甘蔗內生固氮菌Klebsiella variicola DX120E溶磷基因GDH和pqqE的克隆及溶磷特性分析

陳炯宇，覃英，謝顯秋，黃毓燕，董登峰，邢永秀，李楊瑞

摘? 要：葡萄糖脫氫酶（GDH）和吡咯喹啉醌（PQQ）對溶磷微生物溶解無機磷具有重要作用。本研究為了探討甘蔗內生固氮菌變棲克雷伯菌（Klebsiella variicola）DX120E的溶磷機制，從該菌中克隆溶磷基因GDH和pqqE的ORF，并進行了生物信息學分析，同時還研究了該菌對不同磷源的利用能力。結果表明：克隆得到甘蔗內生固氮菌Klebsiella variicola DX120E GDH和pqqE基因的ORF分別為2373 bp和1143 bp，編碼氨基酸分別為790個和380個。生物信息學分析結果表明，GDH蛋白為穩(wěn)定蛋白，pqqE蛋白為不穩(wěn)定蛋白。GDH蛋白是一個與細胞信號傳導有關的膜受體蛋白，具有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白結構;pqqE基因編碼的蛋白是胞內蛋白，含有1個PQQ_syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的結構。內生固氮菌Klebsiella variicola DX120E對不同磷源的利用和GDH和pqqE基因在不同磷源培養(yǎng)時的qRT-PCR分析表明，該菌對不同磷源的溶磷能力表現(xiàn)為FePO4>AlPO4>Ca3（PO4）2，且溶解FePO4的能力與溶解Ca3（PO4）2、AlPO4等難溶磷源的差異均顯著（P<0.05）。在幾種磷源條件下，GDH和pqqE基因相對表達量均增加，且2個基因的表達量變化趨勢一致。GDH和pqqE基因在以FePO4為磷源條件下的表達量與以Ca3（PO4）2為磷源的表達量差異顯著（P<0.05）。本研究可為進一步研究內生固氮菌與甘蔗的互作和溶磷機制提供參考。

關鍵詞：甘蔗;Klebsiella variicola DX120E;GDH;pqqE;溶磷特性

中圖分類號：S566.1? ? ? 文獻標識碼：A

Cloning of Phosphorus-soluble Gene GDH and pqqE from Sugarcane Endogenous Nitrogen-fixing Bacteria Klebsiella variicola DX120E

CHEN Jiongyu1， QIN Ying1， XIE Xianqiu1， HUANG Yuyan1， DONG Dengfeng1， XING Yongxiu1*， LI Yangrui1，2*

1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Glucose dehydrogenase （GDH） and pyrroloquinoline quinone （PQQE） play an important role in the dissolution of inorganic phosphorus by phosphorus-soluble microorganisms. The phosphorus-soluble mechanism of the nitrogen-fixing bacteria Klebsiella variicola DX120E in sugarcane was investigated. The ORF of the phosphorous-soluble gene GDH and pqqE were cloned from the bacterium and analysised by bioinformatics. At the same time， the utilization ability of the bacteria to different phosphorus sources was studied. The ORF of GDH and pqqE was 2373 bp and 1143 bp， the coding amino acids were 790 and 380， respectively. Bioinformatics analysis showed that GDH was a stable protein， but pqqE was an unstable one. GDH was a membrane receptor protein related to cell signaling， with PQQ_membr_ DH， PQQ_mGDH functional domain and PQQ_DH_like superfamily protein structure. pqqE encoded proteins called intracellular proteins， structure containing PQQ_syn_pqqE functional domain and Radical SAM superfamily proteins. The utilization of different phosphorus sources and the qRT-PCR analysis of GDH and pqqE in different phosphorus sources showed that under different conditions， the ability of the bacteria to dissolve phosphorus was FePO4>AlPO4> Ca3（PO4）2 and the ability to dissolve FePO4 was significantly different from that of Ca3（PO4）2 and AlPO4（P<0.05）. Under the condition of several phosphorus sources， the relative expression of GDH and pqqE increased， and the expression change trend of the genes was the same. The expression of GDH and pqqE in phosphorus source was significantly different from that in Ca3（PO4）2（P<0.05）. This study would lay a foundation for further study on the interaction and phosphorus dissolution mechanism between endophytic nitrogen-fixing bacteria and sugarcane.

Keywords： sugarcane; Klebsiella variicola DX120E; GDH; pqqE; phosphorus-soluble characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.010

磷是植物必需的大量元素，但大量的可溶性無機磷肥作為化肥施于土壤后大多被固定，植物無法利用[1]。廣西是我國土壤含磷量較低的地區(qū)，土壤全磷含量一般為0.03%～0.15%，全磷含量低于0.06%的土地面積約占85%。施用的磷肥絕大部分保留于土壤中[2]。溶磷微生物在土壤中分布十分廣泛，能使土壤中無機磷酸鹽溶解或有機磷磷酸鹽礦化，進一步提高土壤中磷的利用率，促進植物生長，提高作物的產量和品質[3-4]。前蘇聯(lián)學者蒙金娜首次報道巨大芽孢桿菌具有溶磷特性[5]。Jain等[6]從綠豆根際分離得到具有溶磷能力的曲霉S29（Aspergillus sp.），該菌能夠溶解各種無機形式的磷酸鹽，對綠豆生長有明顯的促進作用。還有研究發(fā)現(xiàn)[7-10]溶磷微生物具有植物根際促生細菌（plant growth promoting rhizobacteria， PGPR）菌株的許多特性，能夠產生生長素（IAA）、赤霉素（GA）、細胞分裂素（CK）及分泌鐵載體等物質，促進植物對鉀、鈣、鎂和鋅等元素的吸收。不同作物間作也可提高土壤磷的利用效率[11-12]，為活化土壤難溶磷以促進作物生長提供了新思路。因此，具有溶磷能力的微生物對于環(huán)境保護和農業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略實施具有重要意義。

具有溶磷能力的微生物通過分泌磷酸酶、葡萄糖脫氫酶（GDH）以及核酸酶等來溶解難溶性的無機磷或者有機磷，進而發(fā)揮溶磷作用[11]。吡咯喹啉醌（PQQ）是GDH等的輔酶，溶磷菌在GDH和PQQ以及金屬離子如Mg2+或Ca2+的共同作用下參與葡萄糖酸溶磷代謝，溶解土壤無機或有機磷酸鹽，將不溶性無機磷轉化成可被植物吸收利用的有效磷，促進植物對營養(yǎng)的攝入和植物生長[12-13]。GDH的激活需要輔因子PQQ的參與才能產生葡萄糖酸，二者缺一不可[14]。PQQ由pqqABCDEF操縱子編碼合成，包含pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF 6個基因在內的基因簇，其中pqqE對PQQ的生物合成至關重要[14-15]。本課題組Lin等[16]從廣西大新縣種植的甘蔗品種‘新臺糖22號（ROC22）根內分離到一株變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E，該菌具有高固氮活性、分泌生長素和鐵載體以及溶解無機磷特性等促生長特性，但其溶磷機制還未見報道。本研究通過克隆DX120E的溶磷基因GDH和pqqE，并分析其在不同難溶磷源的溶磷能力和基因相對表達量，探討該菌溶磷能力及機制，研究結果可為進一步研究甘蔗內生固定菌DX120E與甘蔗的互作和溶磷機制奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

菌株Klebsiella variicola DX120E為本課題組分離[16]。

1.2? 試驗試劑

克隆載體pMD18-T Vector、PCR擴增試劑、分子克隆試劑均購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌株DH5α購自北京全式金生物技術有限公司;其余試劑均為國產分析純。

1.3? 引物設計合成

根據(jù)GenBank中登陸的GDH和pqqE基因的核苷酸序列，用Primer 5.0軟件設計引物。引物序列如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4? GDH和pqqE基因PCR擴增

以甘蔗內生固氮菌DX120E為模板，進行PCR擴增。擴增體系為25.0 μL反應體系：EsTaq Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：預變性95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃ 6 min。擴增結束后在1.0%瓊脂糖凝膠糖1.0 TAE電泳緩沖液中進行電泳。

1.5? GDH和pqqE基因的生物信息學分析

參考孟富宣等[17]和范曉軍等[18]采用的生物信息學分析方法：用NCBI ORF finder（http：//www. Ncbi.Nlm.nih.gov/gorf/gorf.htm1）進行開放閱讀框查找;用BioXM 2.6預測該基因的氨基酸序列;用ExPASy（http：//expasy.org/tools/）對該基因推測蛋白質序列的基本理化性質進行分析;用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignaIP/）進行信號肽預測;用GenBank Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）在線分析軟件分析甘蔗GDH和pqqE基因與其他物種的同源性;用TMHMMServer2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）進行跨膜結構分析;利用MotifScan、protein blast程序（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/ Blast.cgi）分別對GDH和pqqE的蛋白質功能和保守結構域進行分析。

1.6? DX120E對不同難溶磷源的溶磷能力測定

按照NBRIP培養(yǎng)基的組分含量，將Ca2（PO4）3改為AlPO4、FePO4，質量不變，制成液體培養(yǎng)基。挑取在平板中生長的單菌落，將其接入液態(tài)LB培養(yǎng)基之內，調整至150 r/min和37 ℃的條件進行培養(yǎng)，再調節(jié)菌液使其OD600=1.0，這樣便得到了種子液。取300 μL種子液接入含有10 mL液態(tài)LB培養(yǎng)基的指型瓶中，同樣選擇150 r/min和37 ℃的條件來培養(yǎng)，做3個重復，同時以接入的無菌水作為對照實驗，培養(yǎng)后用鉬銻抗比色法評價溶磷效果[19]。

1.7? 不同難溶磷源中GDH和pqqE基因相對表達量分析

用Primer 5設計基因的熒光定量引物，內參基因選用DX120E 16S RNA基因，設計引物（表2）。熒光定量PCR體系和反應程序依照試劑盒說明書進行（Vazyme公司的ChamQ TM Universal SYBR?qPCR Master Mix）。各處理均進行生物學重復處理3次，技術性重復3次，采用2–??Ct法分析不同磷源條件下GDH和pqqE基因的相對表達量。

1.8? 統(tǒng)計分析

利用SPSS 21.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理及差異顯著性分析，利用Graphpad軟件制圖。

2? 結果與分析

2.1? GDH和pqqE基因的克隆

以甘蔗內生固氮菌DX120E為模板，用所設計的引物進行PCR擴增，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增所得到片段大小與預期的擴增片段大小相符，GDH和pqqE基因的片段大小分別約為2000 bp和1000 bp（圖1）。將經回收純化的產物與pMD18-T載體連接并轉化感受態(tài)DH5α，所篩選出的陽性克隆送深圳華大基因測序。測序結果GDH和pqqE基因分別為2373 bp和1143 bp。GDH基因GenBank登錄號為MW026649，編碼790個氨基酸（圖2）。pqqE基因GenBank登錄號為MW026650，編碼380個氨基酸（圖3）。

M：DL5000 marker;1：GDH基因;2：pqqE基因。

M： DL5000 marker; 1： GDH gene; 2： pqqE gene.

2.2? GDH和pqqE基因生物信息學分析

2.2.1? 理化性質分析? 應用蛋白質在線分析軟件系統(tǒng)ExPASy分析GDH蛋白，顯示GDH蛋白理論分子質量為85.05 kDa，pI為6.62，分子式為C3840H5941N1021O1103S31;其中甘氨酸（Gly）含量最高，為10.9%，丙氨酸（Ala）次之，為9.4%，帶正電荷的氨基酸為63個，帶負電荷的氨基酸為65個。不穩(wěn)定指數(shù)為34.36，為穩(wěn)定性蛋白。

pqqE蛋白分子量為42.99 kDa，pI為5.90，分子式為C1904H2967N531O564S21;其中亮氨酸（Leu）含量最高，為10.8%，丙氨酸（Ala）次之，為9.2%，總帶正電荷的氨基酸為43個，帶負電荷的氨基酸為48個。不穩(wěn)定指數(shù)為49.32，為不穩(wěn)定性蛋白。

2.2.2? 信號肽預測? 用SignalP 4.1在線軟件對GDH和pqqE蛋白進行信號肽預測，結果表明GDH和pqqE的蛋白均無信號肽，不屬于分泌型蛋白（圖4）。

A：GDH;B：pqqE。

2.2.3? 跨膜區(qū)結構預測? 通過TMHMM在線軟件進行蛋白跨膜螺旋結構分析，如圖5A所示，GDH基因的編碼產物存在6個跨膜螺旋（TMHs）結構，該蛋白是跨膜蛋白，也存在跨膜結構。pqqE蛋白不含跨膜結構，為一種外膜蛋白（圖5B）。

A： GDH; B： pqqE.

2.2.4? 蛋白質二級結構預測? 利用SOPMA預測GDH蛋白的二級結構，得知該蛋白含有-螺旋、β-鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲，其中主要為無規(guī)則卷曲，占51.90%，其次為β-鏈占23.16%，-螺旋，占16.71%，β-折疊只占8.23%（圖6A）。pqqE蛋白的二級結構含有-螺旋、β-鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲，其中主要為無規(guī)則卷曲占45.53%，其次為-螺旋，占38.16%，β-鏈占12.37%，β-折疊只占3.95%（圖6B）。

A：GDH;B：pqqE;h：-螺旋;e：β-鏈;

t：β-折疊;c：無規(guī)則卷曲。

A： GDH; B： pqqE; h： -helix; e： β-chain; t： β-fold; c： Random coil.

2.2.5? 蛋白功能結構域進行分析? 用Motif Scan軟件對GDH和pqqE蛋白功能結構域進行分析。結果顯示，在GDH蛋白中，173-176、209-212、354-357、541-544、601-604為N-糖基化位點;149-152、175-178、211-214、242-245、311-314、356-359、432-435、459-462、543-546、553-556、629-632、667-670、684-687為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點;26-31、33-38、279-284、348-353、362-367、392-397、428-433、519-524、586-591、630-635、640-645、664-669、707-712為N-肉豆蔻?；稽c;242-244、286-288、305-307、371-373、491-493、673-675、756-758、759-761為蛋白激酶C磷酸化位點;431-438、772-780為酪氨酸激酶磷酸化位點。在pqqE蛋白中，226-229、367-370為N-糖基化位點;65-68、71-74、101-104、277-280、308-311為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點;95-100、131-136、199-204、225-230、244-249、317-322、328-333為N-肉豆蔻酰化位點;19-21、71-73、267-269為蛋白激酶C磷酸化位點;80-88為酪氨酸激酶磷酸化位點。

2.2.6? 蛋白保守結構域分析? 用protein blast程序對GDH蛋白進行預測。結果表明（圖7A），GDH蛋白含有3個功能域，分別為PQQ_membr_ DH、PQQ_mGDH、Gcd;含有3個超家族蛋白結構，其中最主要的是PQQ_DH_like超家族蛋白結構。PQQ_membr_DH功能域的系統(tǒng)發(fā)育分布與輔酶PQQ生物合成酶非常相似。在N-末端區(qū)域有幾個已預測到的跨膜螺旋的序列與PQQ所依賴的甘油（EC1.1.99.22）和其他多元醇（糖醇）脫氫酶具有同源性。PQQ_mGDH功能域的細菌亞家族屬于以吡咯喹啉醌（PQQ）為輔助因子的脫氫酶家族，是唯一與膜結合的亞家族。葡萄糖脫氫酶將D-葡萄糖轉化為D-葡萄糖-1，5-內酯，在革蘭氏陰性菌糖和醇的周質氧化反應中與呼吸鏈偶聯(lián)。PQQ_DH_like超家族蛋白家族包含一個8葉β-螺旋槳，由以吡咯喹啉醌（PQQ）為輔助因子的脫氫酶組成，如乙醇、甲醇和膜結合葡萄糖脫氫酶。

保守結構域分析顯示（圖7B），pqqE蛋白含有1個PQQ_syn_pqqE功能域，是一種典型的肽環(huán)化自由基SAM酶。將Tyr連接到Glu是從前體肽PqqA合成吡咯喹啉醌（輔酶PQQ）的第一步。該蛋白含有Radical SAM超家族蛋白的典型結構，該家族是一個協(xié)調保守的鐵硫簇CxxxCxxC基序，其中酶通過將4Fe-4S簇和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）緊密結合而產生自由基，再將共享單個電子從鐵硫簇轉移到SAM后還原裂解為蛋氨酸和5-脫氧腺苷自由基，隨后反過來又從適當位置的碳原子中提取氫。根據(jù)酶的不同，SAM在此過程中被消耗或恢復和重復使用。自由基SAM酶起著催化代謝、DNA修復、維生素和輔酶的生物合成以及許多抗生素的生物合成的作用。此外，還會催化不同的反應，包括不尋常的甲基化、異構化、硫插入、環(huán)形成、厭氧氧化和蛋白質自由基形成。

A： GDH; B： pqqE.

2.2.7? 氨基酸序列同源性分析? 用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示（圖8A，圖8B），菌株DX120E的GDH和pqqE蛋白與克雷伯氏菌屬的親緣關系最近。

2.3? DX120E對不同磷源的溶磷能力

圖9A所示，在3種不同難溶磷源條件下，DX120E的溶磷量均高于對照，其中以FePO4為難溶磷源時顯著高于對照。圖9B所示，溶磷量以FePO4為難溶磷源的條件下最高，以Ca3（PO4）2為難溶磷源的條件下最低。以FePO4為難溶磷源時與以Ca3（PO4）2、AlPO4為難溶磷源時的溶磷量相比均達到顯著性差異（P<0.05），以Ca3（PO4）2、AlPO4為難溶磷源時分別是以FePO4為難溶磷源條件下的1.4和1.6倍。

A： GDH; B： pqqE.

A：與CK對比;B：3種不同磷源的對比;不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

A： Comparison with CK; B： Comparison of three different phosphorus sources; Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.

2.4? 不同難溶磷源中GDH和pqqE基因相對表達量分析

對在不同難溶磷源條件下DX120E的樣品進行qRT-PCR試驗分析，GDH和pqqE基因相對表達量如圖10所示，GDH和pqqE基因相對表達量均呈上調表達，且2個基因的表達量情況趨勢一致。GDH和pqqE基因在以FePO4為難溶磷源的培養(yǎng)條件下表達量均最高，以Ca3（PO4）2為難溶磷源的條件最低，以FePO4為難溶磷源培養(yǎng)與以Ca3（PO4）2為難溶磷源培養(yǎng)的菌株2個基因的表達量均達到顯著差異（P<0.05），其中GDH和pqqE

A：GDH;B：pqqE;不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

A： GDH; B： pqqE; Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.

基因表達量分別是以Ca3（PO4）2為難溶磷源條件下的1.3和1.8倍。

3? 討論

磷是植物生長的必需元素之一，但土壤中絕大多數(shù)的磷元素均以難溶性狀態(tài)存在。溶磷微生物能將不可溶解的礦質磷酸鹽轉化為可溶解性的H2PO4–或者HPO42–供植物吸收利用，這也是全球磷循環(huán)生態(tài)系統(tǒng)的基本組成[20]。溶磷細菌在GDH和輔因子PQQ同時存在時，不溶性的礦質磷酸鹽可以轉化為供生物體吸收利用的可溶性磷，缺少二者中的任何一個，都會影響解磷能力。GDH基因對菌株的溶磷功能具有決定性作用。Tripura等[21]成功地從腸桿菌（Enterobacter asburiae）中克隆了GDH基因，缺失GDH基因的突變體便喪失GDH的活性，致使該菌不能溶解土壤中的難溶性磷酸鹽[22]。Rodríguez等[23]將pqq基因導入到Burkholderia cepacia IS-16和假單孢菌屬（Pseudomonas.sp）2個菌株，發(fā)現(xiàn)構建的突變菌株能增強礦質磷酸鹽溶解能力。

本研究成功克隆了甘蔗內生固氮菌Klebsiella variicola DX120E的GDH和pqqE基因ORF，并推導出編碼的氨基酸序列。GDH基因ORF為2373 bp，編碼790個氨基酸。蛋白理化性質穩(wěn)定。由于該蛋白無信號肽，不是分泌型蛋白。GDH蛋白是跨膜蛋白，也存在跨膜結構，表明GDH蛋白可能是一個與細胞信號傳導有關的膜受體蛋白。激酶磷酸化位點總共有23個，磷酸化作用是蛋白質性質改變的方法之一，磷酸化位點被激活后對蛋白的結構、功能特性都有重要影響。磷酸化作用是對蛋白質結構進行修飾，這對細胞的信號轉導也發(fā)揮著不可替代的作用[24]。該片段主要含有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白結構。pqqE基因ORF為1143 bp，編碼380個氨基酸。蛋白理化性質不穩(wěn)定。由于該蛋白無信號肽，也不是分泌型蛋白，說明該蛋白的作用存在于胞內，不具備運輸?shù)鞍踪|到不同膜結構的亞細胞器內的功能。激酶磷酸化位點共有9個，2個糖基化位點，與其磷信號識別與傳導的作用有關。該片段含有1個PQQ_ syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的結構。本研究從固氮菌株DX120E中克隆獲得了GDH和pqqE基因，說明該菌株可以通過產酸途徑來降解難溶性的磷酸鹽，但具體的溶磷機制還需進一步深入研究。

酸性土壤中磷素常被固定生成磷酸鋁或磷酸鐵，堿性土壤中磷易被固定生成磷酸鈣的形式存在，大大降低了磷的有效吸收和利用。而土壤中的一些微生物能將土壤中難溶性的磷酸鹽轉變成可溶性磷源，能使植物更多地吸收利用磷素。解磷微生物在農業(yè)上的應用，不僅可以減少使用化肥所帶來不良效益，而且可以通過增加土壤中的營養(yǎng)元素促進作物生長[25]。趙買瓊[26]將篩選出的高效解磷菌株假單胞菌Y2與解淀粉芽孢桿菌T5、NJN6 結合再配以一定比例的無機化肥，研制成復合微生物肥料，結果顯示對番茄、茄子、馬鈴薯、玉米、煙草等均具有較好的促生效果。孫孝文等[27]從水稻根際土壤中篩選到水生拉恩氏菌MEM40對磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉均具有明顯的解磷效果，對水稻具有明顯的促生作用。不同的細菌其溶磷能力不同，王奎萍等[28]篩選得到134株具有溶磷能力的菌株使辣椒植株的生物量增加了10.24%。唐岷宸等[29]研究發(fā)現(xiàn)解磷菌X-P18的施用能夠使葉葵扇白菜在缺磷環(huán)境中大量增產，其中鮮重增加了65.5%，葉片中全磷增加46.9%，促進農作物對養(yǎng)分的吸收利用。呂俊等[30]從馬尾松根際篩選到伯克霍爾德菌WJ2對磷酸鈣的溶解能力最強，在盆栽試驗中，菌株WJ2可提高土壤有效磷含量，促進植株對磷素的吸收，促進馬尾松幼苗的生長。甘蔗內生固氮菌DX120E是具有多種促生特性的溶磷細菌[16]。本研究測定了在不同難溶磷源的培養(yǎng)條件下DX120E的溶磷量以及相應條件下GDH和pqqE基因相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)，以FePO4為難溶磷源的條件下溶磷量最高，GDH和pqqE基因的相對表達量也最高。以Ca3（PO4）2為難溶磷源的條件下溶磷量和相對表達量均最低。說明在以FePO4為難溶磷的土壤中應用該菌，可以提高土壤磷素的利用效率，從而促進植物的營養(yǎng)吸收和生長。

總之，本研究從甘蔗內生固氮菌Klebsiella variicola DX120E中克隆獲得了GDH和pqqE基因，從分子方面證實該菌可通過葡萄糖脫氫酶的作用，產生有機酸途徑來發(fā)揮溶磷作用。同時Klebsiella variicola DX120E對FePO4和AlPO4的利用能力高于Ca3（PO4）2，可見該菌在酸性土壤中的應用潛力更大。本研究結果為進一步深入研究內生固氮菌的溶磷機制及開發(fā)利用提供了參考。

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責任編輯：黃東杰