基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制Δ

江厚辰，徐逸生，張葆青，肖方駿，陳文治

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120； 2.廣東省中醫(yī)院芳村分院骨傷科，廣東 廣州 510120)

四妙勇安湯記載于《驗(yàn)方新編》[1]，由金銀花、當(dāng)歸、玄參和甘草組成，該方原用于治療火毒內(nèi)盛或寒濕化熱，氣血運(yùn)行不暢，阻滯筋脈所致脫疽，方中金銀花甘寒入心，善于清熱解毒，故重用為君；輔以當(dāng)歸活血和血；玄參清熱滋陰、軟堅(jiān)散結(jié)；甘草清解百毒；雖4味藥，但簡(jiǎn)而力專，共奏清熱解毒、活血散瘀止痛之功?，F(xiàn)代有不少醫(yī)家運(yùn)用四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果亦表明，四妙勇安湯具有抗炎、鎮(zhèn)痛和改善微循環(huán)等作用；且已有臨床研究報(bào)道，四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效確切[2-6]。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)四妙勇安湯作用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的活性物質(zhì)和特定分子機(jī)制的相關(guān)研究，值得深入探討。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法聯(lián)合分子對(duì)接技術(shù)，深入探尋四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為以后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供新的策略和理?yè)?jù)。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯主要活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

分別以四妙勇安湯組方中的全部藥物“金銀花”“玄參”“當(dāng)歸”和“甘草”作為關(guān)鍵詞，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)搜索其化學(xué)成分，并調(diào)定類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18和口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%作為初篩參數(shù)，隨后逐一收集活性成分的蛋白靶點(diǎn)，再利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)和perl軟件對(duì)蛋白靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)注釋化并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，即得到藥物的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶標(biāo)的獲取

將“gout arthritis”作為關(guān)鍵詞，搜索GeneCards、人類孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM)、PharmGkb、DrugBank和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database，TTD)等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并將得到的疾病靶點(diǎn)與所有藥物靶點(diǎn)利用R×64 4.0.3語(yǔ)言軟件取交集，繪制相應(yīng)的韋恩圖，獲取二者的共同靶點(diǎn)基因，將其定為四妙勇安湯作用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)。

1.3 “活性成分-核心靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

把收集得到的四妙勇安湯藥物靶標(biāo)和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶標(biāo)整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制“活性成分-核心靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點(diǎn)(node)的類型有藥物活性成分和靶點(diǎn)，活性成分與核心靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系則用每條邊(edge)來(lái)表示，節(jié)點(diǎn)的大小代表鄰接點(diǎn)數(shù)目的多少，用Degree來(lái)表示，Degree值越大，代表其介導(dǎo)的生物功能越繁多，相互聯(lián)系越緊密。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein Interaction，PPI)關(guān)系的建立與核心基因的篩選

將已獲得的藥物與疾病的共同靶點(diǎn)基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，最小互作分?jǐn)?shù)值(combined score)為0.4，隱藏圖中孤立的蛋白質(zhì)，輸出PPI網(wǎng)絡(luò)圖的圖片文件與文本文件，將文本文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，并利用Cytoscape軟件里的CytoNCA插件計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的分值，把所有分值較高的節(jié)點(diǎn)再次進(jìn)行構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，從而篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.5 四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

運(yùn)用R語(yǔ)言軟件將藥物與疾病的共同靶標(biāo)基因名稱轉(zhuǎn)換成特定的基因ID，篩選條件設(shè)定為P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GO中具有生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能3種類別的基因功能注釋，各篩選出前10個(gè)功能富集分析結(jié)果；同樣設(shè)定P<0.05為篩選條件，并挑選出前30個(gè)KEGG通路富集分析結(jié)果，分別繪制相對(duì)應(yīng)的柱狀圖。

1.6 四妙勇安湯主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接分析

在PubChem在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索出四妙勇安湯中活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，采用Chem3D 19.0軟件將小分子配體的2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)?D結(jié)構(gòu)，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化；在PDB在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)(https://www1.rcsb.org/)中搜索出藥物核心靶點(diǎn)蛋白受體，通過(guò)PyMOLWin軟件去除蛋白受體結(jié)構(gòu)的水分子，將其導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6軟件作加氫離子等處理；運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)其活性成分的受體與配體進(jìn)行匹配，分析其結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1 四妙勇安湯中主要藥效成分及靶點(diǎn)的采集

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，從TCMSP中檢索到與四妙勇安湯相關(guān)的所有化學(xué)成分共有126個(gè)，其中當(dāng)歸2個(gè)，金銀花23個(gè)，玄參9個(gè)，甘草92個(gè)，刪除重復(fù)成分，共得到化學(xué)成分120個(gè)；其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共5 531個(gè)，其中當(dāng)歸879個(gè)，金銀花1 647個(gè)，玄參499個(gè)，甘草2 506個(gè)，通過(guò)Unipot數(shù)據(jù)庫(kù)和perl軟件對(duì)蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)注釋化并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，篩選得到的靶點(diǎn)共231個(gè)。

2.2 “四妙勇安湯-痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎”共同靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)OMIM、GeneCards、PharmGkb、DrugBank和TTD等5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)整合得到痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)共252個(gè)，利用R語(yǔ)言軟件將痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶標(biāo)與四妙勇安湯靶標(biāo)取交集，得到“中藥-疾病”共同靶點(diǎn)的韋恩圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，“四妙勇安湯-痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎”共同靶標(biāo)有38個(gè)，其中痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶標(biāo)252個(gè)，四妙勇安湯相關(guān)靶點(diǎn)231個(gè)。

圖1 四妙勇安湯-痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the common targets of Simiao Yong’an decoction-gout arthritis

2.3 “活性成分-核心靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化的構(gòu)建

“活性成分-核心靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2，圖中共有134個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中來(lái)源于基因的有38個(gè)，來(lái)源于化合物的有96個(gè)；正方形為核心靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，圓形為活性成分節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)面積大小與節(jié)點(diǎn)度值呈正相關(guān)。分析每個(gè)成分的Degree值，較高的有槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮苷(naringenin)和木犀草素(luteolin)等，可能為治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中較為重要的有效成分。

圖2 “活性成分-核心靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Regulatory network of “active components -core targets”

2.4 “四妙勇安湯-痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎”靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因的預(yù)測(cè)

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見(jiàn)圖3。

圖3 “四妙勇安湯-痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎”靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of “Simiao Yong’an decoction-gout arthritis”

圖中的節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)；邊表示靶點(diǎn)之間的聯(lián)系強(qiáng)度，2個(gè)蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)程度越強(qiáng)則線條越粗。通過(guò)插件CytoNCA計(jì)算出每個(gè)節(jié)點(diǎn)的分值，并挑選分值較高的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行再次構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，最終篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因有CXCL8、PTGS2、MAPK3、TNF、IL-1β、CCL2、MAPK1和HMOX1，上述核心基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，見(jiàn)圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因分析Fig 4 Analysis on PPI network core genes

2.5 四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

在GO功能富集分析中，共確定了1 576個(gè)GO條目，其中生物學(xué)過(guò)程1 450個(gè)，細(xì)胞成分19個(gè)，分子功能107個(gè)，主要涉及磷酸酶的結(jié)合、MAP激酶活性及類固醇激素受體活性等，見(jiàn)圖5。通過(guò)KEGG通路富集分析確定了45條相關(guān)信號(hào)通路，根據(jù)P值(P<0.05)與富集數(shù)目選取了前30個(gè)KEGG通路，主要涉及IL-17信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和Toll樣受體等信號(hào)通路，見(jiàn)圖6。IL-17信號(hào)通路圖見(jiàn)圖7。

圖5 四妙勇安湯活性成分的GO功能富集分析柱狀圖Fig 5 Histogram of GO functional enrichment analysis on active components of Simiao Yong’an decoction

圖6 四妙勇安湯活性成分的KEGG通路富集分析柱狀圖Fig 6 Histogram of KEGG functional enrichment analysis on active components of Simiao Yong’an decoction

圖7 四妙勇安湯干預(yù)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的IL-17信號(hào)通路圖Fig 7 IL-17 signaling pathway of Simiao Yong’an decoction in the intervention of gout arthritis

2.6 四妙勇安湯主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接分析

選取四妙勇安湯主要活性化合物中Degree>9的槲皮素、山柰酚、柚皮苷和木犀草素4個(gè)主要化學(xué)成分，分別與位于前3位的核心基因靶點(diǎn)PTGS2、NOS2和PPARG進(jìn)行分子對(duì)接，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚、柚皮苷和木犀草素與PTGS2、NOS2和PPARG的結(jié)合能均≤-20.93 kJ/mol，展現(xiàn)出了良好的結(jié)合力，見(jiàn)圖8。

表1 主要活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能Tab 1 Binding energy between main active components and core targets

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是一種由單鈉尿酸鹽(MSU)沉積在關(guān)節(jié)囊、軟骨、骨質(zhì)或其他組織而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，但目前尚無(wú)西藥能夠根治痛風(fēng)，且不良反應(yīng)較多，限制了這些藥物在臨床中的使用[7]。中醫(yī)藥在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療中積累了不少行之有效的方藥，由于中藥成分的復(fù)雜性，研究其作用機(jī)制有一定的困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索基礎(chǔ)上，并運(yùn)用軟件對(duì)藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的一門(mén)技術(shù)[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能較好地體現(xiàn)方藥與疾病之間相互作用的系統(tǒng)性和整體性，尤其適用于分析中藥復(fù)方與機(jī)體對(duì)疾病調(diào)控的復(fù)雜作用關(guān)系，因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法聯(lián)合分子對(duì)接技術(shù)，探討四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)及信號(hào)通路，探索潛在分子作用機(jī)制，為后續(xù)臨床療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選提供研究方向。

本研究通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和構(gòu)建“活性成分-核心靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖后發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、柚皮苷和木犀草素等為四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要成分。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病主要是由于MSU沉積于關(guān)節(jié)，已有研究結(jié)果表明，槲皮素對(duì)MSU誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有強(qiáng)大的抗炎鎮(zhèn)痛作用[9-11]，且能用于治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[12]。Ruiz-Miyazawa等[9]在小鼠注射MSU后的1～24 h內(nèi)，同時(shí)用槲皮素治療小鼠，觀察24 h后小鼠的機(jī)械性痛覺(jué)并測(cè)量膝關(guān)節(jié)內(nèi)白細(xì)胞的募集、氧化應(yīng)激以及炎癥小體mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果提示，槲皮素能抑制MSU誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)度反應(yīng)、白細(xì)胞募集和炎癥小體的激活，降低炎癥組分mRNA的表達(dá)，從而達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的效果。一項(xiàng)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索三妙丸治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，山柰酚也是抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心化合物之一[13]。沈瑞明等[14]采用60只大鼠行隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在大鼠踝關(guān)節(jié)腔注射一定濃度的MSU建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，測(cè)定不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)以及血清和滑膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)木犀草素可通過(guò)下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB途徑減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果提示，四妙勇安湯的有效成分可能通過(guò)上述途徑發(fā)揮抗炎功能，在其治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著一定作用。

A.山奈酚-CXCL8；B.木犀草素-PTGS2；C.槲皮素-PTGS2；D.槲皮素-MAPK3A.kaempferol-CXCL8; B.lignan-PTGS2; C.quercetin-PTGS2; D.quercetin-MAPK3圖8 “活性成分-核心靶點(diǎn)”分子對(duì)接圖Fig 8 Molecular docking diagram of “active ingredient-core target”

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測(cè)到CXCL8、PTGS2、TNF、IL-1β、MAPK3、CCL2、MAPK1和HMOX1等8個(gè)核心靶基因。其中CXCL8的主要生物功能是吸附和激活中性粒細(xì)胞，被激活的中性粒細(xì)胞會(huì)定向游走到特定的反應(yīng)部位，同時(shí)釋放出一系列活性物質(zhì)，從而導(dǎo)致機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)[15]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，無(wú)論是在痛風(fēng)的急性期或間歇期，CXCL8水平均會(huì)升高，并且與特定的循環(huán)蛋白質(zhì)相組合，但具體機(jī)制尚未明確[16]。環(huán)氧合酶2(PTGS2或COX-2)是一種誘導(dǎo)酶，在組織損傷、炎癥反應(yīng)時(shí)表達(dá)增強(qiáng)，其介導(dǎo)的花生四烯酸代謝在人類炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用[17]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎進(jìn)入慢性期，以痛風(fēng)石的形成、骨破壞為病理特征。相關(guān)研究結(jié)果顯示，TNF-α能激活NF-κB信號(hào)通路，而且能促使單核巨噬細(xì)胞分泌IL-8、IL-6等炎癥因子，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)的進(jìn)程；同時(shí)，NF-κB受體活化因子與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的骨破壞發(fā)生機(jī)制的關(guān)系也非常密切[18]。IL-1β是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，主要發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)功能和內(nèi)分泌效應(yīng)，近年來(lái)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道IL-1β基因表達(dá)的變異與關(guān)節(jié)炎的遺傳密切相關(guān)[19]。通過(guò)本研究可推測(cè)，四妙勇安湯的有效成分極有可能通過(guò)作用于CXCL8、PTGS2、TNF和IL-1β等4個(gè)核心靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎及預(yù)防骨質(zhì)破壞功能，從而干預(yù)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)程；MAPK3、CCL2、MAPK1和HMOX1等4個(gè)核心靶點(diǎn)與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系尚缺乏相關(guān)研究，可作為今后實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯活性成分作用靶點(diǎn)主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括對(duì)細(xì)菌源分子的應(yīng)答、對(duì)脂多糖的反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；參與的相關(guān)細(xì)胞成分主要有細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)區(qū)等；活性成分作用靶點(diǎn)參與的分子功能主要涉及磷酸酶的結(jié)合、MAP激酶活性及類固醇激素受體活性等。體現(xiàn)了四妙勇安湯的活性成分通過(guò)多途徑、多組分和多靶點(diǎn)發(fā)揮治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，四妙勇安湯作用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)主要涉及到IL-17信號(hào)通路、NOD樣受體、Toll樣受體信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等信號(hào)通路。其中頻率最高的通路為IL-17信號(hào)通路，IL-17是關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，與多種自身免疫性疾病相關(guān)。有研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與IL-17的表達(dá)密切相關(guān)[20]。Liu等[21]的研究結(jié)果顯示，在痛風(fēng)癥狀發(fā)作早期，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清IL-17水平顯著升高，并隨著癥狀減輕而逐漸降低，相關(guān)分析表明，IL-17的表達(dá)與疾病的活動(dòng)性呈正相關(guān)，并確定IL-17是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的新生物標(biāo)志物。本研究為了探討四妙勇安湯作用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)所涉及的通路進(jìn)行了KEGG分析，得出相似的結(jié)論，IL-17信號(hào)通路富集程度較高，并對(duì)該通路進(jìn)一步分析，由通路圖(見(jiàn)圖7)可知，活性成分通過(guò)影響NF-κB、MAPK和ERK等信號(hào)通路從而激活I(lǐng)L-17通路，推測(cè)四妙勇安湯的有效成分很可能是通過(guò)聯(lián)合調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK和ERK等共同影響IL-17通路從而治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎?，F(xiàn)代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)NOD樣受體3介導(dǎo)，抑制NF-κB信號(hào)通路，能有效改善MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[22]。一項(xiàng)有關(guān)電針對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織Toll樣受體2(TLR2)信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針可緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀，這可能與調(diào)節(jié)TLR2信號(hào)通路中Y-TRI和MYD88的蛋白表達(dá)相關(guān)[23]。結(jié)合本研究結(jié)果可推測(cè)，四妙勇安湯主要通過(guò)影響IL-17信號(hào)通路、NOD樣受體、Toll樣受體信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路，通過(guò)減少M(fèi)SU在關(guān)節(jié)囊、軟骨、骨質(zhì)或其他組織的沉積所致炎癥反應(yīng)以及下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮干預(yù)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。

分子對(duì)接逐漸成為計(jì)算機(jī)輔助藥物研究的一項(xiàng)重要技術(shù)，主要用來(lái)研究分子間(配體和受體)相互作用，并模擬分子間的結(jié)合模式并計(jì)算其親和力[24-25]。本研究結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的分子作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)四妙勇安湯中4個(gè)核心活性化合物與核心靶點(diǎn)CXCL8、PTGS2和MAPK3結(jié)合后均展現(xiàn)出良好的親和力，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大[26]。以結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol作為標(biāo)準(zhǔn)，將四妙勇安湯的主要活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果顯示，其主要活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均<-20.93 kJ/mol，特別是槲皮素、木犀草素與PTGS2、MAPK3靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合力，進(jìn)一步驗(yàn)證了槲皮素、木犀草素極有可能為四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在藥效成分。

綜上所述，本研究初步預(yù)測(cè)了四妙勇安湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的活性成分-核心靶點(diǎn)作用機(jī)制，分析了核心靶點(diǎn)的功能及相關(guān)的信號(hào)通路，并完成了核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接，初步驗(yàn)證了部分作用機(jī)制。但是，由于本研究?jī)H基于文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘?qū)λ拿钣掳矞深A(yù)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在作用機(jī)制進(jìn)行推斷，具有一定的局限性，有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。