女性生殖道微生物群與女性不孕癥的研究進展

奚方修越，章翊，孫寧霞

隨著基因第二代測序(NGS, next-generation sequencing)技術(shù)的興起，通過對微生物16S rRNA基因的測序，深度分析微生物群成分及研究微生物群與人體生理功能、疾病病理的關(guān)聯(lián)取得了新進展。定植于人體的微生物群能夠幫助機體對抗病原體的入侵，促進免疫系統(tǒng)和代謝通路的成熟及合成多種必需的維生素等，而人類微生物群紊亂也可能導致某些疾病的發(fā)生發(fā)展，如炎癥性腸病、肥胖和2型糖尿病等。陰道微生物群是目前研究最為廣泛的女性生殖道微生物群，由種類豐富的厭氧菌和需氧菌構(gòu)成。傳統(tǒng)觀點認為生理狀態(tài)下女性上生殖道中沒有微生物的定植，但現(xiàn)在這個觀點被新的研究結(jié)果徹底推翻。研究表明，通過聯(lián)合應用16S rRNA基因測序和微生物培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)女性的陰道、子宮頸管、宮腔、輸卵管以及腹水中均存在微生物定植，且女性生殖道各個解剖部位定植微生物群并不完全相同。女性生殖道微生物群紊亂與不孕癥、輔助生殖結(jié)局等的相關(guān)性也取得了重要發(fā)現(xiàn)。

1 女性生殖道微生物群

2012年，人類微生物組計劃(HMP, Human Microbiome Project)指出陰道微生物群占據(jù)人體總微生物群的9%，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)是其中最具代表性的細菌，其他代表性的細菌包括普氏菌屬(Prevotella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、加德納菌屬(Gardnerella)、奇異菌屬(Atopobium)、巨球型菌屬(Megasphaera)、纖毛菌屬(Sneathia)和厭氧球菌屬(Anaerococcus)。女性下生殖道微生物群的構(gòu)成不僅受年齡和性激素的影響，還與人種、基因、地理以及社會環(huán)境因素相關(guān)，衛(wèi)生習慣、性行為、性伴侶以及避孕用品的使用情況也可能導致女性下生殖道微生物群構(gòu)成的改變。

Ravel J等[1]對396名育齡期女性的陰道分泌物進行16S rRNA基因測序，將女性陰道微生物群落分為5種群落類型(CST, community state types)，其中CST-Ⅰ、CST-Ⅱ、CST-Ⅲ、CST-Ⅴ分別是由卷曲乳酸桿菌(Lactobacilluscrispatus)(26.2%)、格氏乳酸桿菌(Lactobacillusgasseri)(6.3%)、惰性乳酸桿菌(Lactobacillusiners)(34.1%)和詹氏乳酸桿菌(Lactobacillusjensenii)(5.3%)作為優(yōu)勢菌種，CST Ⅳ的優(yōu)勢菌群不是乳酸桿菌，而是專性厭氧菌，如奇異菌屬、小類桿菌屬(Dialister)、加德納菌屬、巨球型菌屬、普氏菌屬和不解糖嗜胨菌屬(Peptoniphilus)，其中CST Ⅳ-A成分包括乳酸桿菌和專性厭氧菌，CST Ⅳ-B則是由奇異菌屬、普氏菌屬、纖毛菌屬(Sneathia)、加德納菌屬等構(gòu)成。Albert AY等[2]對310名女性的陰道樣本測序發(fā)現(xiàn)陰道微生物CST Ⅳ還存在分別由加德納菌屬亞群A(CST Ⅳ-C)和加德納菌屬亞群C(CST Ⅳ-D)作為優(yōu)勢菌屬的類型。這些女性陰道微生物群落是呈動態(tài)變化的，各種CST之間可以相互轉(zhuǎn)變，但這些轉(zhuǎn)變并不是同等概率出現(xiàn)的，如CST Ⅳ-B常轉(zhuǎn)變?yōu)镃ST-Ⅲ，很少轉(zhuǎn)變?yōu)镃ST-Ⅰ，CST-Ⅰ常轉(zhuǎn)變?yōu)镃ST-Ⅲ或CST Ⅳ-A，同時在自然狀態(tài)下群落轉(zhuǎn)變的持續(xù)時間短暫，其中35%持續(xù)時間不超過1周[3]。

盡管子宮頸管直接與陰道環(huán)境接觸，但在其中檢測到的菌群與陰道中的并不完全相同，主要是乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和鏈球菌科(Streptococcaceae)。而Winters AD等[4]對25名女性進行宮頸拭子16S rRNA基因測序，發(fā)現(xiàn)宮頸中最常見的微生物是不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、管道桿菌屬(Cloacibacterium)和叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)。

子宮內(nèi)膜在女性生殖功能中起著關(guān)鍵性作用。Mitchell CM等[5]分析對比58名女性子宮切除前陰道和子宮切除后離體子宮宮腔中的菌群構(gòu)成，在95%的宮腔樣本中發(fā)現(xiàn)細菌的定植，最常見的細菌屬種是惰性乳酸桿菌，其次是普氏菌屬和卷曲乳酸桿菌，同時發(fā)現(xiàn)宮腔中細菌菌群含量要明顯小于陰道中的菌群含量。在育齡期女性宮腔積液的研究中，發(fā)現(xiàn)宮腔積液中含量最豐富的細菌同樣為乳酸桿菌屬，且宮腔積液中的微生物群結(jié)構(gòu)不受女性性激素的調(diào)控[6]。但是Pelzer ES等[7]通過對子宮內(nèi)膜搔刮組織進行焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜微生物群結(jié)構(gòu)在月經(jīng)周期不同階段存在差異，分泌期普氏菌含量增加，而增殖期纖毛菌(Sneathiaspp.)和乳酸桿菌含量增加。關(guān)于乳酸桿菌屬是否為子宮內(nèi)膜微生物群中的“核心”菌屬存在爭議。Winters AD等[4]的研究認為子宮內(nèi)膜的主要微生物與宮頸相似，為不動桿菌屬、假單胞菌屬、管道桿菌屬和叢毛單胞菌科。

Pelzer ES等[8]應用微生物培養(yǎng)及NGS技術(shù)對16名女性輸卵管樣本進行分析，證實了女性輸卵管存在微生物群定植，主要是葡萄球菌(Staphylococcusspp.)、腸球菌(Enterococcusspp.)和乳酸桿菌，其他常見的菌群包括假單胞菌、伯克霍爾德菌(Burkholderiaspp.)、丙酸桿菌(Propionibacteriumspp.)和普氏菌，其中右側(cè)輸卵管主要是葡萄球菌，左側(cè)輸卵管主要是乳酸桿菌、腸球菌和普氏菌，且絕經(jīng)前女性和絕經(jīng)后期女性輸卵管定植的微生物群存在差異，表明性激素可能對女性上生殖道微生物群定植存在調(diào)控作用。卵巢組織中同樣存在微生物。Pelzer ES等[9]對71名接受輔助生殖治療的女性的取卵時所獲取的卵泡液進行微生物培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)卵泡液中同樣存在微生物定植，包括惰性乳酸桿菌、放線菌(Actinomycesspp.)、金色棒狀桿菌(Corynebacteriumaurimucosum)、梭形桿菌(Fusobacteriumspp.)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)、消化鏈球菌(Peptostreptococcusspp.)、丙酸桿菌(Propionibacteriumspp.)、普氏菌、葡萄球菌和近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis)，左側(cè)卵巢卵泡中定植微生物生物量較右側(cè)多。

但是胎盤中是否存在微生物群定植目前仍存在爭議。2014年Aagaard K等[10]首先報道，在對320個胚胎組織應用16S rRNA基因測序和全基因組鳥槍(WGS, whole-genome shotgun)測序技術(shù)分析后，發(fā)現(xiàn)胎盤微生物群構(gòu)成與口腔微生物群相似，主要是厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和梭桿菌門(Fusobacteria)。但de Goffau MC等[11]在對537個胎盤樣本進行分析后認為胎盤樣本中的生物量非常小，不存在微生物組，發(fā)現(xiàn)的大部分細菌屬于污染菌，很多細菌僅僅是在分娩過程中定植于胎盤，或是在宮腔感染后上行至胎盤定植的，盡管在5%的臨產(chǎn)前胎盤樣本中找到無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，但并未證實它和不同的妊娠結(jié)局相關(guān)。

2 女性生殖道微生物群與女性不孕癥

生殖道微生物紊亂會對女性生殖健康產(chǎn)生影響，可導致生殖道內(nèi)環(huán)境失衡和各種女性生殖疾病病理狀態(tài)的形成，進而影響胚胎的形成、著床和發(fā)育。Babu G等[12]通過對比116名不孕癥女性和84名健康女性的陰道拭子標本，發(fā)現(xiàn)健康女性陰道微生物群中優(yōu)勢菌屬主要是乳酸桿菌屬、微球菌屬(Micrococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)，而不孕癥女性陰道微生物中的優(yōu)勢微生物是假絲酵母菌屬(Candida)、腸球菌屬和大腸埃希氏菌，細菌性陰道病(bacterial vaginosis, BV)相關(guān)菌群含量升高，以乳酸桿菌屬為優(yōu)勢微生物群的樣本量少，且不孕癥女性診斷出無癥狀性陰道炎比例(27.6%)高于健康女性(7.1%)。一項對比分析79名接受體外受精 (in vitro fertilization, IVF)技術(shù)治療的不孕癥女性和7名健康女性的陰道以及子宮內(nèi)膜微生物群結(jié)構(gòu)差異的研究，結(jié)果顯示不孕癥女性陰道及子宮內(nèi)膜中非乳酸桿菌優(yōu)勢微生物群占比均較健康女性高[13]。這些研究結(jié)果表明女性生殖道微生物群的改變可能是女性不孕癥的病因之一。

近年來不斷有證據(jù)表明女性生殖道微生物也和輔助生殖結(jié)局存在關(guān)聯(lián)性。Riganelli L等[14]的研究表明接受IVF-ET技術(shù)治療并成功受孕的女性，陰道微生物中惰性乳酸桿菌含量明顯升高，而治療失敗的女性陰道微生物中陰道加德納菌(Gardnerellavaginalis)、費格森埃希菌(Escherichiafergusonii)和健齒鏈球菌(Streptococcusdentisani)含量增多。Moreno I等[6]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中以非乳酸桿菌為優(yōu)勢微生物群的不孕癥女性，接受IVF-ET技術(shù)治療的胚胎著床率、持續(xù)妊娠率率和胎兒活產(chǎn)率要明顯低于乳酸桿菌優(yōu)勢微生物群的不孕癥女性。但子宮內(nèi)膜微生物是否能夠確實影響輔助生殖的結(jié)局仍然存在爭議。Franasiak JM等[15]應用16S rRNA基因測序技術(shù)對33名接受單胚胎移植的女性的胚胎移植導管尖端樣本進行分析，結(jié)果顯示成功受孕的女性和胚胎移植失敗的女性子宮內(nèi)膜中的主要微生物均為乳酸桿菌屬和黃桿菌屬。除了陰道和宮腔之外，一項關(guān)于取卵時卵泡液中定植微生物群與IVF-ET結(jié)局的研究發(fā)現(xiàn)，低胚胎移植率與右側(cè)卵泡的卵泡液中出現(xiàn)丙酸桿菌、鏈球菌相關(guān)，而高胚胎移植率與雙側(cè)卵泡卵泡液中出現(xiàn)乳酸桿菌相關(guān)，且不良妊娠結(jié)局與左側(cè)卵泡液中出現(xiàn)放線菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌、鏈球菌以及右側(cè)卵泡液中出現(xiàn)放線菌、雙歧桿菌和中間鏈球菌(Streptococcusintermedius)相關(guān)，良性妊娠結(jié)局與左側(cè)卵泡液出現(xiàn)乳酸桿菌相關(guān)[16]。

3 微生物治療在女性不孕癥上的應用

研究者試圖將女性生殖道微生物作為女性不孕癥治療的新“靶點”。Chenoll E等[17]從陰道樣本中分離出菌株鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillusrhamnosus)BPL005，將其與定植了陰道阿托波菌(Atopobiumvaginae)、陰道加德納菌、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)和無乳鏈球菌的原代子宮內(nèi)膜上皮細胞模型共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌和無乳鏈球菌含量明顯減少，這表明微生物制劑在生殖健康領(lǐng)域有應用潛能。一項納入392名反復種植失敗(repeated implantation failure, RIF)女性的研究發(fā)現(xiàn)，其中44.9%的女性子宮內(nèi)膜微生物群為非乳酸桿菌屬優(yōu)勢微生物群，最常見的微生物是陰道加德納菌，然后將這44.9%的女性分為5組，分別應用口服益生菌藥片Lebenin(糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、嗜酸乳酸桿菌和嬰兒型雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)構(gòu)成)+口服益生元Lf(牛奶來源的糖蛋白乳鐵蛋白)、陰道及口服聯(lián)合應用抗菌藥物(甲硝唑)、Lebenin+Lf+甲硝唑、陰道益生菌栓劑inVag(格氏乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌(Lactobacillusfermentum)和植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)構(gòu)成)、inVag+甲硝唑治療，各組分別有29.5%、33.33%、33.33%、43.6%、78.6%的女性子宮內(nèi)膜微生物群恢復為乳酸桿菌屬優(yōu)勢微生物群，inVag+甲硝唑聯(lián)合治療組最高[18]。而Lev-Sagie A等[19]則對陰道微生物移植(vaginal microbiome transplantation, VMT)進行了探索性研究，將健康女性的陰道分泌物移植到5名難治性細菌性陰道病女性的陰道中，其中4名女性BV相關(guān)癥狀得到長期完全緩解，且陰道中優(yōu)勢微生物恢復為乳酸桿菌屬，1名女性僅獲得臨床癥狀的部分緩解，這為女性生殖道微生物紊亂的后續(xù)研究帶來了新的希望。

4 結(jié)論

隨著近年來對于女性生殖道微生物群研究的深入，女性上生殖道已被證實并不是“無菌”環(huán)境，整個女性生殖道存在著連續(xù)的微生物群定植。與陰道不同，女性上生殖道樣本獲取需要通過侵入性操作，取材難度大，且女性上生殖道微生物生物量低，多樣性高，在取材和檢驗時易受其他菌群污染，影響結(jié)果分析及判斷，女性生殖道微生物研究仍存在許多障礙，尤其是生殖道微生物中的“核心菌種”和胎盤中是否存在微生物定植現(xiàn)在仍存在廣泛爭議。現(xiàn)在女性生殖道微生物的研究范圍涵蓋了女性生殖道微生物群結(jié)構(gòu)和功能研究，也包括“疾病與微生物群紊亂”的研究，研究者正試圖確定哪些微生物群或微生物群落類型的存在能夠提示女性生殖道處于“微生物群紊亂”狀態(tài)，明確這種紊亂狀態(tài)與疾病的關(guān)聯(lián)，并將它們作為疾病治療的新“靶點”，給疾病治療帶來新的可能。雖然現(xiàn)有的研究仍不能完全證實女性生殖道微生物群與女性不孕癥存在必然的關(guān)聯(lián)，且這些臨床研究存在治療方案及微生物檢測技術(shù)標準化不統(tǒng)一的問題，但越來越多的證據(jù)表明改善女性生殖道微生物群對女性生育結(jié)局存在積極的影響。盡管目前女性生殖道研究仍處于起始階段，但相信隨著女性生殖道微生物研究的深入，“微生物療法”將為不孕癥女性帶來更多的可能。