

聚類2中的丙酸桿菌屬(Propionicicella)、脫硫桿菌屬(Desulfobacterium)、紅細菌屬(Rhodobacter)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas)、德克斯氏菌屬(Derxia)、Actinotalea、Denitratisoma以及Variibacter的豐度在對照中較低。與R38處理相比，R760處理的丙酸桿菌屬、脫硫桿菌屬、紅細菌屬、玫瑰單胞菌屬和德克斯氏菌屬的豐度均升高；但放線菌(Actinotalea)、反硝化菌屬以及Variibacter的豐度則低于R38。

聚類3主要包括Pleomorphomonas、噬纖維菌屬(Cytophaga)、貪噬菌屬(Variovorax)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、紅微菌屬(Rhodomicrobium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和臂微菌屬(Ancalomicrobium)等。這9個菌屬在 R38和R760中的豐度均小于對照。

聚類4主要包括慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、軍團菌屬(Legionella)、Christensenellaceae_R-7_group、不動桿菌屬(Acinetobacter)、柄桿菌屬(Caulobacter)、厭氧繩菌屬(Anaerolinea)、紅芽生菌屬(Rhodoblastus)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、紅長命菌屬(Rubrivivax)、根瘤菌屬(Rhizobium)、地桿菌屬(Geobacter)、纖維菌屬(Cellulomonas)和脫硫葉菌屬(Desulfobulbus)。這些菌群在R38中的豐度均大于對照和R760。綜上所述，R38和R760的細菌結構和豐度存在差異，說明不同質量濃度的HCB對根系生物膜菌群結構的影響不同。

2.3.3 狹葉香蒲根系生物膜菌群代謝功能預測

由表3可知：根系生物膜菌群的主要功能集中在碳水化合物、氨基酸以及能量代謝方面，而在多糖的生物合成和代謝以及次生代謝的生物合成等方面的功能較弱。

表3 PICRUSt預測根系生物膜菌群代謝功能Tab.3 Metabolic function of bacteria predicted by PICRUSt

3 討論

3.1 狹葉香蒲根系表面為微生物提供特殊的生態(tài)位

以大型水生植物為主的水生生態(tài)系統(tǒng)中，生物膜是初級生產中不可替代的組成部分[16]。研究表明：水生植物表面附著的細菌和浮游細菌群落結構存在顯著差異[16,20]。水生植物的表面可以作為細菌群落的“集中器”，為細菌的附著提供營養(yǎng)和微生態(tài)位[16]。在狹葉香蒲根系生物膜中檢測到細菌，證明細菌是水生植物附生微生物的主要組成部分[15,20]。經不同質量濃度HCB處理后，根系附著微生物的數(shù)量明顯增加，尤其是在R38處理中最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)：HCB含量與香蒲根際微生物數(shù)量呈負相關，香蒲根際微生物數(shù)量增加有利于濕地系統(tǒng)降解HCB[21]。R760處理的根系生物膜細菌數(shù)量減少可能與高質量濃度HCB的抑制作用有關[21]。然而，R38和R760處理的水體基質表面未觀察到微生物附著。研究顯示：水生植物根系為微生物生長提供了表面積，根系分泌物是微生物碳水化合物的來源，根系氧氣的釋放為微生物的生存創(chuàng)造了微氧環(huán)境[22-23]，而基質可能未提供微生物附著和生存的必需條件。

3.2 不同質量濃度HCB對狹葉香蒲根系生物膜菌群多樣性和結構的影響

根際是影響根系活動的特殊區(qū)域，除能為微生物的生存提供營養(yǎng)物質和有氧環(huán)境外，還能促進高分子有機物(如農藥)的降解[24]。狹葉香蒲常用于降解無機和有機污染物(如HCB)[25]。本研究表明：狹葉香蒲根系生物膜細菌群落的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均表現(xiàn)為R38>R760>CK，說明低質量濃度HCB處理的根系細菌群落結構、豐富度和多樣性均高于高質量濃度HCB處理。16S rDNA測序結果顯示：生物膜中的優(yōu)勢細菌有變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、藍藻菌門和厚壁菌門，它們在其他大型水生植物中同樣有分布[16,20]。多數(shù)變形菌門對有機基質具有較強的代謝能力，使其在富營養(yǎng)化水體中占主導地位[26]。富營養(yǎng)化水體中，水生凈化植物粉綠狐尾藻和喜旱蓮子草根際微生物的數(shù)量均表現(xiàn)為細菌>放線菌>真菌[27]。本研究測序結果中放線菌門為第二大種群，可能與HCB富營養(yǎng)化水體的改善以及HCB的降解有關[21,27]。HE等[18]利用T-RFLP對各微生物群落進行比較，發(fā)現(xiàn)變形菌門在慈姑和黑藻上最豐富，而藍藻在慈姑和黑藻上是第二大種群。藍藻對氮、磷等營養(yǎng)元素具有極強的競爭力，氣候條件和營養(yǎng)元素均是有害藍藻擴增的有利因素[28]。然而，經不同質量濃度HCB處理后，水體中藍藻菌門豐度均降低。HCB脅迫下，厚壁菌門在細菌群落中占主導地位，參與人工濕地HCB的降解[9]。在R38和R760中厚壁菌門豐度相似，但明顯低于對照。

HCB脅迫下，菌屬的豐度均受到不同程度的影響。R760中，放線菌門的CL 500-29_marine_group豐度高于對照和R38，能夠有效利用多種形式的碳化合物，屬于養(yǎng)殖環(huán)境中的有益微生物[29]。推測高豐度的CL 500-29_marine_group可能通過促進碳循環(huán)改善R760的水體環(huán)境。狹葉香蒲根系生物膜中還檢測到紅微菌屬、紅假單胞菌屬、紅長命菌屬、紅芽生菌屬和紅細菌屬等多種光合細菌屬，均屬于光合細菌下的紫色非硫細菌。光合細菌能有效改善富營養(yǎng)化水體的水質，且對水體中總磷、總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和COD的去除效果明顯[30]。紫色非硫細菌能高效去除有機物，參與鹵代化合物和芳香化合物的降解[31]，如光合細菌降解57.26%的2-氯苯酚只需7 d[32]。以上研究表明：生物膜中大量光合細菌的附著可能與富營養(yǎng)化水體的改善以及HCB的降解有關。叢毛單胞菌屬可降解酚類物質，對苯酚的最高耐受力可達2 000 mg/L，完全降解初始質量濃度為1 000 mg/L的苯酚只需48 h[33]。此外，叢毛單胞菌屬還可分解多環(huán)芳烴和雜環(huán)類物質[34]。這類細菌在根系生物膜上的豐度大小依次為CK>R760>R38。貪噬菌屬是另一類能降解多種有機化合物的微生物，如原油相關的硫代物[35]、煙堿類殺蟲劑[36]以及腈類除草劑等[37]，它在生物膜上的豐度為CK>R38>R760。在R38中，不動桿菌屬是植物根際優(yōu)勢菌群，這類細菌同樣能參與苯酚等有機物的降解[38]。嗜酸菌屬是R760根系生物膜上的優(yōu)勢菌屬，能降解喹啉等有機物[39]。狹葉香蒲根際優(yōu)勢菌屬以叢毛單胞菌屬、貪噬菌屬、不動桿菌屬、嗜酸菌屬以及多種光合細菌屬為主，說明它們可能是水體中HCB 降解的“主力菌”[9,21]。此外，根系生物膜中的微生物棲息于特定的生態(tài)位，植物根系、水體、沉積物成分甚至水生動物都可能影響根際微生物的群落結構和多樣性[16]，并影響根際對水體中污染物的去除效果。

3.3 狹葉香蒲根系生物膜菌群與氮循環(huán)

反硝化細菌將硝酸鹽還原為分子氮或氣體氮。反硝化細菌被認為是自然反硝化過程的主要執(zhí)行者[40]，近年來在污水脫氮處理中備受關注。本研究共檢測到7屬此類細菌。R38生物膜中，紅長命菌屬、中慢生根瘤菌屬和不動桿菌屬的豐度最高，而紅細菌屬則是R760生物膜中的優(yōu)勢菌。紅長命菌屬是兼性異養(yǎng)細菌，能在厭氧和低氧條件下將亞硝酸鹽還原成氮氣[41]。中慢生根瘤菌屬則是一類好氧反硝化菌，在好氧條件下將銨態(tài)氮直接轉化成氣態(tài)產物[42]。不動桿菌屬是近年來發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌群，能將NH4+-N氧化為NO2--N (或NO3--N)，再將NO2--N (或NO3--N)還原生成含氮氣體釋放[43]，實現(xiàn)硝化和反硝化作用在同一時間和空間內完成[44]。紅細菌屬是一類高效凈化水質且能參與反硝化作用的光合細菌[45]。反硝化作用是去除湖泊、河流氮污染和調節(jié)氮循環(huán)的關鍵過程[46]。以上4類菌群分別屬于R38和R760根系生物膜中的優(yōu)勢菌，它們可能參與富營養(yǎng)化水體的脫氮和氮循環(huán)。植物在白天可以通過光合作用釋放氧氣，而根系生物膜中大多數(shù)微生物通過呼吸消耗氧氣，白天和晚上能分別形成好氧和低氧的微環(huán)境[16]。好氧環(huán)境下，生物膜上的硝化細菌進行硝化作用；低氧環(huán)境下，厭氧或兼性厭氧的反硝化細菌進行反硝化作用[46]，從而實現(xiàn)水體氮循環(huán)。此外，7月適宜的環(huán)境和水體條件可能也會刺激這類細菌的生長。上述結果表明：狹葉香蒲根系生物膜體系在富營養(yǎng)化水體脫氮和氮循環(huán)過程中至關重要。

4 結論

經38 μg/L HCB處理后，富營養(yǎng)化水體中狹葉香蒲根系生物膜細菌的數(shù)量、群落豐富度和多樣性均高于760 μg/L HCB的富營養(yǎng)化水體根系。此外，屬水平優(yōu)勢菌群可能與富營養(yǎng)化水體的水質凈化、有機物降解以及脫氮和氮循環(huán)有關。