地不容種子休眠及其破除方法研究*

施守濤，李村富，劉正杰，林春，杜江，蘇為耿，毛自朝,4

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201 ；2.云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，云南 昆明 650503；3.云南省林業(yè)和草原技術(shù)推廣總站，云南 昆明 650204 ；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究中心，云南 昆明 650201 )

地不容(StephaniaepigaeaLo)屬毛茛目(Ranunculales)防己科(Menispermaceae)千金藤屬(Stephania)多年生草質(zhì)藤本植物，是我國的傳統(tǒng)中藥，以塊根入藥，在西南等地廣泛應(yīng)用于消腫散淤、健胃止痛以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘧疾治療和促進(jìn)術(shù)后白細(xì)胞生長等[1]。主要活性成分為生物堿，已分離鑒定的化合物有原小檗型[2]、阿樸菲型[3]、原阿樸啡型[4]、嗎啡型[5]、雙芐基異喹啉型生物堿[6]等，其中千金藤素在地不容中含量較高，達(dá)1.3%，對放療或白細(xì)胞減少癥具良好效果[7-9]。

地不容的塊根形似烏龜，上部美觀，生長迅速、綠化面積大、管理容易，常用于園林景觀及綠化，開發(fā)利用前景廣闊。地不容為雌雄異株，授粉需要一定的種群數(shù)量，加之種子自身存在休眠現(xiàn)象，因此自然結(jié)實(shí)率和種子繁殖力相對較低。在市場經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，亂采濫挖進(jìn)一步加劇了野生資源的減少，因此，通過采挖野生塊莖繁殖已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足其市場需求。

開展種子繁殖、莖段扦插、組培快繁等研究，是解決當(dāng)前地不容資源不足的重要途徑。生產(chǎn)實(shí)踐中，地不容種子具有休眠特性，現(xiàn)采現(xiàn)播難以萌發(fā)，但其休眠機(jī)制和解除方法尚未見報(bào)道。本研究為明確地不容種子的休眠機(jī)制，采用機(jī)械劃破種皮、摩擦處理、熱水及硫酸浸泡等方法處理其種子，比較不同處理方法對解除種子休眠的效果，以期為種子育苗及種質(zhì)資源保護(hù)與利用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

地不容植株為野外引種，移栽于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)大棚。2018年8月采集其成熟后的果實(shí)，去除果肉后自然晾干種子，備用。地不容的種子外形呈馬蹄形(圖1c)，平均直徑0.51 cm，千粒重18.81 g。

供試藥劑主要有紅四氮唑(1%TTC，298-96-4，購于上海源葉生物科技有限公司)、H2SO4、NaOH等均為分析純(廣東省佛山市華希盛化工有限公司)。試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究所完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 地不容種子活力檢測

(1)種子生活力檢測 在人工去種皮時(shí)，除去了不飽滿、腐爛、組織軟化等種胚，挑選飽滿白色種胚(圖1e)的地不容種子，備用。采用紅四氮唑(1%TTC)染色法[10]測定新采收的地不容種子活力，胚被染成有光澤鮮紅色的(圖1f)記為組織狀態(tài)正常有活力的種子。每重復(fù)處理50粒種子，重復(fù)3次，取平均值。

(2)萌發(fā)試驗(yàn) 取不做任何處理的地不容飽滿種子在培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，萌發(fā)床為經(jīng)高溫滅菌濾紙，光照條件20 μmol/(m2·s)，12 h/d(每天光照時(shí)間為12 h)，溫度(25±2)℃下培養(yǎng)。以下所有處理的萌發(fā)條件都保持一致，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子，重復(fù)3次，分別在試驗(yàn)14、28 d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢和萌發(fā)率，之后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)測定與此保持一致。

(3)吸水率 隨機(jī)取50粒飽滿種子于去離子水中浸泡，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔6 h取出種子，用濾紙吸干種子表面水分稱重，直到種子吸水量不會再增加[11]。

(4)萌發(fā)抑制物質(zhì)存在與否的生物檢測 為確定地不容種子是否含萌發(fā)抑制物，取地不容種子的種皮2～4 g在研缽中搗碎后溶于40 mL的去離子水中，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)浸提48 h;使用小白菜(Brassicarapavar.glabra) 種子做為生物測定種子，在9 cm培養(yǎng)皿中，以濾紙為萌發(fā)床，加3 mL種皮浸提液，播小白菜種子50粒，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，24 h后測小白菜種子的發(fā)芽率，培養(yǎng)48 h后測其種子的胚根長度[12]。對照組將浸提液替換為3 mL去離子水，其他培養(yǎng)條件保持一致。

1.2.2 物理方法處理

(1)劃破種皮處理 為探究透氣性對種子萌發(fā)的影響，對種皮進(jìn)行不同程度處理：在胚根端開孔、去1/4種皮、去1/2種皮、完全去除種皮，將處理過的種子進(jìn)行濾紙萌發(fā)試驗(yàn)。

(2)摩擦處理 取兩張砂紙，將種子置于中間，兩張砂紙水平做相對旋轉(zhuǎn)摩擦種子[13]，在盡量保證種胚的完整性的基礎(chǔ)上，使種皮產(chǎn)生一定程度的擦破，處理干凈種皮的碎屑，進(jìn)行濾紙萌發(fā)試驗(yàn)。

(3)熱水處理 在1 L的燒杯中分別用500 mL初溫為40、50、60、70、80、90、100 ℃的7種溫度的水浸泡種子至水溫到達(dá)室溫[14]，浸泡時(shí)用培養(yǎng)皿蓋住，進(jìn)行濾紙萌發(fā)試驗(yàn)。

1.2.3 化學(xué)試劑處理

(1)濃H2SO4處理 將種子放入250 mL的燒杯中，加濃度為98%的濃H2SO4(比重1.84)，用玻璃棒不停攪拌，分別浸種10、20、30、40、50、60、70 min，濃H2SO4處理完后立即取出用流水沖洗10 min[15]，進(jìn)行濾紙發(fā)芽試驗(yàn)。

(2)NaOH處理 將種子放入250 mL的燒杯中，用40%、30%、20%、10%的NaOH[16]溶液分別浸泡20、40、60、80、100、120、140 min，不同濃度、時(shí)間組合處理后立即取出用流水沖洗10 min，進(jìn)行濾紙發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行差異顯著性分析。

吸水率(%)=(吸水前-吸水后)/吸水前×100%；

萌發(fā)率(%)= 種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(%)=發(fā)芽勢天數(shù)內(nèi)正常發(fā)芽種子粒數(shù)/試驗(yàn)種子的總粒數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子活力、吸水率和生物檢測

種子生活力是種子發(fā)芽的潛在能力或種胚具有的生命力，具有生活力的種子不一定都具有發(fā)芽能力，如果種子生活力顯著大于種子發(fā)芽率，說明種子存在休眠現(xiàn)象[10]。TTC染色結(jié)果(圖1f)表明種子生活力為100%，而不做任何處理的完整種子萌發(fā)率為0，種子生活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于發(fā)芽率，說明新采收的地不容種子存在顯著的休眠現(xiàn)象。

圖1 地不容植株、果實(shí)與種子

地不容種子種皮為硬木質(zhì)化(圖1c)，如圖2所示，種子在前6 h內(nèi)快速吸水，6～48 h進(jìn)入緩慢吸水期，48 h后種子含水量達(dá)到飽和，在一定程度上說明，種子不存在吸水障礙問題，種皮有較好的透水性，表明種皮透水性不是引起種子休眠的原因。

圖2 地不容種子吸水率

很多具有休眠性的植物種子都含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)，試驗(yàn)中常常通過測定種子浸提液對小白菜種子發(fā)芽抑制作用來確定種子抑制物質(zhì)的存在與否[17]。為確定地不容種子是否含萌發(fā)抑制物，采用相同的方法測定表明，對照組與地不容種子浸提液對白菜種子萌發(fā)率、胚根長沒有顯著性差異，且根生長形態(tài)和根毛稀疏程度未存在較大差異(表1)，說明種皮中不存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)，進(jìn)一步明確了地不容種子休眠是由種皮機(jī)械束縛導(dǎo)致的。

表1 種皮浸提液對種子萌發(fā)及胚根伸長的影響

2.2 物理處理對種子萌發(fā)的影響

對種皮不同程度的處理，能解除種胚與外界的隔離，增強(qiáng)胚的氣體交換和吸脹能力。由表2可見，在胚根端開小孔，幫助地不容種胚與外界進(jìn)行氣體交換，種子仍不能萌發(fā)。在種子萌發(fā)過程中，去1/4、1/2種皮、完全去除種皮等3種處理后的種子在4～5 d后開始萌發(fā)，且去1/2種皮具有最高的萌發(fā)率，達(dá)96%。方差分析結(jié)果表明：去除1/4、1/2種皮、完全去除種皮之間萌發(fā)率沒有顯著性差異，且去除1/4、1/2種皮、完全去除種皮的種子在14 d 的萌發(fā)率幾乎與28 d的萌發(fā)率相等，說明種皮障礙束縛一旦被破除，種子萌發(fā)就能啟動。結(jié)果表明：種皮透氣性不是引起地不容種子休眠的原因，種皮束縛才可能是導(dǎo)致地不容種子休眠的原因。

表2 不同物理處理對種子萌發(fā)的影響

在種皮機(jī)械束縛導(dǎo)致種子休眠的解除方法中使用機(jī)械摩擦較為普遍，其中砂紙摩擦可以使種皮均勻變薄或者擦破局部種皮，讓種胚失去與外界的隔離以及減少種皮機(jī)械束縛，增強(qiáng)胚的氣體交換和吸脹能力，加快種子萌發(fā)。由表2可見，經(jīng)摩擦處理后地不容種子的萌發(fā)率約達(dá)63.33%，低于人工去種皮，原因可能是砂紙?jiān)谀Σ吝^程中對種胚造成一定程度傷害或摩擦不均勻?qū)е路N胚不能沖破殘留種皮的束縛而萌發(fā)，該結(jié)果也證明種皮束縛是地不容種子萌發(fā)率低的主要限制因素。

高溫處理不僅對種皮具有一定的軟化作用，降低機(jī)械束縛，而且可以溶解種皮內(nèi)的蠟質(zhì)和油脂，增加種皮的透性，以及浸出種子內(nèi)源抑制物等其他原因引起的種子休眠，具有操作方法簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠及效果顯著等優(yōu)點(diǎn)[14]。經(jīng)熱水處理后的種子萌發(fā)率為0(表2)，表明熱水處理對地不容種皮機(jī)械束縛的解除無效果，說明地不容種子可能對高溫敏感，或是地不容種皮的硬實(shí)程度較高，通過高溫?zé)崴能浕圆荒芷瞥菝摺?/p>

2.3 化學(xué)試劑對種子萌發(fā)的影響

用濃H2SO4處理可以腐蝕種皮，使種皮變薄，減少種皮對胚的機(jī)械束縛[19]。種子用濃H2SO4處理20 min后流水沖洗10 min，地不容種子的硬實(shí)骨質(zhì)種皮外層開始脫落，主要是覆蓋背部的小肋橫角質(zhì)部分；處理60 min，種皮完全脫落，種子內(nèi)部完全裸露。種皮與種胚之間有胚乳(圖1d)，其所占比例較小，對胚起到一層膜的保護(hù)作用，在濃H2SO4處理過程中，可在一定程度上防止對種胚造成迅速酸害。由表3可見，處理50 min后，地不容種子開始萌發(fā)，處理60 min時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)88.67%。處理70 min后種子萌發(fā)率不升高反而降低。由此可見，通過濃H2SO4浸種可有效解除種皮束縛進(jìn)而打破地不容種子休眠，但處理時(shí)間過長會對種胚造成一定程度的酸害。

表3 不同化學(xué)試劑及處理時(shí)間對種子萌發(fā)率的影響

NaOH是強(qiáng)堿，有強(qiáng)烈的腐蝕性，對一些種皮薄的種子可以減輕種皮的束縛作用，解除種子休眠。經(jīng)不同濃度NaOH浸泡不同時(shí)間處理的地不容種子，在培養(yǎng)14 、28 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其發(fā)芽勢和萌發(fā)率都為0，表明NaOH處理未能打破種子休眠，對解除地不容種子休眠無效果。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)：經(jīng)NaOH處理、流水沖洗10 min的種子，在萌發(fā)床濾紙上種子周圍逐漸變黑，更換3次濾紙后仍有這種現(xiàn)象。由于地不容種皮具有較好的透性，變黑的原因可能是NaOH溶液滲入種皮內(nèi)部后有殘留，流水不能將其清洗干凈，導(dǎo)致種胚被腐蝕，種子未萌發(fā)，其發(fā)芽勢和萌發(fā)率均為0。

3 討論與結(jié)論

3.1 地不容種子休眠

休眠是種子植物為了種群的生存和發(fā)展，在長期進(jìn)化過程中逐漸演化形成的對不良環(huán)境的有效適應(yīng)機(jī)制。為適應(yīng)不同的脅迫環(huán)境，植物種子進(jìn)化形成了不同的休眠類型及機(jī)制[18]。從生殖發(fā)育看，采用種子播種進(jìn)行地不容育苗需2～3 a后植株才開花，并于當(dāng)年7—9月結(jié)實(shí)。破除休眠的種子在翌年3月才開始萌發(fā)，從果實(shí)成熟到來年種子發(fā)芽需要6～8個(gè)月的時(shí)間，休眠有利于地不容度過不適宜其萌發(fā)和生長的寒冷干燥的冬季。成熟的地不容果實(shí)為鮮艷紅色(圖1b)，是許多鳥類等動物喜愛的食物，利于種子遠(yuǎn)距離傳播。其堅(jiān)實(shí)的種皮有利于動物類過腹后與糞便一起發(fā)酵仍能保證種子在來年更適宜的生長條件下萌發(fā)及生長，成功實(shí)現(xiàn)后代的繁衍，保持物種的延續(xù)[20]。Jerry等[21]在對Nikolaeva[22]休眠分類系統(tǒng)進(jìn)行修訂和完善的基礎(chǔ)上提出了新的分類系統(tǒng)，將種子休眠概括為5種類型，分別是：物理休眠[23-24]、生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠和復(fù)合型休眠[25]。在本研究中，地不容果實(shí)變紅后采收，種胚已發(fā)育完全，有較好的染色率(圖1f)及萌發(fā)率，故不存在胚的形態(tài)休眠；地不容種皮具有較好的透性，也排除由于種皮或果皮的不透氣、不透水從而抑制種子萌發(fā)引起的物理休眠；經(jīng)生物檢測試驗(yàn)說明地不容種皮中也不存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)(表1)，證明地不容堅(jiān)硬的種皮束縛是限制其種子萌發(fā)的主要因素，符合Jerry分類系統(tǒng)中生理休眠的描述：種子種皮能夠透水，種胚也分化完全，但種胚的生理抑制作用阻礙了種子的萌發(fā)；或種胚的生長力較弱，不能突破種皮等包被物的束縛同樣對胚的萌發(fā)具有抑制作用[19]。因此，本研究結(jié)論認(rèn)為：導(dǎo)致地不容種子休眠的主要原因是種皮束縛，破除種皮障礙是解決地不容休眠的主要方式。

3.2 機(jī)械處理對地不容種子萌發(fā)的影響

機(jī)械處理是解決種皮障礙最直接、有效、簡單的方法，包括劃破種皮、摩擦處理和輕輾等[25]，地不容種子由于種皮厚度不均(圖1c)，不宜輕搗或輕輾。伊風(fēng)艷等[26]用砂紙打磨和劃破種皮處理野生黃花苜蓿(Medicagofalcata)種子，使得其發(fā)芽率高達(dá)93%；李欣瑞等[13]經(jīng)過摩擦處理和劃破種皮處理的武陵假儉草(Eremochloaophiuroides)種子，發(fā)芽率分別達(dá)93.33%和88.67%；侯文煥等[27]用沙子研磨菜用黃麻(Corchoruscapsularis)種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該處理也能顯著地提高其發(fā)芽率。在本研究中經(jīng)劃破種皮和摩擦處理過的地不容種子，種子發(fā)芽率都顯著提高，達(dá)96%和63.33%，可見通過以上2種方法處理可有效破壞種皮，減少胚根突破種皮時(shí)受到的機(jī)械阻力，促進(jìn)種子萌發(fā)。但是這兩種種子處理方法效率較低，處理過程中也會誤傷種胚，只適用于處理樣品量少的情況。

3.3 熱水處理對地不容種子萌發(fā)的影響

熱水浸種可軟化種皮，改善種子的透氣性，有利于種子突破種皮障礙，是一種操作簡單、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、效果顯著，且可大量處理種子的方法[27]。在蘇曉敏等[14]研究中用熱水浸種對苦豆子(Sophoraalopecuroides)、金合歡(Acaciafarnesiana)、銀合歡(Leucaenaglauca)、臺灣相思(Acaciaconfusa)、任豆(Zeniainsignis)等5種植物種子解除其休眠的效果極為為顯著，這些種子經(jīng)70 ℃熱水浸種30 min后發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到試驗(yàn)期間的較大值，萌發(fā)率可達(dá)78%、75%、90%、66%、100%，分別為對照萌發(fā)率的2.1倍、4.4倍、3.3倍、3.7倍和8倍；但在其他種子[如百喜草(Paspalumnatatu)、田菁(Sesbaniacannabina)、馬棘(Indigoferapseudotinctoria)、黃槐決明(Cassiasurattensis)]的休眠打破研究中，熱水處理效果并不明顯，甚至導(dǎo)致萌發(fā)率下降，而且在試驗(yàn)中隨著浸種水溫度升高、時(shí)間延長，對種胚損傷嚴(yán)重，腐爛種子數(shù)也有增多。本研究用相似的方法處理地不容種子，熱水處理過后的種子，在試驗(yàn)28 d后其種子仍未萌發(fā)，說明熱水處理對地不容種子萌發(fā)沒有效果，生產(chǎn)中不宜采用。這種無效處理的原因，可能是由于熱水沒有起到軟化種皮的作用或有軟化種皮的作用但對種胚造成一定傷害，其具體原因尚待進(jìn)一步研究。

3.4 化學(xué)試劑處理對地不容種子萌發(fā)的影響

除了物理處理方法外，化學(xué)試劑處理也常常被用于促進(jìn)種子萌發(fā)，高濃度的硫酸和NaOH可以腐蝕局部種皮，促進(jìn)種子萌發(fā)，其中使用濃硫酸最為普遍。岳利軍[29]用濃硫酸預(yù)處理，能提高梭梭(Haloxylonammodendron)、白刺(Nitrariatangutorum)和紅砂(Reaumuriasoongorica)的種子發(fā)芽率。由于植物種皮厚度存在差異，不同物種濃硫酸浸泡時(shí)間也存在差異，如甘肅棘豆(Oxytropiskansuensis)的最佳處理時(shí)間為5 min，甘草(Glycyrrhizauralensis)[30]和地八角(Astragalusbhotanensis)[31]的為20 min，白刺花(Sophoraviciifolia)為25 min[32]。對于地不容種子，用濃硫酸處理時(shí)間達(dá)50 min時(shí)種子開始萌發(fā)，60 min時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)88.67%，70 min后種子萌發(fā)率降低。在其他物種的種皮障礙休眠破除中，NaOH也同樣有效，但效果因物種不同而異，如用10%或20%的NaOH浸種4～10 h，異穗苔草(Carexheterostachya)種子的發(fā)芽率由0提高到90%以上[33]；結(jié)縷草(ZoysiajaponicaSteud)種子用30%NaOH 浸泡20～80 min，種子發(fā)芽率可達(dá)80%，高于對照30%[34]；而黑果枸杞(Lyciumruthenicum)的種子用濃度40%NaOH處理過后，其平均發(fā)芽勢、發(fā)芽率與對照組相比沒有顯著變化[35]。研究發(fā)現(xiàn)堿液浸泡處理種子無法破除休眠的原因，可能是堿液不能破壞種皮中高含量鈣鹽或硅酸鹽的柵狀細(xì)胞或石細(xì)胞，或?qū)δ举|(zhì)化程度極高的細(xì)胞壁的軟化能力有限[36]。本研究中，經(jīng)不同濃度的NaOH不同時(shí)間組合處理的地不容種子，其發(fā)芽勢和萌發(fā)率都為0，未能打破休眠，可能與地不容堅(jiān)硬的種皮使NaOH溶液對其軟化能力有限或浸泡過程中傷害種胚有關(guān)，但其無效機(jī)制還有待研究。本研究通過不同濃硫酸不同時(shí)間處理種子后，經(jīng)種胚形態(tài)和萌發(fā)率的比較分析，確定60 min濃硫酸處理后地不容種子種皮完全脫離，種皮障礙被打破，萌發(fā)率高達(dá)88.67%，可作為打破地不容種子休眠、進(jìn)行其規(guī)?；绲氖走x方法。

綜上所述，本研究確定地不容休眠的主要機(jī)制是種皮障礙，通過摩擦處理、劃破種皮和98%濃H2SO4處理，均可破除地不容種皮束縛，促進(jìn)種子萌發(fā)，不同處理方法的萌發(fā)率最高可達(dá)63.33%、96%、88.67%。其中，機(jī)械處理方法能大幅度提高地不容種子萌發(fā)率，但該方法只適用于少量種子處理。若要處理大量地不容種子，建議采用98%濃H2SO4浸種60 min的方法，種子萌發(fā)效果最好。