地黃根腐病病原菌的分離鑒定及其防治

吳廷娟 杜權(quán) 王玉星 謝小龍

摘要：選取北京三號(hào)和金狀元2個(gè)地黃品種的發(fā)病塊根，經(jīng)表面滅菌后切成小塊，置于PDA培養(yǎng)基上分離和純化致病菌;將純化后的真菌進(jìn)行形態(tài)及顯微鑒定，再進(jìn)行致病性檢測(cè)及分子生物學(xué)方法確定致病菌的種類;最后對(duì)3種常用殺菌劑甲霜·霉靈、代森錳鋅、肟菌·戊唑醇的抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，從北京三號(hào)和金狀元中分別分離出5個(gè)致病菌株;經(jīng)過(guò)致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，北京三號(hào)3個(gè)菌株為致病菌株，金狀元中2個(gè)菌株為致病菌株;選擇2個(gè)優(yōu)勢(shì)致病菌作為試驗(yàn)菌，發(fā)現(xiàn)3種殺菌劑的抑菌效果表現(xiàn)為250～500 mg/L肟菌·戊唑醇>2 000 mg/L代森錳鋅>3 333 mg/L甲霜·霉靈。利用組織分離法獲得的菌株，通過(guò)致病性測(cè)定確定致病菌后，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和基因序列分析確定致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F. solani）以及黑曲霉菌（Aspergillus niger）;在3種殺菌劑中，以濃度為250～500 mg/L的肟菌·戊唑醇的抑菌效果最好，但應(yīng)結(jié)合田間施用效果才能確定是否能大面積推廣使用。本試驗(yàn)結(jié)果可為地黃根腐病的田間防治提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：地黃;根腐病;致病性測(cè)定;防治;病原菌分離鑒定

中圖分類號(hào)： S435.672? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）22-0132-05

收稿日期：2021-03-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2017YFC1702800）;河南省重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：171100310500）。

作者簡(jiǎn)介：吳廷娟（1981—），女，河南新鄉(xiāng)人，博士，講師，從事藥用植物栽培和病蟲(chóng)害防治研究。E-mail：wutj2011@163.com。

通信作者：謝小龍，博士，副教授，從事中藥材規(guī)范化種植技術(shù)研究。E-mail：xiaolongxie@126.com。

地黃（Rehmannia glutinosa L.）為玄參科多年生草本植物，產(chǎn)于河南省焦作地區(qū)的溫縣、武陟、孟縣、博愛(ài)、沁陽(yáng)等地，以干燥塊根入藥，主要功效為清熱涼血，養(yǎng)陰生津，能夠降血糖、保肝、止血、消炎等，具有很高的臨床使用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但地黃病蟲(chóng)害發(fā)生較為嚴(yán)重，尤其是根腐病，發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量及質(zhì)量，降低臨床使用價(jià)值，影響農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入[1]。因此，研究地黃根腐病的病原菌，及探究適宜的殺菌劑對(duì)提高地黃的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

地黃根腐病在發(fā)病初期，靠近地面的根莖和葉柄處會(huì)出現(xiàn)水浸狀黃褐色腐爛斑，逐漸向上向內(nèi)擴(kuò)展，導(dǎo)致葉片變黃，甚至萎蔫，濕度大時(shí)，病部會(huì)產(chǎn)生白色棉絮狀的菌絲體。后期離地面較遠(yuǎn)的根莖也發(fā)生干腐的癥狀，導(dǎo)致吸收水分和養(yǎng)分的功能急劇下降，嚴(yán)重時(shí)地黃整株腐爛，只剩下褐色的表皮和木質(zhì)部，導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度下降[2]。目前，對(duì)地黃根腐病的研究發(fā)現(xiàn)其致病菌為鐮刀菌[3]、帕魯?shù)细t酵母[2]、立枯絲核菌和惡疫霉菌等[1]，病原菌較多。由于造成地黃根腐病的病原菌不確定，難以對(duì)癥下藥，造成防治效果差。同時(shí)，同一植物不同品種由于對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的塑造性不同，導(dǎo)致不同地黃品種具有不同的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，進(jìn)而影響其抗病性。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，觀測(cè)2個(gè)當(dāng)家地黃品種根腐病的病原菌種類及致病性，并采用3種常用殺菌劑評(píng)價(jià)其抑菌效果，旨在為地黃根腐病的防治提供技術(shù)支持，為地黃的規(guī)范化種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用地黃塊根于2019年11月采自河南省焦作市溫縣地黃種植基地。分別采取北京三號(hào)與京狀元2個(gè)當(dāng)家品種的根腐病病株的塊根以及健康地黃的塊根。試驗(yàn)于2019年12月至2020年6月在河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥材種植技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 地黃根腐病病原菌的分離、純化與鑒定

選擇癥狀典型的、明顯的2個(gè)地黃品種發(fā)病株，分別切取地黃塊根病健交界處組織，選擇適合的表面滅菌方法，采用常規(guī)的組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離。即將發(fā)病塊根用清水洗凈，置于肥皂水中浸泡30 min，于清水中浸泡2 h。洗凈塊根的表面泥土后，先用75%乙醇浸泡3 min，再用0.1%氯化汞溶液浸泡3 min[4]，最后用無(wú)菌水沖洗3遍，取最后一次的無(wú)菌水用涂布器均勻涂抹于PDA培養(yǎng)基上。在無(wú)菌操作臺(tái)上用鑷子夾取病健組織，用無(wú)菌刀切成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的小塊。每個(gè)PDA培養(yǎng)基上均勻放置4塊，每個(gè)品種重復(fù)5次。在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃黑暗培養(yǎng)，每天記錄其生長(zhǎng)情況。待其產(chǎn)生明顯菌落后，用無(wú)菌牙簽挑取病健組織塊附近的菌絲于PDA培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)。待分離物產(chǎn)孢后，采用單孢分離法進(jìn)行純化，經(jīng)多次反復(fù)提純，獲得該菌的純培養(yǎng)物。然后將無(wú)菌液體石蠟油覆蓋于菌絲生長(zhǎng)良好的瓊脂斜面真菌培養(yǎng)物表面，厚度為1 cm左右，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用肉眼觀察法，觀察菌落凸起性狀、菌落大小、菌落高度、形態(tài)、顏色和質(zhì)地方面的特征。依據(jù)真菌鑒定手冊(cè)，用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，如菌絲顏色、有無(wú)分枝和有無(wú)隔膜，并測(cè)量菌絲粗細(xì)，觀察從初生到后期菌絲顏色的變化及是否使培養(yǎng)基變色，孢子大小以及孢子梗的大小、形態(tài)等方面，并進(jìn)行描述和鑒定[5-8]。

1.3 地黃根腐病病原菌致病性的測(cè)定及鑒定

選擇北京三號(hào)和金狀元健康、發(fā)病的植株的塊根，采用病原菌分離時(shí)的滅菌方法滅菌。然后于無(wú)菌條件下將地黃塊根（發(fā)病植株取病健交界處）縱切成2塊，分別做刻傷或不刻傷處理。然后把塊根分別放入鋪有2層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放1塊，重復(fù)3次。將在28 ℃培養(yǎng)3 d 的待測(cè)分離物菌餅（5 mm）倒置于已做好傷口處理和不做傷口處理的地黃塊根上。每個(gè)塊根接種1個(gè)菌餅，以接種 PDA為對(duì)照，重復(fù)3次。將接種的塊根于38 ℃的種子老化箱中培養(yǎng)，觀察地黃塊根的發(fā)病情況，然后進(jìn)行分離及形態(tài)學(xué)鑒定，并與第1次分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的比較，得到致病菌菌株。

形態(tài)學(xué)鑒定：將分離得到并保存在石蠟油中的菌株，挑取適量菌絲于PDA培養(yǎng)基上于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。3 d之后，通過(guò)肉眼觀察其形態(tài)特征，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲、孢子的形態(tài)特征，與第1次分離得到的菌株進(jìn)行對(duì)照。

分子生物學(xué)鑒定：首先，將通過(guò)致病性測(cè)定確定的致病菌菌株在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)活化培養(yǎng)后取新鮮菌絲，加入液氮充分研磨成粉末，提取DNA并進(jìn)行電泳檢測(cè);其次，用真菌的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì) rDNA-ITS 區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳，測(cè)序。將獲得的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。最后利用Neighbor-Joining 方法進(jìn)行聚類并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[9]。

1.4 地黃根腐病致病菌的殺菌防治

本試驗(yàn)共選擇3種常用的殺菌劑，即80%代森錳鋅可濕性粉劑（利民化工股份有限公司）、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（拜耳股份公司國(guó)內(nèi)辦事機(jī)構(gòu)）、3%甲霜·霉靈水劑（天津市綠亨化工有限公司）。先將3種殺菌劑配制成3個(gè)有效成分濃度梯度的藥液，再與溶化的培養(yǎng)基按藥液 ∶培養(yǎng)基=1 ∶9 （體積比）混合均勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成帶毒的培養(yǎng)基平面。然后用接種針將菌餅（1 cm）接種于培養(yǎng)基平面上，置于28 ℃的生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第4 天取出培養(yǎng)皿用十字交叉法測(cè)菌落直徑，求其平均值，再減去菌餅的直徑，即可測(cè)量出在不同濃度下的菌落直徑。最后根據(jù)測(cè)得的結(jié)果計(jì)算該殺菌劑對(duì)菌絲的生長(zhǎng)相對(duì)抑制率，評(píng)價(jià)供試藥劑對(duì)目標(biāo)菌生長(zhǎng)的抑制活性。以其生長(zhǎng)速度快慢即生長(zhǎng)速率法[10]評(píng)價(jià)該藥劑的毒力大小。以無(wú)菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量-菌餅直徑）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行整理分析。用SPSS 16.0對(duì)不同殺菌劑不同濃度下的抑菌率進(jìn)行兩因素方差統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)不同稀釋濃度條件下的抑菌率進(jìn)行單因素方差分析。用MEGA 6.0軟件將獲得的株菌與獲取的同源性序列最高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃根腐病病原菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

從北京三號(hào)地黃根腐病發(fā)病病株分離出5個(gè)菌株，分別編號(hào)為BP1、BP2、BP3、BP4、BP5。金狀元地黃病株分離出5個(gè)菌株，分別編號(hào)為JP1、JP2、JP3、JP4、JP5。

BP1：菌落呈圓形，菌絲呈白色絨毛狀，絨毛稍密，菌落背面呈棕色，邊緣光滑全緣，無(wú)滲出物;菌絲為有隔菌絲，大型分生孢子近鐮刀形或紡錘形，有1個(gè)隔膜或者沒(méi)有隔膜，（5.0～15.0） μm×（4.0～5.0） μm，兩端稍鈍（圖1-a）。

BP2：菌落呈圓形，菌絲呈白色絨毛狀，絨毛較稀，菌落背面呈棕色，中心有色素分泌，呈現(xiàn)紅棕色，邊緣光滑全緣;菌絲為無(wú)隔菌絲，小型分生孢子腎形，（6.0～7.0） μm×（1.5～3.0） μm，大型分生孢子近鐮刀形，沒(méi)有隔膜，（5.0～15.0） μm ×（4.0～5.0） μm，頂端稍彎（圖1-b）。

BP3：菌落呈圓形，菌落呈白色絨毛狀，菌絲稍致密，菌落背面棕色，邊緣光滑，無(wú)滲出物;菌絲為無(wú)隔菌絲，小型分生孢子腎形，大型分生孢子鐮刀形，（5.0～15.0） μm×（4.0～5.0） μm，有1～4個(gè)隔膜（圖1-c）。

BP4：菌落呈圓形，菌絲起初為白色絨毛狀，后變?yōu)橹虚g淡綠色，周圍白色，呈放射狀，菌落背面呈灰棕色;菌絲無(wú)隔，多分枝，孢子呈圓形，4.0 μm×5.0 μm，頂生或者側(cè)生（圖1-d）。

BP5：菌落呈圓形，菌絲呈灰白色絮狀，特別疏松，生長(zhǎng)速度快，無(wú)滲出物;菌絲無(wú)隔，孢子呈卵圓形，5.0 μm×6.0 μm，孢子囊頂生，類球形，孢子梗粗（圖1-e）。

JP1：菌落呈不規(guī)則形，菌落最初呈白色絨毛狀，較稀疏，隨后，中間顏色發(fā)生變化，呈淺藍(lán)色絨毛狀，四周仍為白色絨毛狀;菌絲為有隔菌絲，孢子呈圓形，3.0 μm×4.0 μm，孢子頂生（圖2-a）。

JP2：菌落呈圓形，菌落中心藍(lán)色，四周白色，呈較疏松的絨毛狀，菌落背面呈灰色;菌絲為有隔菌絲，孢子為圓形，4.0 μm×5.0 μm，附在菌絲上，菌絲頂端膨大（圖2-b）。

JP3：菌落呈橢圓形，菌落呈白色絨毛狀，較稀疏，菌落背面灰色，無(wú)滲出物;菌絲為無(wú)隔菌絲，孢子呈紡錘形或者鐮刀狀，（5.0～15.0） μm×（4.0～5.0） μm，有1～3個(gè)隔膜，中間略彎（圖2-c）。

JP4：菌落呈圓形，菌落呈白色絨毛狀，較疏松，菌落背面呈棕色，邊緣光滑，無(wú)分泌物;菌絲為有隔菌絲，大型分生孢子鐮刀狀，稍彎，（6.0～15.0） μm×（3.0～4.0） μm，多有1個(gè)隔膜（圖2-d）。

JP5：菌落呈圓形，菌落中心呈黑色絨毛狀，周圍白色絨毛狀，較疏松，菌落背面黑色;菌絲為有隔菌絲，孢子呈圓球形，4.0 μm×5.0 μm，孢子附在菌絲上，側(cè)生（圖2-e）。

2.2 致病性測(cè)定

前期用地黃塊根切片后進(jìn)行接種試驗(yàn)，確定北京三號(hào)的致病菌為BP1、BP2、BP3。然后將這3種致病菌分別接種至有傷和無(wú)傷的健康地黃塊根中。結(jié)果表明，3種致病菌均在傷口處生長(zhǎng)，導(dǎo)致地黃表面顏色變褐，干枯腐爛，無(wú)傷處發(fā)病程度低。接種BP1、BP2至有傷和無(wú)傷的健康地黃中，僅4 d就表現(xiàn)出上述現(xiàn)象，接種BP3于5 d后才表現(xiàn)出上述現(xiàn)象。接種PDA培養(yǎng)基的無(wú)傷和有傷的地黃塊根沒(méi)有任何變化。再次鑒定BP1、BP2、BP3為致病菌。

將地黃片接種試驗(yàn)中確定的金狀元的致病菌JP3、JP5接種至有傷和無(wú)傷的健康地黃塊根中，2種致病菌5 d后均在傷口處生長(zhǎng)，導(dǎo)致地黃表面顏色變褐，干枯腐爛，無(wú)傷處發(fā)病程度低。接種PDA培養(yǎng)基的無(wú)傷和有傷的地黃塊根沒(méi)有任何變化，再次鑒定JP3、JP5為致病菌。

2.3 分離物鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

從發(fā)病的病健組織分離出致病菌，經(jīng)肉眼觀察其形態(tài)以及光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲。孢子形態(tài)分別與北京三號(hào)的致病菌BP1、BP2、BP3，金狀元的致病菌JP3、JP5一致，再次證明BP1、BP2、BP3、JP3、JP5是導(dǎo)致地黃根腐病的致病菌。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)致病菌BP1、BP2、BP3、JP3、JP5的測(cè)序結(jié)果表明，致病菌BP1、BP2、BP3、JP3、JP5 5個(gè)菌株的序列長(zhǎng)度分別為516、515、540、541、575 bp（圖3）。將5個(gè)目的基因序列分別輸入NCBI的BLAST系統(tǒng)中，會(huì)得到與目的基因相似的序列，搜索下載同源性最高的序列，并與相似序列進(jìn)行多重序列比較，再利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果可知，BP1與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（JN624906.1等）聚在一起，且同源性達(dá)到98%;BP2與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）（MT154248.1）聚在一起，同源性達(dá)到99%;BP3、JP3與腐皮鐮刀菌 （F. solani）（MT560378.1、MG543740.1）聚在一起，同源性為97%;JP5與黑曲霉（Aspergillus niger） （MT729920.1） 聚在一起，同源性為99%（圖4）。

2.4 殺菌劑防治

2.4.1 抑菌效果的測(cè)定

由表1可知，3種殺菌劑均對(duì)致病菌菌株BP1、BP2的生長(zhǎng)有抑制作用，且整體的趨勢(shì)為隨著殺菌劑稀釋倍數(shù)變大（即有效濃度變?。?，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌BP1、BP2的抑制作用越弱，抑菌率越低。其中，肟菌·戊唑醇在濃度為250、330、500 mg/L 時(shí)，殺菌率均達(dá)到100.0%，說(shuō)明肟菌·戊唑醇的稀釋倍數(shù)十分適宜，且肟菌·戊唑醇的濃度最低，微量高效，防治效果最好。3種殺菌劑的抑菌率表現(xiàn)為250～500 mg/L肟菌·戊唑醇>2 000 mg/L代森錳鋅>3 333 mg/L甲霜·霉靈。

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)利用組織分離法分離出的5個(gè)致病菌經(jīng)初步鑒定后，致病菌JP3與之前從重慶市石柱縣患根腐病的黃連分離與鑒定出來(lái)的腐皮鐮刀菌（F. solani） 一致。致病菌BP1、BP2與之前從患根腐病的胡蘿卜分離鑒定出來(lái)的尖孢鐮刀菌（F. oxysporium）[6]一致，因此可以說(shuō)明鐮刀屬（Fusarium） 真菌是地黃根腐病的主要致病菌。在他人的研究中，層出鐮刀菌（F. proliferatum）[3]和帕魯?shù)细t酵母（Rhodotorula paludigena）[2]被確定為引起地黃根腐病的病原菌，但本試驗(yàn)并未分離出該菌，可能與分離條件或樣本來(lái)源有關(guān)。本次試驗(yàn)中得到的致病菌株黑曲霉菌（A. niger），屬于半知菌門曲霉屬絲狀真菌， 據(jù)報(bào)道該菌會(huì)引起軟而多汁的果實(shí)發(fā)生軟腐或造成絲蘭發(fā)生莖腐[10]。根據(jù)致病性試驗(yàn)和分子鑒定，本試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上說(shuō)明該黑曲霉菌有可能是引起地黃根腐病的病原菌之一。因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明，引起地黃根腐病的病原菌主要為尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和黑曲霉菌，具有多來(lái)源性。

在致病性試驗(yàn)中，分離出來(lái)的4株鐮刀菌和1株黑曲霉菌的室內(nèi)致病性測(cè)定結(jié)果表明，這5株致病菌的發(fā)病病狀均表現(xiàn)為組織表面腐爛，皺縮，木質(zhì)部變黑，并且隨著溫度的升高，水分的增多，腐爛程度加劇。該結(jié)果表明高溫高濕是地黃根腐病發(fā)病的重要環(huán)境因素。因此在地黃栽培過(guò)程中要及時(shí)灌溉排水，避免高溫高濕。

本試驗(yàn)選擇的殺菌劑是治療根腐病常用的殺菌劑，濃度均在推薦的濃度范圍內(nèi)。研究結(jié)果表明，75%肟菌·戊唑醇為防治地黃根腐病的最有效殺菌劑，低毒且高效，可在大田進(jìn)一步試驗(yàn)確定過(guò)后推廣使用。不同濃度下的代森錳鋅以及甲霜·霉靈也具有抑菌效果，但是抑菌率偏低?？赡苁窍♂尩臐舛绕。蛘邇?yōu)勢(shì)菌BP1尖孢鐮刀菌、BP2尖孢鐮刀菌對(duì)代森錳鋅以及甲霜·霉靈不敏感。因此，關(guān)于地黃根腐病的防治還需要選擇更多種類、具有不同作用機(jī)制的殺菌劑來(lái)進(jìn)行防治試驗(yàn)，才能篩選出針對(duì)不同致病菌株的有效殺菌劑。

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