基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討山慈菇治療乳腺癌的分子機(jī)制Δ

房立源，馮 雪，李慧杰，王志鵬，李秀榮#

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250014； 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濟(jì)南250014)

全球惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年乳腺癌在全球的發(fā)病率為11.6%，其發(fā)病率、死亡率在女性腫瘤中居首位，分別為24.2%、15.0%，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。國(guó)家癌癥中心發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2015年我國(guó)乳腺癌發(fā)病率為17.10%，居女性腫瘤發(fā)病率之首，發(fā)病患者數(shù)約為30.4萬(wàn)例[2]。近年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高和年輕化的趨勢(shì)[3-4]。乳腺癌早期的臨床癥狀多表現(xiàn)為乳房腫塊，質(zhì)硬，與周圍組織有粘連；中晚期多表現(xiàn)為乳頭內(nèi)陷，乳房皮膚呈現(xiàn)“橘皮樣”外觀，并伴有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移。目前，乳腺癌的治療方式主要有外科手術(shù)、放療、化療、分子靶向、內(nèi)分泌、免疫及中醫(yī)藥等綜合治療模式。近年來(lái)，中醫(yī)藥成為乳腺癌治療中的重要組成部分并涵蓋其各治療階段。中醫(yī)藥治療乳腺癌的療效可靠，尤其是在減毒增效、預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[5-6]、防治腫瘤及治療相關(guān)并發(fā)癥[7-8]和提高患者生活質(zhì)量[9-10]等方面得到了越來(lái)越多的認(rèn)可和支持。山慈菇味甘、微辛，性涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)的功效，主要用于癰腫疔毒等[11]。目前，山慈菇在臨床上被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療，涉及乳腺癌、肝癌和肺癌等[12-15]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接技術(shù)逐漸成為新型的疾病-藥物預(yù)測(cè)模型。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法收集山慈菇的活性成分和靶點(diǎn)，分析預(yù)測(cè)其作用于乳腺癌的潛在機(jī)制，驗(yàn)證活性成分和核心靶點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度，以期為山慈菇在臨床上的廣泛使用提供更多有價(jià)值的參考。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 山慈菇成分收集和篩選：在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www. uniprot.org /uniprot/)中獲取山慈菇的活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)。篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。

1.1.2 山慈菇和乳腺癌作用靶點(diǎn)的獲取：以“Breast Cancer”為關(guān)鍵詞，通過(guò)GeneCards(https://www.genecards.org/)、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM)(https://www. omim.org/)和毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(kù)(comparative toxicogenomics database，CTD)(https://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索并篩選乳腺癌相關(guān)的作用基因。利用Venny 2.1在線工具進(jìn)行山慈菇作用靶點(diǎn)和乳腺癌靶點(diǎn)的映射并繪制韋恩圖，交集基因作為山慈菇治療乳腺癌的重要靶點(diǎn)。

1.1.3 山慈菇活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將山慈菇的活性成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.1軟件，構(gòu)建“山慈菇-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。其網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)或活性成分，邊表示兩者之間具有相互作用。

1.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將山慈菇作用靶點(diǎn)和乳腺癌疾病靶點(diǎn)交集部分輸入至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，選擇物種為“Homo sapiens”進(jìn)行下一步操作，設(shè)定相互作用閥值為“medium confidence=0.4”，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選：運(yùn)用Cytoscape Version 3.7.1軟件對(duì)“1.1.4”項(xiàng)下獲得的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jì)算網(wǎng)絡(luò)圖整體的中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和點(diǎn)度中心性(degree centrality，DC)，以BC、CC和DC的平均數(shù)為“閾值”，選取BC、CC和DC同時(shí)在閾值之上的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析：通過(guò)R語(yǔ)言把山慈菇-乳腺癌的共有靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化成entrez ID，加載“BiocManager”“clusterProfiler”等程序包，運(yùn)行R語(yǔ)言獲得GO功能富集分析和KEGG通路富集的氣泡圖。最后運(yùn)用Perl語(yǔ)言把entrez ID轉(zhuǎn)換為基因靶點(diǎn)信息。根據(jù)生物過(guò)程分析和通路富集結(jié)果，對(duì)山慈菇治療乳腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

1.1.7 中藥活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接：選取山慈菇的主要活性成分與核心靶蛋白進(jìn)行活性成分與核心靶蛋白的分子對(duì)接。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載化合物的結(jié)構(gòu)，并保存為mol2格式。利用PYMOL軟件對(duì)靶蛋白進(jìn)行除水除配體，利用AutoDock 1.5.6軟件將活性成分及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后運(yùn)行Auto Dock vina進(jìn)行對(duì)接，再使用PyMOL對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化[16]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物和靶標(biāo)之間結(jié)合能<-20.93 kJ/mol被認(rèn)為具有較好作用[17]。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞：人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司。

1.2.2 儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；DMi1型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FD-1 A-50型真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2.3 藥品與試劑：山慈菇(購(gòu)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)，制備成3 g/ml的山慈菇水煎液。DMEM培養(yǎng)液(德國(guó)Lonza公司)；胎牛血清、青霉素和鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)；噻唑藍(lán)(MTT)(北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況：將人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔100 μl，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸除原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入90、180、360和720 mg/ml山慈菇水煎劑，對(duì)照組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液，空白組不接種細(xì)胞。全部置于培養(yǎng)箱中48 h，用4 ℃的0.9%氯化鈉溶液洗2次，加入0.5 mg/ml的MTT溶液100 μl，避光，孵育4 h，加入二甲基亞砜150 μl，繼續(xù)避光，振搖15 min后上機(jī)檢測(cè)，于490 nm處檢測(cè)吸光度(A)，重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

2 結(jié)果

2.1 山慈菇有效成分的篩選

將山慈菇輸入到TCMSP和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，共檢索到山慈菇的3個(gè)活性成分，70個(gè)作用靶點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 山慈菇活性成分Tab 1 Active ingredients of iphigenia indica

2.2 乳腺癌作用靶點(diǎn)的獲取

以“Breast Cancer”為關(guān)鍵詞在Gene Cards、OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索內(nèi)容，利用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去重，最終尋找到乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)基因364個(gè)。

2.3 藥物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape Version 3.7.1軟件構(gòu)建“山慈菇-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中共有74個(gè)節(jié)點(diǎn)，423條相互作用的邊，見(jiàn)圖1。

圖1 “山慈菇-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of “iphigenia indica-active ingredients-targets”

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將山慈菇相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)映射到乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，2個(gè)網(wǎng)絡(luò)中交集基因共有14個(gè)，即認(rèn)為這是山慈菇治療乳腺癌的可能作用靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，14個(gè)靶蛋白發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，共產(chǎn)生32條蛋白質(zhì)相互作用的邊，見(jiàn)圖2—3。

圖2 韋恩圖Fig 2 Venny diagram

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)Cytoscape Version 3.7.1計(jì)算得到，PPI網(wǎng)絡(luò)中BC平均數(shù)為2，CC平均數(shù)為0，DC平均數(shù)為0.482，將節(jié)點(diǎn)的BC、CC和DC均大于其平均數(shù)的節(jié)點(diǎn)基因作為核心靶基因，共篩選出核心靶點(diǎn)基因7個(gè)，其中比較重要的為PTGS2、JUN、ESR1和NOS3。關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖4，圖中節(jié)點(diǎn)大小表示度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大對(duì)應(yīng)的度值越大，邊的粗細(xì)表示合并分?jǐn)?shù)，邊越粗提示合并分?jǐn)?shù)越大，表示該節(jié)點(diǎn)蛋白與其他節(jié)點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)越廣泛。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Network diagram of core target

2.6 生物通路及富集分析

2.6.1 GO功能富集分析：運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)14個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能富集分析，共有475條GO數(shù)據(jù)(P<0.05)。其中生物學(xué)過(guò)程條目最多，共有420個(gè)，主要集中在對(duì)類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)展(reproductive structure development)和生殖系統(tǒng)發(fā)育(reproductive system development)；分子功能相關(guān)條目有51個(gè)，主要涉及核受體活性(nuclear receptor activity)、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)和類固醇結(jié)合(steroid binding)；細(xì)胞組成相關(guān)條目有4個(gè)，主要涉及細(xì)胞器外膜(organelle outer membrace)和外膜支架(outer membrace)等，見(jiàn)圖5—7。

圖5 生物學(xué)過(guò)程GO功能富集分析Fig 5 GO function enrichment analysis of biological process

圖6 細(xì)胞組成GO功能富集分析Fig 6 GO function enrichment analysis of cell component

圖7 分子功能GO功能富集分析Fig 7 GO function enrichment analysis of molecular function

2.6.2 KEGG通路富集分析：運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)14個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行代謝通路富集分析，共獲得23條通路(P<0.05)。山慈菇治療乳腺癌主要涉及雌激素信號(hào)通路(estrogen signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)和乳腺癌(breast cancer)等通路，見(jiàn)圖8。

圖8 KEGG通路富集分析Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

山慈菇中活性成分與靶標(biāo)的結(jié)合能信息見(jiàn)表2，具體對(duì)接過(guò)程見(jiàn)圖9—10。分子對(duì)接過(guò)程充分說(shuō)明，山慈菇中活性成分與乳腺癌的核心基因靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合能力。

表2 分子對(duì)接結(jié)果Tab 2 Result of molecular docking

A.PTGS2；B.JUN；C.ESR1；D.NOS3A.PTGS2；B.JUN；C.ESR1；D.NOS3圖9 β-谷甾醇與靶點(diǎn)的分子對(duì)接Fig 9 Molecular docking of beta-sitosterol with targets

2.8 山慈菇對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，90 mg/ml的山慈菇水煎液A組細(xì)胞存活率為92.25%，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。其他質(zhì)量濃度的山慈菇水煎液對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有不同程度的抑制作用，且表現(xiàn)出細(xì)胞存活率與質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)性的趨勢(shì)。

表3 山慈菇水煎液對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響Tab 3 Effects of water extract of iphigenia indica on proliferation of breast cancer cells n=96)

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)山慈菇對(duì)乳腺癌的可能作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)山慈菇共有3個(gè)活性成分，作用于70個(gè)藥物靶點(diǎn)。其中豆甾醇和β-谷甾醇是山慈菇治療乳腺癌的主要化合物。現(xiàn)代研究結(jié)果表明，山慈菇發(fā)揮抑制腫瘤增殖的作用與干預(yù)IL-6等炎癥因子釋放、改善腫瘤微環(huán)境有關(guān)[18]。山慈菇中的豆甾醇可通過(guò)調(diào)控凋亡基因表達(dá)，阻斷惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[19-20];β-谷甾醇可阻滯惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，并觸發(fā)凋亡性死亡[21]。

A.PTGS2；B.JUN；C.ESR1；D.NOS3A.PTGS2；B.JUN；C.ESR1；D.NOS3圖10 豆甾醇與靶點(diǎn)的分子對(duì)接Fig 10 Molecular docking of stigmasterol with targets

對(duì)山慈菇與乳腺癌的共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射，并構(gòu)建核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，出現(xiàn)頻次較高的關(guān)鍵靶點(diǎn)有4個(gè)，分別為PTGS2、JUN、ESR1和NOS3，可作為潛在治療靶點(diǎn)。前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2/COX-2)在腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。研究結(jié)果表明，COX-2在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中處于活躍狀態(tài)，且高表達(dá)的COX-2常提示患者不良預(yù)后[22-23]。化合物豆甾醇和β-谷甾醇能夠抑制COX-2的表達(dá)，進(jìn)而在乳腺癌的治療中發(fā)揮效能[24]。ER是乳腺癌內(nèi)分泌治療的重要靶點(diǎn)之一，其中ERα蛋白由ESR1基因編碼，與乳腺癌關(guān)系最為密切[25-26]?；A(chǔ)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晚期乳腺癌患者中ESR1突變率高，對(duì)內(nèi)分泌治療效果較差，常聯(lián)合中醫(yī)藥輔助治療，效果顯著[27-28]。郭淳等[29]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山慈菇水煎劑對(duì)ER陽(yáng)性的Luminal型乳腺癌細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。一氧化氮合酶(NOS)能夠催化產(chǎn)生一種重要的信號(hào)調(diào)節(jié)因子(一氧化氮)。NOS在乳腺癌中表達(dá)增多，推動(dòng)了腫瘤血管生成、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[30]。Pandith等[31]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能明顯減少COX-2和NOS mRNA的表達(dá)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，山慈菇治療乳腺癌涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，主要集中在對(duì)類固醇激素的結(jié)合和反應(yīng)；代謝通路富集分析表明，關(guān)鍵靶點(diǎn)富集在雌激素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路和乳腺癌等通路。從分子對(duì)接結(jié)果可知，豆甾醇和β-谷甾醇與PTGS2、JUN、ESR1和NOS3的結(jié)合能均<-20.93 kJ/mol，說(shuō)明山慈菇與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性。最后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，山慈菇水煎液對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著濃度的提升，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用逐漸增強(qiáng)。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對(duì)接技術(shù)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)山慈菇抗乳腺癌的作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步探索。山慈菇中的主要化合物豆甾醇和β-谷甾醇，可能以PTGS2、JUN、ESR1和NOS3為主要結(jié)合靶點(diǎn)，通過(guò)癌癥途徑、雌激素信號(hào)通路等發(fā)揮抗腫瘤作用，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)山慈菇對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，充分體現(xiàn)了中藥抗腫瘤具有多成分、多靶點(diǎn)和多層次的特點(diǎn)。但本研究仍存在一些不足之處，數(shù)據(jù)庫(kù)不能完全包括藥物所有的化學(xué)成分及其相應(yīng)的靶點(diǎn)，且化學(xué)生物學(xué)方法本身也具有一定的局限性。