右美托咪定對七氟醚麻醉的大鼠下丘腦內pCaMKⅡɑ表達的影響

王叢叢，張巧梅，沈 莉，王海青，馬登明

（1. 山東省蒙陰縣人民醫(yī)院麻醉手術科，山東 蒙陰 276200 ；2. 陜西省空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院麻醉與圍術期醫(yī)學科，陜西西安 710032）

吸入式麻醉藥自問世以來已有100 多年的臨床使用歷史。七氟烷是目前臨床上常用的一種吸入式麻醉藥。右美托咪定（dexmedetomidine）是一種新研發(fā)的ɑ2 腎上腺素受體激動劑。此藥的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效果較強，因此在臨床上迅速得到推廣應用。右美托咪定對腦的保護作用在動物的腦缺血/ 再灌注模型中已得到證實[1]。Ca2+/CaM- 依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）在真核細胞中普遍存在，可參與細胞內多種信號的傳導，通過調控Ca2+對動物的神經系統(tǒng)發(fā)揮一定作用[2]。以往的研究表明，磷酸化的CaMK Ⅱ可參與全身麻醉機制[3]。在使用七氟醚進行麻醉時，右美托咪定能否通過影響磷酸化CaMK Ⅱ而參與全身麻醉機制仍不能明確[4]。下丘腦是調節(jié)人體內臟活動和內分泌活動的高級中樞，能通過多種途徑對機體活動進行調節(jié)。本文主要是探討右美托咪定對使用七氟醚進行麻醉的大鼠下丘腦內磷酸化Ca2+/CaM-依賴性蛋白激酶Ⅱα（phosphorylation of Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱα，pCaMK Ⅱα）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20 只雄性SD 大鼠（由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供），其體重為250 g 左右。對這些大鼠進行適應性飼養(yǎng)1 周后開始進行實驗。本實驗嚴格遵守動物倫理學的相關規(guī)定。

1.2 材料與儀器

右美托咪定（由江蘇新晨醫(yī)藥有限公司生產），無菌去離子水溶解，凝膠成像儀（由美國伯樂Bio-Rad 公司生產），氣體濃度檢測儀（由西安諾科儀器有限責任公司生產），1:2000 的CaMK Ⅱ（由上海信裕生物技術有限公司生產，批號為xy-I006081），腦電監(jiān)測儀（由上海海神醫(yī)療電子儀器廠生產），自凝牙托粉和牙托水（由河南牙益美醫(yī)療器械貿易有限公司生產，批號為180917），大鼠腦立體定位儀（由上海玉研科學儀器有限公司生產）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗模型的制備 將濃度為10%的水合氯醛0.5 ml/kg注入大鼠的腹腔內，對其進行麻醉。采用大鼠腦立體定位儀定位其側腦室的位置。將2 mL 注射器的針頭打磨成1.7 cm 長的細管，在大鼠前囟后0.8 mm、腦正中線旁1.2 mm 處對其側腦室進行穿刺，穿刺的深度為3.8 mm。穿刺成功后用自凝牙托粉和自凝牙托水固定細管。將導電針埋于大鼠的頭皮下，待牙托粉凝固后用膠布固定導電針和細管[5]。

1.3.2 分組方法及給藥方法 將20 只大鼠隨機分為對照（control，Con）組和右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）組，每組各有大鼠10 只。經Con 組大鼠的側腦室小管注入無菌生理鹽水0.1 mL，經Dex 組大鼠的側腦室小管注入濃度為20μg/mL 的右美托咪定0.1 mL。將腦電監(jiān)測裝置連在大鼠的頭部，對其實施全程腦電監(jiān)測。注藥30 min 后將兩組大鼠置于密閉的容器中，用6倍最低肺泡有效濃度（minimum alveolar concentration，MAC）的七氟烷對其進行快速麻醉誘導。待其進入麻醉狀態(tài)后，用濃度為1.5% 的七氟烷對其進行維持麻醉。麻醉30 min 后停藥，停藥后為其吸入6 L/min 的純氧，對其進行快速洗脫處理，直至其完全清醒。

1.3.3 大鼠腦電波的監(jiān)護和記錄 實驗全程密切監(jiān)測兩組大鼠的腦電波，同時注意觀察其行為變化，選擇七氟烷麻醉30 min 時采集其腦電波進行分析。

1.3.4 大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 蛋白表達的測定 在麻醉30 min 時，用斷頭脫頸法快速處死兩組大鼠，取出其腦組織。在冰上快速分離出下丘腦組織，用低溫離心機對下丘腦組織進行離心處理（轉速為10 000 rmp/min），保留上清液。以BCA 蛋白試劑為標準品（每例提取標本40 μg），求得標準曲線定量。用聚丙烯酰胺凝膠對上清液進行電泳后將其恒壓轉移至聚偏二氟乙烯膜上，并用5% 的脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后加入pCaMK Ⅱ一抗，并在3℃下封閉過夜。采用辣根過氧化酶標記的二抗將標本在室溫下孵育1 h，顯像后對圖像進行分析，明確兩組大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達情況[6]。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數據，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組均數比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用One-way ANOVA 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠的腦電記錄及波形分析

用七氟烷麻醉30 min 時，采集兩組大鼠的腦電波進行分析發(fā)現，與Con 組大鼠相比，Dex 組大鼠的抑制性腦電波（δ 波）增多（P＜0.05），興奮性腦電波（α 波、β 波）減少（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 兩組大鼠的腦電波頻譜

2.2 兩組大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達情況

用七氟烷麻醉30 min 時，與Con 組大鼠相比，A 組大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達量更低（P＜0.05）。與Con 組大鼠、A 組大鼠相比，B 組大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達量更低（P＜0.05）。詳見圖2、圖3。

圖2 大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相對分子量

圖3 大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相對表達量

3 討論

吸入式麻醉是指揮發(fā)性麻醉藥物經呼吸系統(tǒng)入血，抑制中樞神經系統(tǒng)而達到麻醉目的的一種麻醉方法。吸入式麻醉藥在體內分解、代謝較少，大部分藥物能以原形從肺部排出體外，具有較高的安全性、可控性[7]。近年來，七氟烷吸入式麻醉在外科手術中應用越來越廣泛[8]。鹽酸右美托咪定是一種高選擇性ɑ2 受體激動劑，能通過激動腦干藍斑核和脊髓背角的ɑ2 受體而產生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、催眠的作用。此藥除了具有上述作用外，其在腦保護、抗炎等方面的作用也逐漸受到人們的關注[9-10]。生物電現象是生命活動的基本特征之一，各種生物均有電活動的表現。腦電波是腦神經細胞的電生理活動在大腦皮層或頭皮表面的總體反映[11-12]。腦電波中的δ 波是麻醉狀態(tài)下的典型波形，在成人極度疲勞或昏睡狀態(tài)下易產生。腦電波中的α 波、β 波是成人在清醒狀態(tài)下出現的腦電波[13-14]。本實驗經側腦室為大鼠注入右美托咪定后，采用七氟烷對其進行麻醉，麻醉30 min 時取其腦電波進行頻譜分析，發(fā)現其抑制性腦電波δ 波明顯增加，興奮性腦電波α 波、β 波明顯減少。這一結果不僅符合右美托咪定的藥理特性，更從電生理學層面印證了此藥的效應。本實驗用七氟烷麻醉30 min 時及動物清醒狀態(tài)下取大鼠的下丘腦組織進行免疫印記分析發(fā)現，Dex 組大鼠下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 的表達量在麻醉30 min時明顯降低，這一指標在其完全清醒后逐漸升高并恢復正常。這一結果表明右美托咪定能在一定程度上抑制動物腦內pCaMK Ⅱɑ 的表達。現階段，全身麻醉技術已十分成熟，但關于麻醉藥物對中樞神經系統(tǒng)作用機制的認識仍較為局限。近年來，多種參與睡眠覺醒的中樞神經遞質（如多巴胺、乙酰膽堿、γ- 氨基丁酸等）相繼被證實參與了麻醉分子機制[15]。電生理、磁共振等方面的研究也發(fā)現，除了經典的大腦皮層、腦干、脊髓外，一些未受重視的中樞結構（如下丘腦）也是麻醉藥的敏感區(qū)域[15-16]。

綜上所述，右美托咪定可對使用七氟醚進行麻醉大鼠的腦電波產生抑制，還可抑制麻醉過程中其下丘腦內pCaMK Ⅱɑ 的表達。關于右美托咪定導致動物意識消失及意識恢復的機制，仍需要通過進一步的研究來發(fā)現、證實。