基于轉(zhuǎn)錄組測序的檳榔葉片黃化的共同差異表達(dá)基因的分析

禤哲，車海彥，曹學(xué)仁，賀延恒，羅大全

摘? 要：檳榔（Areca catechu L.）作為海南省重要的經(jīng)濟(jì)作物，其葉片黃化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，已成為當(dāng)前制約檳榔產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的一大障礙。經(jīng)田間調(diào)研發(fā)現(xiàn)，葉片黃化癥狀主要有從葉緣1/4處開始發(fā)生的特異性黃化和全葉型黃化兩種類型。本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，篩選出440個(gè)在特異性葉片黃化組中共同顯著差異表達(dá)的基因，這些差異基因主要富集在能量代謝通路、激素代謝通路和次級(jí)代謝通路中。本研究探討了不同脅迫下檳榔葉片表現(xiàn)出特異性黃化癥狀的分子機(jī)理，為檳榔黃化病的綜合防控工作提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：檳榔;黃化;轉(zhuǎn)錄組測序

中圖分類號(hào)：S763.7? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Analysis of Common Differentially Expressed Genes in Leaf Yellowing of Areca Plam Based on Transcriptome Sequencing

XUAN Zhe1，2， CHE Haiyan1， CAO Xueren1， HE Yanheng1， LUO Daquan1*

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Guangdong Agribusiness Produce Quality Safety Testing Center Co.， Ltd.， Guangzhou， Guangdong 510507， China

Abstract： Areca catechu L. is an important economic crop in Hainan， China， the leaf yellowing has become increasingly serious， which is a major obstacle to the sustainable and healthy development of the areca industry. According to field research， the symptoms of leaf yellowing mainly included specific yellowing from 1/4 of leaf margin and whole leaf yellowing. In this study， 440 differentially co-expressed genes were screened in the specific leaf yellowing group by transcriptome sequencing， which were mainly concentrated in secondary metabolic pathways， hormone signal transduction pathways and energy metabolism pathways. This study explored the molecular mechanism of specific etiolation of areca leaves under different stresses and provided theoretical basis for the comprehensive prevention and control of areca plam yellowing disease.

Keywords： Areca catechu L.; leaf yellowing; transcriptome sequencing

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.012

檳榔（Areca catechu L.）是棕櫚科檳榔屬常綠喬木，已成為海南第二大熱帶經(jīng)濟(jì)作物，是海南省東部、中部和南部山區(qū)等地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)來源之一。近年來，受黃化等問題嚴(yán)重影響，檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展嚴(yán)重受阻。黃化原因復(fù)雜，植原體、干旱、養(yǎng)分缺乏和除草劑藥害等多種因素均會(huì)引起葉片黃化[1-7]。通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，葉片黃化癥狀主要有從葉緣1/4處開始發(fā)生的特異性黃化和全葉型黃化兩種類型。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能全面揭示植物在特定組織、特定生長時(shí)期的全部基因的表達(dá)情況，且基因組信息與表型特征有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，因此被廣泛應(yīng)用在模式和非模式物種轉(zhuǎn)錄組的研究中，以揭示植物在特定時(shí)刻、特定組織中轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制[8-11]。本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序手段，以表現(xiàn)不同類型黃化癥狀的葉片為實(shí)驗(yàn)材料，篩選出檳榔葉片發(fā)生特異性黃化癥狀的相關(guān)差異表達(dá)基因，并對(duì)其功能和代謝通路進(jìn)行注釋，分析了功能基因的表達(dá)模式，探討了檳榔葉片表現(xiàn)出特異性黃化癥狀的分子機(jī)理，為檳榔黃化病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

從葉緣1/4處開始發(fā)生特異性黃化的葉片樣本1、樣本2和樣本3分別采自屯昌、瓊中、瓊海，全葉型黃化的葉片樣本4采自定安。健康檳榔葉片為對(duì)照組，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所儋州基地。每組樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別取自3株檳榔樹。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取? 總RNA提取方法參照QIAGEN RNeasy Plant Mini試劑盒使用說明，分別對(duì)15個(gè)樣本的總RNA進(jìn)行提取后，用Nanodrop 2000測定總RNA的濃度和純度;結(jié)合1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，將所提取的RNA置于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 文庫構(gòu)建和測序? 利用帶有Oligo（dT）的磁珠與ployA進(jìn)行A-T堿基配對(duì)，從總RNA中分離出mRNA，再利用Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)短序列片段進(jìn)行測序，其目的是將mRNA進(jìn)行富集，隨后隨機(jī)將其片段化處理。以片段化mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過粘性末端補(bǔ)成平末端，3′末端加“A”，連接成“Y”字形的接頭和PCR擴(kuò)增、純化等步驟，完成測序樣本的文庫構(gòu)建及上機(jī)測序。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3? 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

1.3.1? 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控? 對(duì)raw data進(jìn)行過濾，除去reads中的接頭序列、序列末端（3′端）質(zhì)量低于Q20的堿基、含未知堿基N比率超過10%的reads及長度小于30 bp的reads后，得到高質(zhì)量的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（clean data），以保證后續(xù)結(jié)果分析的準(zhǔn)確性。

1.3.2? 轉(zhuǎn)錄本的拼接? 利用Trinity軟件對(duì)質(zhì)控后的clean data進(jìn)行拼接[12]，由于檳榔無參考基因組，需要建立轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，因此需提取其中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigenes，使用軟件TransRate對(duì)初始組裝序列進(jìn)行優(yōu)化過濾，使用BUSCO對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，以保證后續(xù)結(jié)果的可信度[13]。

1.3.3? 基因表達(dá)量分析及差異表達(dá)基因（DEGs）篩選? 利用軟件RSEM分別對(duì)Unigenes的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，TPM作為表達(dá)定量指標(biāo)[14]，TPM具體的運(yùn)算公式如下：

式中，Xi表示比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本的reads，li表示轉(zhuǎn)錄本長度， 表示所有能夠比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的reads按長度標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)值的總和。

本研究設(shè)有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，因此使用DESeq2軟件對(duì)raw counts進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，該軟件的運(yùn)算基于負(fù)二項(xiàng)分布，設(shè)置DEGs篩選參數(shù)為：p-adjust<0.05且|log2FC|≥2[15]，篩選出與檳榔葉片黃化相關(guān)的差異表達(dá)基因。將篩選出來的差異表達(dá)基因與六大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，閾值設(shè)為：E-value≤1×e–5，再進(jìn)行功能注釋和功能富集分析。

1.4? 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

以步驟1.2.1所提取的檳榔葉片RNA為模板，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，篩選出表達(dá)量在所有樣本中表達(dá)均較穩(wěn)定的基因，利用本地Blastx軟件對(duì)這部分基因進(jìn)行比對(duì)，篩選出了檳榔Actin基因作為內(nèi)參基因，選取4個(gè)有代表性的差異表達(dá)基因做qRT-PCR驗(yàn)證，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量所需要的引物，引物序列見表1。用TB Green??Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）配制20 ?L的qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

15個(gè)檳榔葉片樣本總共得到741 481 770個(gè)raw reads，過濾后得到730 688 448個(gè)clean reads，clean reads占raw reads的比值均在98.00%以上。從整體上看，堿基錯(cuò)誤率均在0.03%以內(nèi)，Q20為97.01%～97.54%，Q30為91.57%～92.70%，GC平均含量約為48.50%。表明整體測序質(zhì)量好，數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。組裝過濾后，得到的clean reads共包含321 402個(gè)Unigene，所得Unigene的GC含量為42.09%，N50為1647 bp，E90N50為2350 bp，平均長度為857.35 bp。能滿足后續(xù)做基因表達(dá)定量及差異基因表達(dá)分析基本要求。

2.2? 功能注釋

將組裝獲得的Unigenes序列與六大數(shù)據(jù)庫（NR，Swiss-Prot，Pfam，COG，GO和KEGG數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行注釋（E-value≤1×e–5），結(jié)果顯示：至少能比對(duì)注釋到一個(gè)數(shù)據(jù)庫上的Unigenes序列有126 444條;在六大數(shù)據(jù)庫中均能比對(duì)注釋上的Unigenes序列有5693條，其比例僅有1.77%;60.66%的Unigenes在任何數(shù)據(jù)庫中均無被比對(duì)注釋上。

2.3? 差異基因的篩選及分析

將3組實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組兩兩間進(jìn)行基因的差異分析，并將DEGs篩選參數(shù)設(shè)為：p-adjust<0.05且|log2FC|≥2。結(jié)果顯示，樣本1特異性黃化葉片共10 619個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中6422個(gè)上調(diào)表達(dá)，4197個(gè)下調(diào)表達(dá);樣本2特異性黃化葉片共18 433個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中8310個(gè)上調(diào)表達(dá)，10 123個(gè)下調(diào)表達(dá);樣本3特異性黃化葉片共3788個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中2035個(gè)上調(diào)表達(dá)，1753個(gè)下調(diào)表達(dá);樣本4全黃葉型黃化葉片共5583個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中3085個(gè)上調(diào)表達(dá)，2498個(gè)下調(diào)表達(dá)（圖1）。

根據(jù)上述篩選的不同差異分組的基因集合繪制韋恩圖，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為特異性黃化的樣本與全葉型黃化的樣本，共有654個(gè)共同顯著差異表達(dá)的基因，其中314個(gè)基因在所有樣本中均上調(diào)表達(dá)，

309個(gè)均下調(diào)表達(dá)，還有31個(gè)基因上下調(diào)情況不一致;其中有440個(gè)基因僅在特異性黃化樣本中為共同顯著差異表達(dá)基因，221個(gè)基因發(fā)生共同上調(diào)表達(dá)，205個(gè)共同下調(diào)表達(dá)，14個(gè)基因在3組黃化組中上下調(diào)情況不一致（圖2）。

2.4? 特異性葉片黃化樣本差異表達(dá)基因GO功能注釋和富集分析

從整體上分析基因的表達(dá)情況，揭示檳榔葉片發(fā)生特異性黃化癥狀后差異表達(dá)基因參與的功能類別的DEGs富集在分子功能、生物過程、細(xì)胞組分三類GO（Level 2）條目中的情況，在生物過程得到最多的分類，DEGs主要注釋在metabolic process（代謝過程）、cellular process（細(xì)胞過程）、binding（連接）、catalytic activity（催化反應(yīng)）中（圖3）。

根據(jù)差異基因上調(diào)或下調(diào)情況使用超幾何檢驗(yàn)分別進(jìn)行GO富集分析，其中特異性黃化共同上調(diào)表達(dá)的DEGs富集最顯著的條目主要是：DNA metabolic process（DNA代謝過程）、transferase activity， transferring glycosyl groups（轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移糖基）、transferase activity，transferring hexosyl groups（轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移己糖基）、amino acid transport（氨基酸轉(zhuǎn)移）、GDP-mannose 3，5-epimerase activityDNA（gmp-甘露糖3，5-表位酶活性）等，具體富集情況見圖4。下調(diào)表達(dá)的DEGs富集最顯著的條目主要是：ADP binding（ADP結(jié)合）、post-embryonic root morphogenesis（胚后期的根系形態(tài)）、lateral root morphogenesis（側(cè)根形態(tài)發(fā)生）、root morphogenesis（根系形態(tài)）、gibberellic acid homeostasis（赤霉酸體內(nèi)平衡）等，具體富集情況見圖5。

2.5? 特異性葉片黃化樣本差異表達(dá)基因的KEGG顯著性富集分析

為了解與檳榔葉片發(fā)生特異性黃化癥狀相關(guān)的關(guān)鍵代謝通路，進(jìn)行了差異基因的KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，表現(xiàn)為特異性黃化樣本的DEGs富集靠前的前5個(gè)通路為：betalain biosynthesis（甜菜堿生物合成）、sulfur metabolism（硫代謝）、endocytosis（內(nèi)吞作用）、ascorbate and aldarate metabolism（抗壞血酸和醛酸代謝）、glutathione metabolism（谷胱甘肽代謝）（圖6）。

2.6? 特異性葉片黃化樣本差異表達(dá)基因的代謝通路分析

2.6.1? 能量代謝通路? 在氧化磷酸化代謝和光合生物固碳途徑中，葉片表現(xiàn)特異性黃化的DEGs

編碼琥珀酸脫氫酶上的琥珀酸脫氫酶（泛醌）細(xì)胞色素b560亞基（SDHC）的基因下調(diào)表達(dá)。在光合生物固碳通路中，編碼磷酸核酮糖激酶（PRK）的基因上調(diào)表達(dá)，編碼二磷酸核酮糖羧化酶（rbcL）的基因下調(diào)表達(dá)。

2.6.2? 激素代謝通路? 油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物合成途徑僅在表現(xiàn)特異性葉片黃化的DEGs被特異注釋，在油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中編碼木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的基因上調(diào)表達(dá);在油菜素內(nèi)酯生物合成途徑中編碼合成油菜素內(nèi)酯的關(guān)鍵酶油菜素類固醇-6-氧化酶1的基因下調(diào)表達(dá)。

2.6.3? 次級(jí)代謝通路? 檳榔葉片表現(xiàn)出特異性黃化癥狀的樣本特異注釋到的10個(gè)次級(jí)代謝通路，分別是檸檬酸循環(huán)、抗壞血酸和醛酸代謝、醚脂類代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、核黃素代謝、吲哚生物堿的生物合成、油菜素內(nèi)酯生物合成、類黃酮生物合成、甜菜堿生物合成以及二苯乙烯、二芳基庚醇和姜辣素生物合成。其中，在抗壞血酸和醛酸代謝中，編碼GDP-甘露糖3，5-差向異構(gòu)酶（催化GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為左旋GDP-L-半乳糖和GDP-L-古洛糖，以及催化GDP-L-古洛糖轉(zhuǎn)化為GDP-L-半乳糖）的基因上調(diào)表達(dá)，編碼L-抗壞血酸過氧化物酶的基因下調(diào)表達(dá);在醚脂類代

謝途徑中，編碼磷脂酶D1/2的基因上調(diào)表達(dá);乙醛酸和二羧酸代謝途徑中，編碼二磷酸核酮糖羧化酶小鏈（RuBisCO小亞基）的基因下調(diào)表達(dá);在核黃素代謝途徑中，編碼3，4-二羥基-2-丁酮4-磷酸合成酶/GTP環(huán)化水解酶II的基因上調(diào)表達(dá);在吲哚生物堿的生物合成途徑中，編碼聚尿苷-醛酯酶的基因上調(diào)表達(dá);在甜菜堿生物合成途徑中，編碼4，5-多巴雌二醇雙加氧酶的基因上調(diào)表達(dá);在類黃酮生物合成、苯丙烷類生物合成和二苯乙烯、二芳基庚醇和姜辣素生物合成途徑3條代謝途徑中，編碼莽草酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶的基因上調(diào)表達(dá)。

2.7? qRT-PCR驗(yàn)證

篩選了4個(gè)有代表性的差異基因進(jìn)行熒光定量qRT-PCR驗(yàn)證，其中DN116247、DN68503和DN117057在葉片特異性黃化的樣本中顯著上調(diào)表達(dá)，而在全黃型黃化葉片中與健康對(duì)照組相比為非顯著差異基因;DN115124則在葉片特異性黃化的樣本中顯著下調(diào)表達(dá)，而在全黃型黃化葉片中與健康對(duì)照組相比為非顯著差異基因。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果繪制的柱狀圖，其基因表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢幾乎相一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果可靠（圖7）。

3? 討論

目前，雖然有關(guān)于檳榔葉片轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究[16-19]，但尚無從轉(zhuǎn)錄組水平研究檳榔葉片特異性黃化機(jī)理的報(bào)道。本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)表現(xiàn)特異性黃化的檳榔葉片進(jìn)行測序分析，初步揭示了檳榔葉片黃化在轉(zhuǎn)錄組層面上整體的表達(dá)特征，篩選出與葉片特異性黃化相關(guān)的差異基因?qū)ζ浯x通路進(jìn)行分析。為探索檳榔葉片表現(xiàn)出特異性黃化癥狀的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

油菜素內(nèi)酯是一種甾醇類植物激素，對(duì)植物生長發(fā)育和抗逆等有重要的調(diào)控作用[20-21]。特異性葉片黃化的DEGs在油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中編碼木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶且上調(diào)表達(dá)，該酶是一種細(xì)胞壁修飾酶，該酶在植物形態(tài)建成中能夠轉(zhuǎn)移細(xì)胞壁中的木葡聚糖，從而影響細(xì)胞壁的形成和降解，在植物響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[22]。在油菜素內(nèi)酯合成途徑中編碼合成油菜素內(nèi)酯的關(guān)鍵酶油菜素類固醇-6-氧化酶1的基因下調(diào)表達(dá)，油菜素內(nèi)酯含量的降低可間接調(diào)控植物光合作用、色素合成等通路，導(dǎo)致葉片表現(xiàn)黃化癥狀。編碼油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和合成途徑中的基因僅在特異性黃化的樣本中為顯著差異基因，說明上述基因可能對(duì)檳榔葉片發(fā)生特異性黃化有重要的調(diào)控作用。

本研究通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中差異基因的分析，特異性黃化樣本中的差異基因主要富集在能量代謝通路、激素代謝通路和和次級(jí)代謝途徑中，其中在油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、類黃酮生物合成和苯丙烷類生物合成途徑中顯著上調(diào)表達(dá)，而在油菜素內(nèi)酯合成途徑中顯著下調(diào)表達(dá)，可能對(duì)檳榔葉片特異性黃化癥狀起重要的調(diào)控作用，可能調(diào)控了植物體內(nèi)的內(nèi)源激素的表達(dá)，影響了細(xì)胞內(nèi)的滲透等共同調(diào)控檳榔體內(nèi)的代謝通路，導(dǎo)致檳榔葉片表現(xiàn)出黃化癥狀。

葉片表現(xiàn)出特異性黃化癥狀的樣本特異注釋到的10個(gè)次級(jí)代謝通路，其中編碼甜菜堿生物合成、抗壞血酸和醛酸代謝、吲哚生物堿的生物合成、二苯乙烯、二芳基庚醇和姜辣素的生物合成、醚脂類代謝、核黃素代謝以及類黃酮生物合成通路的相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá);編碼油菜素內(nèi)酯生物合成、檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝以及抗壞血酸和醛酸代謝通路的相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá)，可能調(diào)控了植物體內(nèi)的內(nèi)源激素的表達(dá)，影響了細(xì)胞內(nèi)的滲透等共同調(diào)控檳榔體內(nèi)的代謝通路，導(dǎo)致檳榔葉片表現(xiàn)出相似的黃化癥狀。而編碼類黃酮生物合成、苯丙烷類生物合成以及二苯乙烯、二芳基庚醇和姜辣素生物合成這3條次生代謝途徑中的莽草酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶的基因，且顯著上調(diào)表達(dá)。黃酮類植物著色色素的生物合成途徑是通過苯丙烷類代謝來完成的，對(duì)病原菌侵染的抗性和著色色素形成有密切的關(guān)系[23]。黃酮類化合物是高等植物中的一類次生代謝產(chǎn)物，可以通過提高過氧化物酶的活力、減少丙二醛含量以及增加脫落酸的含量等對(duì)提高植株的抗旱性起著極其關(guān)鍵的作用[24-27]。在發(fā)生特異性黃化的檳榔葉片樣本中，莽草酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶顯著上調(diào)表達(dá)，說明調(diào)控該酶的基因上調(diào)表達(dá)可能影響了植物著色色素的合成導(dǎo)致葉片發(fā)生黃化癥狀;類黃酮合成途徑中莽草酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)反而受到促進(jìn)，其作用機(jī)理需進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)才可以確認(rèn)。

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