灰葡萄孢菌與藍(lán)莓果實(shí)表皮互作的超微結(jié)構(gòu)

戴啟東 李廣旭 楊華 張廣仁

摘要：為明確灰葡萄孢菌與藍(lán)莓果實(shí)互作的發(fā)生規(guī)律，為藍(lán)莓結(jié)構(gòu)抗病育種及采后灰霉病的防治提供理論依據(jù)。在室溫條件下將灰葡萄孢菌株接種于藍(lán)莓果實(shí)表皮，每間隔0、8、16、24、32、40、48 h切取4 mm×4 mm大小表皮組織用于組織透明檢視及掃描電鏡（SEM）觀察。結(jié)果表明，灰葡萄孢菌孢子接種于藍(lán)莓果實(shí)8 h后，孢子開始萌發(fā)，藍(lán)莓表皮細(xì)胞壁及氣孔器結(jié)構(gòu)完整;病菌接菌16 h，可見凸起的菌絲頂端侵入細(xì)胞壁;接種24 h灰葡萄孢菌孢子的侵染菌絲部分溶解，并與寄主表皮融合，侵染菌絲末端可見2個(gè)分支，并侵入藍(lán)莓果皮細(xì)胞;接種32 h，灰葡萄孢菌菌絲末端可見絨毛狀結(jié)構(gòu)，并侵入藍(lán)莓果皮細(xì)胞內(nèi)部;接種40 h，灰葡萄孢菌侵染菌絲進(jìn)一步向果皮細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)展;接種48 h，灰葡萄孢菌菌絲已大量侵入藍(lán)莓果實(shí)表皮。明確了在室溫條件下病菌初侵染的時(shí)間以及主要侵入方式：即接種16 h，病菌即可侵入藍(lán)莓果實(shí)表皮細(xì)胞，接菌40～48 h病菌即完成侵入并大量擴(kuò)展、繁殖。病菌侵入方式主要以菌絲直接穿透寄主表皮為主，尚未發(fā)現(xiàn)病菌從氣孔器侵入的證據(jù)。

關(guān)鍵詞：灰葡萄孢菌;藍(lán)莓;掃描電鏡;超微結(jié)構(gòu);互作

中圖分類號：S436.639?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0121-04

收稿日期：2021-03-12。

基金項(xiàng)目：遼寧省公益研究人才培養(yǎng)項(xiàng)目（編號：2015002015）。

作者簡介：戴啟東（1981—），男，遼寧營口人，碩士，助理研究員，主要從事果樹真菌病害研究。E-mail：daiqd@126.com。

通信作者：李廣旭，博士，研究員，主要從事果樹真菌分子生物學(xué)研究。E-mail：liguangxucau@163.com。

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）是一類重要的植物病原真菌，該病菌營非專性寄生，通過合成細(xì)胞壁降解酶和分泌細(xì)胞毒素（NHST）來殺死寄主組織[1]，引起藍(lán)莓（blueberry）果實(shí)變質(zhì)腐爛，使采后藍(lán)莓貨架期縮短，商品價(jià)值受到極大影響。1964年，Barker等報(bào)道，該病菌可以侵染藍(lán)莓引起灰霉病[2]?；移咸焰呔粌H可以在藍(lán)莓的生長期侵染花器以及幼葉，引起萼片脫落、幼果腐爛，同時(shí)也是藍(lán)莓貯藏期主要的采后病害之一[3]。目前，藍(lán)莓灰霉病防治手段主要還是通過在采收前施用化學(xué)藥劑降低病菌接種密度和防止初始侵染為主。隨著藥劑抗藥性的產(chǎn)生，目前使用的化學(xué)藥劑防治效果和對食品的安全性問題亟需重新評估[4]。隨著我國法規(guī)的不斷嚴(yán)格，很多藥劑的限制使用使得問題變得更加緊迫。因此，提出藍(lán)莓灰霉病防治的新方法、新思路勢在必行。Reeh等報(bào)道，利用1種蜜蜂作為生物載體攜帶粉紅粘帚霉菌（Gliocladium roseum）來防治溫室藍(lán)莓灰霉病的案例[5];Weber等采用1種新型殺菌劑氟吡菌酰胺對灰葡萄孢菌不同菌株的敏感性進(jìn)行了篩選試驗(yàn)[6];Droby等提出，利用外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)藍(lán)莓抗性反應(yīng)來防治灰霉病菌侵染[7]。國內(nèi)學(xué)者對藍(lán)莓灰霉病的研究主要集中在病原菌的致病性分化以及不同藍(lán)莓品種對灰霉病的親和性等方面[8]，而對病菌與寄主侵入過程及機(jī)制的研究較少。近年來，隨著電子顯微鏡技術(shù)在植物病原菌與寄主互作方面研究的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)學(xué)者做了一些相關(guān)的研究工作。其中蘋果鏈格孢菌（Alternaria mali）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana）以及草莓白粉病菌（Sphaerotheca macularis）與相關(guān)寄主互作的研究都取得一定進(jìn)展[9-11]，而灰葡萄孢菌與藍(lán)莓果實(shí)互作的研究還未見報(bào)道。病原菌與寄主侵染過程的觀察對于研究寄主植物與病原菌互作機(jī)制具有重要意義，本研究通過掃描電鏡（SEM）技術(shù)以及植物組織透明染色的方法對灰葡萄孢菌侵染藍(lán)莓果實(shí)表皮的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，試圖通過對侵入過程精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究為更好了解灰葡萄孢菌與寄主的侵染機(jī)制提供必要的理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

灰葡萄孢菌菌株由遼寧省果樹科學(xué)研究所植物保護(hù)研究室保存。用于接種的藍(lán)莓試驗(yàn)果實(shí)采自遼寧省果樹科學(xué)研究所藍(lán)莓資源圃，品種為北陸（Northland），為半高叢藍(lán)莓。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰葡萄孢菌與藍(lán)莓果實(shí)表皮的互作培養(yǎng) 首先將保存的灰葡萄孢菌菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃活化培養(yǎng)20 d，待菌落布滿整個(gè)培養(yǎng)皿，并產(chǎn)生灰黑色絨毛狀孢子球時(shí)，用無菌水配制成孢子懸浮液，濃度約為 2×105 個(gè)/mL，混合均勻后孢子懸浮液中加入 2 μL/mL 表面活性劑吐溫-20混勻[12]，然后將混合液均勻噴灑于藍(lán)莓果實(shí)表面后，將果實(shí)在墊有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)室溫保濕培養(yǎng)。

1.2.2 藍(lán)莓表皮組織透明觀察 將接菌的藍(lán)莓果實(shí)每間隔16、24、32、40、48 h后切取4 mm×4 mm大小藍(lán)莓表皮組織，用飽和水合氯醛溶液固定（水合氯醛5.5 g，無菌水2 mL），脫色過夜。然后在95%乙醇和冰醋酸混合液中再次固定24 h，浸在飽和水合氯醛溶液中，待組織透明12 d后取出，再用10%氫氧化鉀水溶液浸泡2 d，用無菌水沖洗干凈，經(jīng)稀苯胺藍(lán)的水溶液染色，經(jīng)切片機(jī)（NK SYSTEM PLANT MICROTOME）切片，樣品用甘油浮載檢視顯微觀察攝影（Nikon ECLIPSE E100），并記錄觀察結(jié)果。

1.2.3 灰葡萄孢菌侵染藍(lán)莓果實(shí)表皮過程的掃描電鏡觀察 將接菌的藍(lán)莓果實(shí)每隔0、8、16、24、32、40、48 h切取4 mm×4 mm大小表皮組織，用0.1%的戊二醛溶液固定12 h，再用磷酸緩沖液（pH值7.5）漂洗3次，依次用濃度為75%、85%和95%的乙醇系列梯度脫水，脫水時(shí)間每次5 min，醋酸異戊酯置換，取出后在室溫自然干燥24 h。按不同的觀察部位，用導(dǎo)電膠將藍(lán)莓果皮貼于樣品臺面上。用IB-2離子度膜儀真空噴金[13]。處理后的樣品在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能研究所實(shí)驗(yàn)室用HITACHI su-8010高分辨場發(fā)射掃描電鏡（10 kV加速電壓）進(jìn)行觀察、測量和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢菌侵染藍(lán)莓果皮的組織透明觀察

藍(lán)莓果皮經(jīng)組織透明檢視發(fā)現(xiàn)，接菌8 h，藍(lán)莓表皮細(xì)胞壁及氣孔器結(jié)構(gòu)完整（圖1-A）;病菌接菌16 h，可見凸起的菌絲頂端剛剛侵入細(xì)胞壁（圖1-B）;接菌24 h灰葡萄孢菌絲體已經(jīng)在寄主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)展（圖1-C）;接菌32～40 h，病菌菌絲在表皮細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，細(xì)胞壁分解，細(xì)胞內(nèi)氣孔器周圍組織受到破壞進(jìn)一步消解（圖1-D、圖1-E）;在接菌48 h后，藍(lán)莓表皮細(xì)胞內(nèi)可見大量病菌菌絲體繁殖，并產(chǎn)生圓球狀的特異結(jié)構(gòu)，寄主表皮細(xì)胞大量溶解（圖1-F）。在不同時(shí)間點(diǎn)的觀察可以發(fā)現(xiàn)，寄主表皮細(xì)胞的氣孔器結(jié)構(gòu)完整，都沒有被病菌侵染和侵入。

2.2 灰葡萄孢菌侵染藍(lán)莓果皮的掃描電鏡觀察

藍(lán)莓果實(shí)于室溫下接種灰葡萄孢菌，接菌0 h可見病菌孢子的附著形態(tài)（圖2-A）;接種8 h灰葡萄孢孢子由底部孢子痕處萌發(fā)出侵染菌絲（圖2-B）;接種16 h后灰葡萄孢菌侵染菌絲進(jìn)一步生長（圖2-C）;接種24 h灰葡萄孢菌孢子侵染菌絲部分溶解，并與寄主表皮融合，菌絲周圍出現(xiàn)菌絲溶解現(xiàn)象同時(shí)病菌菌絲出現(xiàn)2個(gè)分支 （圖2-D、圖2-E、圖2-F）;接種32 h灰葡萄孢菌菌絲末端己部分侵入藍(lán)莓果皮內(nèi)部，侵染菌絲末端可見絨毛狀結(jié)構(gòu)（圖2-G）;接種40 h灰葡萄孢菌侵染菌絲進(jìn)一步向果皮內(nèi)擴(kuò)展，深入藍(lán)莓果皮組織內(nèi)部（圖2-H）;接種48 h灰葡萄孢菌絲已大量布滿藍(lán)莓果實(shí)表皮并深入表皮組織內(nèi)部，完成對果實(shí)表皮的侵染（圖2-I）。

3 討論與結(jié)論

本研究認(rèn)為，灰葡萄孢菌主要通過寄主表皮直接侵入，而非氣孔器結(jié)構(gòu)侵入。這與鏈格孢菌以及白粉菌的侵入方式基本一致[8，10]，但與蘋果輪紋病菌的侵入方式明顯不同，相關(guān)研究結(jié)果表明，蘋果輪紋病菌主要通過表皮氣孔器侵入蘋果枝干部位，而從傷口和表皮縫隙侵入的很少[9]。明確病菌的主要侵入途徑對結(jié)構(gòu)抗病性選育藍(lán)莓新品種具有一定的參考價(jià)值。同時(shí)機(jī)械傷口和果蒂痕處也是病菌主要侵入部位，不同藍(lán)莓品種果皮的物理特性如果皮硬度、果蒂痕大小對灰霉病菌侵入皆具有一定的影響[2]。

通過對灰葡萄孢菌與藍(lán)莓果實(shí)表皮互作的組織學(xué)透明檢視以及掃描電鏡觀察研究，明確了在室溫條件下病菌初侵染的時(shí)間及主要的侵入方式。即接種16 h病菌即可侵入藍(lán)莓果實(shí)表皮細(xì)胞，40～48 h病菌即完成侵染，并大量繁殖。病菌侵入方式主要是通過菌絲直接穿透寄主表皮為主，尚未發(fā)現(xiàn)病菌從氣孔器侵入的證據(jù)。

植物病原真菌對寄主的入侵能力主要取決于孢子在果實(shí)表皮的萌發(fā)能力、侵染菌絲的穿透能力以及抵御寄主免疫系統(tǒng)阻止真菌生長的相互作用關(guān)系?；移咸焰呔诃h(huán)境條件不利的情況下，以菌絲、分生孢子、菌核方式潛伏侵染，并長時(shí)間保持沉默，直到寄主植物生理生化環(huán)境條件適宜時(shí)引起宿主軟腐[14]。本研究觀察到灰葡萄孢菌一種不同形式的侵入過程，即生長于寄主表面的侵染菌絲二叉分枝，菌絲與寄主表面融合，菌絲內(nèi)含物附著在藍(lán)莓果實(shí)表皮上，并產(chǎn)生類似吸器的泡狀結(jié)構(gòu)侵入寄主細(xì)胞壁，這些侵入特征未見前人報(bào)道，本研究結(jié)果對于深入了解灰葡萄孢菌與藍(lán)莓表皮的互作機(jī)制具有一定的意義。由于研究過程中時(shí)間點(diǎn)設(shè)置數(shù)量有限，對灰葡萄孢菌侵染藍(lán)莓果皮這一動態(tài)過程的精細(xì)觀察還有待進(jìn)一步深入研究闡明。同時(shí)病菌侵入寄主細(xì)胞后，產(chǎn)生的病理學(xué)變化還有待進(jìn)一步通過透射電鏡來研究和分析。

本研究對灰霉菌侵染藍(lán)莓果實(shí)表皮不同時(shí)間點(diǎn)的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和分析，明確了病菌侵染過程中與寄主組織互作的微觀特征以及寄主細(xì)胞器的變化情況。這些研究為藍(lán)莓結(jié)構(gòu)抗病性新品種的選育提供了一定的理論參考，豐富了前人在灰葡萄孢菌侵染機(jī)制方面的研究內(nèi)容。藍(lán)莓灰霉病由于具有潛伏侵染時(shí)間長，發(fā)病擴(kuò)展迅速的特點(diǎn)，必須建立早期診斷技術(shù)，做到采收前期化學(xué)防治、物理防治以及農(nóng)業(yè)防治相結(jié)合的方法才能取得事半功倍的效果。

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