云煙87內生真菌多樣性及其促生作用評估*

謝佳偉，彭小祠，陳小巧，譚明華，劉彥中，郝 冰

(云南農業(yè)大學 煙草學院，云南 昆明 650201)

植物內生菌是影響植物生長的重要生物因素之一，內生菌通過自身的生命活動，依靠自身功能及產生的次級代謝產物對植物體產生直接或間接的影響，包括促進共生植物的生長發(fā)育、直接干預植物防御系統(tǒng)和激素調控等作用[1-2]。目前對于煙草內生菌促生作用的研究主要集中于內生細菌，如梭狀芽孢桿菌(Clostridiumsp.)含有大量固氮酶，可為煙草提供無機氮源，進而提高煙葉的產量和品質[3]；煙草內生促生細菌wy2和解淀粉芽孢桿菌 YN201448能夠促進煙草種子萌發(fā)、幼苗莖粗和根系生長[4-5]，但對于煙草內生真菌促生效果的研究較少。

有關植物內生真菌促生作用的研究主要集中于糧食作物。已有研究表明：從野生大豆分離的內生真菌Y6R15可抗大豆疫霉病和玉米大斑病，且對玉米和大豆均有促生作用[6]；從禾草根部分離的內生真菌LC-R-311能顯著提高玉米幼苗的多項生理指標、葉綠素含量和SOD酶活性，顯著降低ABA含量[7]；稻鐮狀瓶霉可顯著提高水稻的多項農藝性狀指標，提高光合強度[8]；深色有隔內生真菌對甘蔗的生物量和株高等有促進作用[9]。本研究對云南烤煙主栽品種云煙87的內生真菌進行分離鑒定，篩選具有顯著促進云煙87、云煙97、K326和紅花大金元煙苗生長功能的菌株，將促進煙草不同部位生長的菌株根據(jù)實際生產需要運用于煙草生長的不同時期，為功能內生真菌的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

內生真菌分離所用3株長勢一致的成熟健康云煙87煙株于2019年7月21日采自昆明尋甸(N25.518°，E103.278°，海拔1 865 m)；內生真菌發(fā)酵液促煙苗生長試驗所用煙苗培養(yǎng)于云南昆明西南生物多樣性實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

內生真菌分離培養(yǎng)基采用含10 mg/L硫酸鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基；內生真菌發(fā)酵液促煙苗生長試驗采用含10 mg/L硫酸鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 云煙87內生真菌的分離純化

參考王利娟等[10]植物內生真菌的分離培養(yǎng)方法，將采回的云煙87植株截取上部葉、中部葉、下部葉、莖、主根和須根等6個部位的健康組織，分別用無菌水沖洗，除去表面泥土，并用濾紙吸干表面水分。組織表面消毒步驟為：(1) 葉部：75%酒精浸泡30 s→0.1%升汞浸泡15 s→無菌水沖洗3次；(2) 莖部：75%酒精浸泡30 s→除去表皮保留皮層及中柱；(3) 根部：75%酒精浸泡60 s→0.1%升汞浸泡20 s→無菌水沖洗3次，將最后1次沖洗后的無菌水劃線于PDA平板之上，作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底。接種分離步驟為：將煙葉部分置于研缽中加入無菌水研磨，將研磨液和殘渣均勻地鋪放在培養(yǎng)基表面；將煙莖部分用接種刀切成5～8 mm小塊，鋪放在培養(yǎng)基表面；將粗根部分用接種刀切成3～5 mm小段，切面朝下鋪放在培養(yǎng)基表面；將須根部分于研缽中加入無菌水研磨，將研磨液和殘渣均勻地鋪放在培養(yǎng)基表面。

全部材料置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落生長狀況。將培養(yǎng)分離出的不同種類的內生真菌接入PDA培養(yǎng)基進行純化，2～3次點接純化直到菌落單一。由于不同真菌的繁殖速度不同，可以優(yōu)先分離純化生長較快的菌株，生長較慢的待其穩(wěn)定后再進行分離純化。

1.3.2 云煙87內生真菌的鑒定

參照CTBA 法[11]提取真菌基因組DNA。ITS擴增使用的通用引物為ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由昆明擎科生物科技有限公司合成，使用的PCR試劑盒為T5 Direct PCR Kit(Plant)，由昆明擎科生物科技有限公司生產。PCR 反應體系為：25 μL T5酶，2 μL ITS4，2 μL ITS5，1 μL DNA 模板，用 ddH2O 補足至50 μL。擴增程序為：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，54 ℃10 s，72 ℃ 10 s，35個循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。對瓊脂糖凝膠電泳分析后的擴增產物進行測序，測序結果通過BLAST比對鑒定菌種所屬種類，并參考文獻[12]，結合內生真菌的菌落特征和顯微形態(tài)特征確定所屬菌種。在GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中挑選出同源性較為相近的真菌DNA序列，再通過軟件MEGA 4.0按鄰接法(neighbor-joining)構建所有種屬以及促生菌株的內生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 云煙87內生真菌的液體發(fā)酵

將分離純化的全部內生真菌菌株各取大小約1.5 cm2的菌塊接入100 mL液體PDA培養(yǎng)基中，裝入250 mL錐形瓶內，瓶口封膜，于搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉速220 r/min，培養(yǎng)48～72 h，備用。

1.3.4 云煙87內生促生菌株的篩選

前期在適宜條件下培育煙苗，育苗盤規(guī)格為12 cm×16 cm，12孔穴，每盤每列從左到右分別種植云煙97、云煙87、K326和紅花大金元，每穴播種3顆煙草種子，待煙苗生長到5～6片真葉時，挑選長勢一致的煙苗進行促生試驗，每穴保留1株煙苗。每穴取3 mL內生真菌發(fā)酵液搖晃均勻，對煙苗的地上部分和根部土壤進行澆施處理；澆菌后，育苗盤上部蓋上透明隔離罩，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。另設置對照煙苗，正常培養(yǎng)，不澆施菌液。待煙苗生長到7片真葉時，統(tǒng)計煙苗的鮮質量、根鮮質量、地上部鮮質量、株高、最大葉長、最大葉寬和根長共7個指標的數(shù)據(jù)，挑選促生效果顯著的菌株。按照增長率公式計算各個指標的增長率(3次重復試驗的均值)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010、SPSS 23.0、MEGA 4.0和Origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖分析，顯著性分析應用LSD新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 云煙87內生真菌的分離與鑒定

從田間采摘的3株云煙87的不同部位共分離出103株內生真菌，包括：尖孢鐮刀菌、土曲霉、Aspergillus lentulus、球毛殼菌、互隔交鏈孢菌、廣生莖點霉和朱黃籃狀菌等53種真菌，其菌群結構以及不同菌種之間的進化關系見圖1。其中，尖孢鐮刀菌和土曲霉為主要優(yōu)勢種，分別占分離菌落總數(shù)的13.59%和12.62%。內生真菌隸屬于鐮孢菌屬(Fusarium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicilium)、鏈格孢屬(Alternaria)、木霉菌屬(Trichotderma)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、莖點霉屬(Phoma)和籃狀菌屬(Talaromyces)等29屬，其中，曲霉屬、鐮孢菌屬、籃狀菌屬和鏈格孢屬為主要優(yōu)勢屬，分別占總屬數(shù)的23.30%、20.39%、7.77%和6.80%。由表1可知：在云煙87上部葉共分離出10屬11種內生真菌，中部葉和下部葉分別分離出7屬8種內生真菌，莖部共分離出8屬11種內生真菌，主根共分離出13屬22種內生真菌，須根共分離出5屬7種內生真菌。

表1 云煙87不同部位煙草內生菌種類Tab.1 Endophytic fungi in different parts of Yunyan87

圖1 云煙87內生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of endophytic fungi in Yunyan87

2.2 云煙87不同部位內生真菌的群落差異

由圖2可知：從成熟健康的云煙87分離出的103株內生真菌中，從葉部分離出25種共30株內生真菌，占分離菌落總數(shù)的29.13%，包括上部葉11株，中部葉10株，下部葉9株，鏈格孢屬(Alternaria)是葉部內生真菌的主要優(yōu)勢屬；從莖部分離出11種共20株內生真菌，占分離菌落總數(shù)的10.68%，尖孢鐮刀菌和朱黃籃狀菌為莖部內生真菌的主要優(yōu)勢種；從根部分離出27種共53株內生真菌，占分離菌落總數(shù)的51.46%，包括主根38株，須根15株，土曲霉為根部內生真菌的主要優(yōu)勢種。總體而言，內生真菌種類和數(shù)量為根部>葉部>莖部。其中，在云煙87的根、莖、葉中有2種內生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌和Aspergillus lentulus；在根、葉中有4種內生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌、A.lentulus、煙曲霉和草酸青霉菌；在根、莖中有5種內生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌、A.lentulus、土曲霉、廣生莖點霉和毛栓菌；在莖、葉中有3種內生真菌共同存在，分別為尖孢鐮刀菌、A.lentulus和互隔交鏈孢菌。

圖2 不同部位內生真菌的種數(shù)和差異Fig.2 Species and differences of endophytic fungi in different parts

2.3 促生菌株的篩選、鑒定

由圖3可知：經篩選的001E-5、001H-10和001I-26等3株促生菌株處理的煙苗與對照存在明顯差異，促生效果良好。

圖3 3種促生菌株對不同品種煙苗的促生效果Fig.3 Promotion effect of three plant-promoting fungi on toabcco seedlings

對3株促生效果最明顯的內生真菌進行序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建(圖4)，并結合其菌落特征和顯微形態(tài)特征分析，結果表明：3株具有顯著促生作用的內生真菌分別為尖孢鐮刀菌(001E-5)、土曲霉(001H-10)和朱黃籃狀菌(001I-26)。

圖4 促生菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹及形態(tài)特征Fig.4 Phylogenetic tree and morphological characteristics of growth-promoting fungi

2.4 促生菌株對不同品種煙苗的影響

由表2可知：經尖孢鐮刀菌處理的云煙97煙苗的株高、鮮質量及地上部鮮質量增長最為顯著，分別比對照增長107.64%、153.97%和167.09%，分別比紅花大金元煙苗顯著高98.58%、135.14%和147.23%，云煙87和K326之間的上述3項指標增長率沒有顯著差異；云煙97煙苗的最大葉長增長最為顯著，比對照增長61.02%；在最大葉寬方面，云煙97增長率顯著高于其他3個品種，比對照煙苗增長53.03%；K326煙苗的根長和根鮮質量增長最為明顯，分別比對照顯著增長50.75%和111.75%。

經土曲霉處理的煙苗在株高和根長方面有所增長，但品種間差異不顯著；紅花大金元煙苗的最大葉長和最大葉寬增長顯著低于其他3個品種；云煙87煙苗的鮮質量、根鮮質量和地上部鮮質量增長最為顯著，分別比對照煙苗增長172.85%、209.57%和169.18%。

經朱黃籃狀菌處理的K326煙苗的鮮質量、根鮮質量和地上部鮮質量增長最為顯著，增長率分別比紅花大金元高27.62%、10.45%和29.45%；云煙87煙苗株高增長最為明顯，增長率顯著比紅花大金元高31.35%；紅花大金元的最大葉寬增長最明顯，比K326煙苗顯著高20.47%；云煙97煙苗的根長增長率最明顯，顯著高于紅花大金元20.06%。

由表2還可知：尖孢鐮刀菌對云煙97煙苗株高、鮮質量以及地上部鮮質量的促生作用最好；而土曲霉對其煙苗根鮮質量促生作用最明顯，比對照煙苗增長169.21%。就云煙87而言，經土曲霉處理后，其煙苗的鮮質量、根鮮質量及地上部鮮質量增長率顯著高于其他2個菌種；而朱黃籃狀菌處理對其煙苗株高增長最明顯，比對照煙苗增長71.66%。就K326而言，尖孢鐮刀菌對其煙苗根鮮質量和根長的促生效果最明顯；土曲霉對其煙苗的鮮質量和地上部鮮質量影響最為明顯，分別增長108.53%和109.52%。經朱黃籃狀菌處理的紅花大金元煙苗的地上部各項性狀指標均顯著高于其他2個菌種處理的煙苗，其中株高、最大葉長和最大葉寬增長率分別為40.31%、24.21%和28.17%；此外，經土曲霉處理的紅花大金元煙苗根鮮質量增長率為121.47%。

3 討論

從云南省栽培的成熟云煙87植株分離出103株內生真菌，其中曲霉屬和鐮孢菌屬為主要優(yōu)勢屬，這與裴洲洋[13]對河南9個煙草品種內生真菌的分離結果不同。同時，本研究表明：云煙87根部和葉部分離出的內生真菌的多樣性高于莖部，這與湖北栽培云煙87莖部內生真菌多樣性最高的結論[14]相反。本研究進一步證實：不同地域土壤條件下的菌群差異可導致內生真菌在植株體內定殖群落和部位存在差異。有研究表明：內生真菌具有不同的組織偏好性[15]，本研究中的優(yōu)勢菌種尖孢鐮刀菌集中分布于根部和莖部，而另一優(yōu)勢菌種土曲霉主要分布于根部，而葉部內生真菌主要優(yōu)勢屬為鏈格孢屬(Alternaria)。

通過煙苗促生試驗篩選出的3株內生真菌對不同品種煙苗以及煙苗不同生理指標的影響也存在差異。云煙87和K326在促生菌株的處理下，除個別生理指標外，整體增長趨勢較為一致，這可能是由于K326是云煙87的父本，親緣關系較近，真菌促生機理相似。尖孢鐮刀菌和朱黃籃狀菌分別對云煙97和紅花大金元的促生效果整體最為顯著，推測2種菌株分別在2個品種煙草中的菌群密集度更高或者煙草對菌的適應性更強。

尖孢鐮刀菌對4個品種煙苗的多項生理指標均表現(xiàn)出明顯的促進作用，可能是由于該菌在煙株體內的分布較為廣泛，且分離出的尖孢鐮刀菌為非致病性尖孢鐮刀菌。已有研究表明：非致病性尖孢鐮刀菌可以從健康植株根莖部以及土壤中分離出[16]，可促進番茄種苗生長[17]；此外，楊猛等[18]研究發(fā)現(xiàn)：非致病性尖孢鐮刀菌可以提高西瓜和黃瓜的株高和鮮質量以及植物中赤霉素的含量，這些結果與本研究中表現(xiàn)出的煙草促生效果一致。在真菌群落豐度較低或未達到飽和狀態(tài)時，尖孢鐮刀菌與其他內生真菌相比，對于營養(yǎng)元素以及侵染位點的競爭更大，這就使植物免疫進一步提高，從而促進植物生長。

本研究表明：土曲霉可促進4個煙草品種的根部生長。已有研究表明：土曲霉通過產生一系列抑菌代謝產物，在根部土壤微環(huán)境中創(chuàng)造一個促進根生長的菌群環(huán)境，進而限制其他菌種對植物體內營養(yǎng)的消耗，促進根部生長[19-20]。因此，在煙草漂浮育苗過程中適當施加土曲霉，將有效促進煙苗根部生長，達到促根壯苗的效果。

朱黃籃狀菌大多分離自玉米和石榴等植物，本研究首次從煙草中分離出該菌。研究表明：朱黃籃狀菌可產生較多的淀粉酶[21]，云南籃狀菌(Talaromyces yunnanensis)能夠溶磷[22]，經朱黃籃狀菌處理煙苗的地上部分促生效果相對更為顯著，這可能是由于產生的大量淀粉酶使煙葉中的淀粉加速水解為糖類或者促進土壤中的礦化磷轉化為水溶性磷，為煙苗地上部生長提供更多的能量。此外，LIMA等[23]和CHEN等[24]研究發(fā)現(xiàn)：朱黃籃狀菌的次生代謝產物中包含許多萜類化合物，但目前對于該菌的研究較少，其次生代謝物作用有待進一步驗證。

綜上所述，不同促生菌株的具體作用部位存在差異，因此，在煙草生長的不同時期施加可促進不同部位生長的功能菌株，有針對性的單獨或混合使用促生菌株，可達到促進根部生長、調節(jié)煙苗根莖比例和葉片數(shù)的目的，從而提高煙苗成活率和煙草質量。

4 結論

本研究從云南烤煙主栽品種云煙87不同部位分離到53種103株內生真菌，其中曲霉屬和鐮孢菌屬為主要優(yōu)勢屬。3株顯著促進煙苗生長的菌株經分子生物學鑒定為尖孢鐮刀菌(001E-5)、土曲霉(001H-10)和朱黃籃狀菌(001I-26)，001E-5和001H-10對云煙97、云煙87和K326的鮮質量提高均在91%以上。研究結果為煙草內生菌株的促生菌劑研發(fā)提供了理論依據(jù)。