河南商丘月季炭疽病的病原菌鑒定及生物學(xué)特性

婁喜艷 王欣陽(yáng) 裴冬麗

摘要：為鑒定河南省商丘市月季炭疽病病原菌種類及其生物學(xué)特性，對(duì)月季炭疽病的防治提供理論指導(dǎo)，2019年10月在商丘市長(zhǎng)征路采摘患炭疽病的月季病株，對(duì)患病葉片采用單孢分離方法，經(jīng)過(guò)純化得到1株病原菌。通過(guò)室內(nèi)人工接種的方法對(duì)該病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌株能使健康月季葉片出現(xiàn)病斑，對(duì)此病斑進(jìn)行病原菌再分離可得到原接種病原菌。對(duì)菌株顯微形態(tài)學(xué)分析表明，該菌株分生孢子呈長(zhǎng)圓形、無(wú)色、單孢;分生孢子大小為（15.6～21.5）μm×（3.5～5.2）μm;菌絲有明顯的隔膜;氣生菌絲發(fā)達(dá)。通過(guò)測(cè)序、比對(duì)和利用ITS、ACT、GAPDH、CHS基因進(jìn)行多基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）聚在一起。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定分析，確定河南商丘市月季炭疽病是由膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）侵染所致。通過(guò)對(duì)不同處理的培養(yǎng)基影響菌絲生長(zhǎng)狀況的分析可得，該菌株生長(zhǎng)的最適溫度為28 ℃;pH值為5時(shí)最有利于菌絲的生長(zhǎng);在24 h暗處理?xiàng)l件下菌絲生長(zhǎng)速度最快;在以蛋白胨和硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)較快;淀粉是該菌絲的最適碳源。

關(guān)鍵詞：月季;炭疽病;形態(tài)學(xué)鑒定;分子生物學(xué)鑒定;生物學(xué)特性;多基因系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：S436.8+1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）22-0116-05

收稿日期：2021-08-27

基金項(xiàng)目：河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)資助項(xiàng)目（編號(hào)：2018GGJS191）。

作者簡(jiǎn)介：婁喜艷（1984—），女，河南商丘人，碩士，副教授，主要從事植物生理學(xué)教學(xué)與研究。E-mail：lounan2005@163.com。

通信作者：裴冬麗，博士，教授，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究。E-mail：peidongli@126.com。

月季（Rosa chinenisis Jacq.）被稱為花中皇后，屬于薔薇科薔薇屬植物，月季四季都能開(kāi)花，并且花色艷麗，既可作為城市中的觀賞植物，也可作為藥用植物。中國(guó)是月季原產(chǎn)地之一，月季在我國(guó)的大多城市中都被作為綠化植物，特別是近幾年來(lái)，月季的種植面積不斷增加[1]。但由于培養(yǎng)條件和管理方法不合理導(dǎo)致病原菌侵入，影響月季花和果實(shí)的生長(zhǎng)，甚至最終導(dǎo)致植株死亡。目前，月季病害文獻(xiàn)報(bào)道的常見(jiàn)月季病害種類有10種，其中真菌性病害有7種，分別為白粉病、黑斑病、霜霉病、灰霉病、葉霉病、銹病、月季枝枯病;細(xì)菌性病害1種，為根癌病;病毒病害1種;及生理性疾病因所致的月季缺素癥[2]。

炭疽病是一種常見(jiàn)的植物病害，可使多種經(jīng)濟(jì)作物受害，包括果樹(shù)、綠化植物等。炭疽病主要危害果實(shí)和葉片，產(chǎn)生棕褐色或黑褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)引起植株落葉、落果。炭疽病在夏季高溫，濕度大的地區(qū)容易發(fā)生。引起炭疽病的病原菌是炭疽菌屬（Colletotrichum），它的種類很多，其中膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）是炭疽菌屬種類最多的一個(gè)種，分布廣泛，能引起蘋果、梨、棉花、葡萄、冬瓜、黃瓜、辣椒等多種植物的炭疽病[3]。目前，月季炭疽病在國(guó)外報(bào)道中，Rivera等于2000年在阿根廷從患有枯萎病和炭疽病的月季植株中分離出病原菌膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）[4]，在國(guó)內(nèi)Feng等發(fā)現(xiàn)引起湖南省長(zhǎng)沙市月季炭疽病的病原菌是暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）[5]。

由于炭疽菌屬（Colletotrichum）形態(tài)學(xué)特征相似，因此分子生物學(xué)鑒定技術(shù)在近年來(lái)迅速發(fā)展。開(kāi)始時(shí)通常采用ITS序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，通過(guò)ITS引物擴(kuò)增目的基因，然后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，但是ITS 序列不能區(qū)分炭疽菌屬的近緣種，因此多基因進(jìn)化樹(shù)分析更為可靠，常用的擴(kuò)增引物序列包括ITS、ACT、CAL、GAPDH、CHS、TUB等。

河南省商丘市的市花是月季，2019年10月在市區(qū)內(nèi)的長(zhǎng)征路、南京路、文化路的道路兩旁發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重感染炭疽病的月季。為探究商丘市月季炭疽病病原菌種類和生物學(xué)特征，采摘了商丘市長(zhǎng)征路月季患病葉片，對(duì)炭疽病病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、致病性、分子生物學(xué)鑒定，并研究其生物學(xué)特征，以期為月季炭疽病的防治和抗病育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株 2019年10月于河南省商丘市長(zhǎng)征路采集月季患炭疽病病株用于病原菌的分離與鑒定。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 TAE溶液、瓊脂糖、DNA Marker （DL2000）、TaqMixture、10×Loading buffer 引物 （ITS1和 ITS4）合成、ddH2O、核酸染料GoldView等。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯先洗凈去皮，然后稱取200 g切成小塊，加水小火煮爛（煮到玻璃棒能戳破即可），用6層紗布過(guò)濾到燒杯中，稱取20 g葡萄糖倒入，攪拌混勻，待葡萄糖溶解完后加入20 g的瓊脂，稍冷卻后用蒸餾水定容至1 L，分裝至250 mL的錐形瓶，加塞、包扎，120 ℃滅菌20 min左右后取出，放入超凈工作臺(tái)中，接著倒入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 采用單孢分離法。選取有典型病斑的葉片，在病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊，在75%乙醇中浸泡消毒30 s，然后用無(wú)菌水連續(xù)漂洗3次，再用2%次氯酸鈉浸泡1 min后用無(wú)菌水浸洗3次，放在滅菌濾紙上晾干后轉(zhuǎn)至PDA 培養(yǎng)基上，用最后1遍的清洗液涂布平板做陰性對(duì)照，然后將培養(yǎng)基放入真菌培養(yǎng)箱中28 ℃下恒溫培養(yǎng)，3 d后觀察菌絲生長(zhǎng)狀況。再重新取菌絲尖端接種于 PDA 培養(yǎng)基中央，重復(fù)操作至分離菌株純化。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 拍照記錄培養(yǎng)皿上的病原菌菌落生長(zhǎng)形態(tài)及菌落正反面顏色、菌絲疏密程度等菌落特征，從培養(yǎng)基上挑取少許菌絲，放在含有1滴無(wú)菌水的載玻片上，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及孢子特征，如分生孢子的大小、形狀、分生孢子梗及有無(wú)隔膜等。

1.2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定 提取DNA采用改良的CTAB法，具體操作步驟為試驗(yàn)前先把異丙醇放于-20 ℃冰箱中預(yù)冷，70%乙醇4 ℃預(yù)冷，打開(kāi)水浴鍋加熱到58 ℃。用滅菌槍頭刮取 0.1 mL 菌絲置于1.5 mL離心管中，向離心管中加入少量石英砂（約20 μL），然后加300 μL的2% CTAB提取緩沖液，用研磨棒研磨充分（5 min左右）。再加入 200 μL 2% CTAB提取緩沖液，取出研磨棒，于 58 ℃ 水浴1 h后冷卻至室溫（水浴時(shí)每 10 min 顛倒混勻1次）。然后加入相同體積的氯仿/異戊醇（24 ∶1），來(lái)回顛倒混勻，10 000 r/min離心10 min，離心時(shí)將10% CTAB提取緩沖液65 ℃水浴加熱。離心后用移液器取上清液于另一個(gè)無(wú)菌離心管中（約300 μL），加1/10體積的（約 30 μL）10% CTAB緩沖液（65 ℃浴熱），來(lái)回顛倒搖勻，加等體積 330 μL 的氯仿/異戊醇（24 ∶1），來(lái)回顛倒混勻，10 000 r/min 離心10 min。離心后取上清液于新離心管中（約250 μL），加等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，-20 ℃放置30 min，然后再次離心，參數(shù)設(shè)置為12 000 r/min，4 ℃，離心 10 min。接著倒掉上清液，倒置直至離心管壁無(wú)水滴，然后加 1 mL 預(yù)冷的70%乙醇進(jìn)行洗滌，10 000 r/min 離心5 min。上述洗滌步驟重復(fù)1次，洗滌完倒掉上清，用槍頭吸去剩余的液體（避免吸到沉淀），在超凈工作臺(tái)上打開(kāi)風(fēng)機(jī)，完全風(fēng)干（30 min 左右）。最后向試管中加入 30 μL 左右去離子水，-20 ℃保存。

分別利用真菌引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、Actin-512F（5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′）/Actin-783R（5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′）、GDF（5′-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3′）/GDR（5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3′）和CHS-79F（5′-TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG-3′）/CHS-345R：（5′-TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3′）分別對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系共50 μL，其中模板DNA 3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq Mixture 25 μL，去離子水20 μL，混合后輕微離心，設(shè)置PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min（35個(gè)循環(huán)）;72 ℃10 min，擴(kuò)增后4 ℃保存。最后將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物做好標(biāo)記送去公司測(cè)序。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將測(cè)序得到的序列在GenBank上用BLAST進(jìn)行同源性比較，下載具有登錄號(hào)的相關(guān)同源序列，然后用MEGA 7軟件比對(duì)剪切，最后按照ITS-ACT-GAPDH-CHS的順序分別首尾相連，以薯毛鏈孢（Monilochaetes infuscans）為外群，利用MEGA 7軟件以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 分離菌株致病性測(cè)定 采用菌餅接種法測(cè)定分離的炭疽菌菌株致病性。將分離純化后的株菌轉(zhuǎn)至 PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)6 d后，用5 mm滅菌打孔器平板邊緣打下菌餅，用滅過(guò)菌的牙簽在生長(zhǎng)狀況相同的健康月季葉片上扎10個(gè)左右傷口，然后將菌餅接種到傷口上，該處理3次重復(fù)，以PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。

將接種后的葉片置于鋪有保濕并無(wú)菌脫脂棉的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于室溫（25～27 ℃）培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病狀況。取病葉進(jìn)行病原菌再分離，并將分離獲得的病原菌與接種病原菌進(jìn)行比較。

1.2.6 分離菌株生物學(xué)特性分析 研究不同光照、溫度、pH值下對(duì)菌絲生長(zhǎng)狀況的影響。將直徑為 5 mm 的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，然后分別置于24 h光照、12 h光照12 h黑暗、24 h黑暗條件下培養(yǎng);設(shè)置6個(gè)pH值梯度，即pH值為 5、6、7、8、9、10，將滅過(guò)菌的PDA培養(yǎng)基用1 mmol/L NaOH和 1 mmol/L 的HCl調(diào)節(jié)pH值，接著將菌餅接種到不同處理的PDA培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);將直徑5 mm的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，在4～37 ℃條件下設(shè)置5個(gè)水平進(jìn)行培養(yǎng)，即4、20、28、30、37 ℃。以上每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，4 d后測(cè)量菌落直徑并計(jì)算平均值。

不同氮源、碳源下菌絲的生長(zhǎng)試驗(yàn)：以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后用含碳量相同的乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖替代Czapek培養(yǎng)基的碳源，用含氮量相同的硫酸銨、蛋白胨、硝酸銨、硝酸鉀、磷酸氫二銨、硝酸鈉替代Czapek培養(yǎng)基的氮源，用不加碳源和氮源的Czapek培養(yǎng)基作為對(duì)照，接著將直徑為5 mm菌餅接種于培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后測(cè)量菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)量菌落直徑大小的數(shù)據(jù)輸入Excel表中，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS軟件中進(jìn)行方差分析，用Duncans法分析不同處理間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害的發(fā)病癥狀

月季炭疽病主要危害月季葉片，在嫩葉和老葉中都會(huì)發(fā)生，多在葉緣和葉尖發(fā)病，發(fā)病初期綠色葉片先出現(xiàn)不規(guī)則褐色病斑，葉片略下陷，然后病斑逐漸擴(kuò)大，病斑周圍出現(xiàn)黃色暈圈（圖1）。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

從月季炭疽病患病葉片中分離出一個(gè)菌株命名為SQYJCG-1，而接無(wú)菌水的對(duì)照組無(wú)菌落生長(zhǎng)。菌落呈圓形，平坦，邊緣整齊，氣生菌絲絨毛狀。菌落背面初期為白色，4 d 后開(kāi)始從內(nèi)往外逐漸變?yōu)槌壬? d 后整個(gè)菌落背面為淺橙色，在培養(yǎng)基上留下黑色素（圖2-A、2-B）。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌絲有明顯的隔膜，并具有分支，分生孢子梗無(wú)色，分生孢子長(zhǎng)圓柱形，兩端鈍圓或一端稍鈍一端稍尖，單孢，無(wú)色，大小為（15.6～21.5）μm×（3.5～5.2）μm（圖2-C、2-D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，初步判定菌株SQYJCG-1屬于膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以月季炭疽病致病菌SQYJCG-1的 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物測(cè)序，所得的測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中，獲得的登錄號(hào)分別為ITS序列：MZ021314;ACT序列：MZ128791;GAPDH序列：MZ128789;CHS序列：MZ128790。然后在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 對(duì)比并與 GenBank 已登錄的相似序列進(jìn)行同源性對(duì)比，結(jié)合ITS、ACT、GAPDH、CHS基因利用MEGA 7軟件的 Neighbor-joining構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以薯毛鏈孢（Monilochaetes infuscans）為外群，結(jié)果顯示該致病菌

SQYJCG-1與C. gloeosporioides形成明顯的分支（圖3），而與薯毛鏈孢親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 病原菌致病性測(cè)定

從校園內(nèi)采摘形狀、大小相近的月季健康葉片，用無(wú)菌水洗凈，然后用乙醇棉球輕輕擦拭表面進(jìn)行消毒，刺傷后接SQYJCG-1菌餅，4 d后葉片開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病率達(dá)到100%。葉片接種菌絲塊的周圍變褐，逐漸向外擴(kuò)散和蔓延，病斑周圍失綠并漸漸發(fā)黃（圖1）。用PDA培養(yǎng)基接種的月季健康葉片未見(jiàn)發(fā)病癥狀。按照科赫氏法則，從接種發(fā)病的病組織再次分離出該病原菌，菌落形態(tài)、孢子形態(tài)與接種菌株一致。因此可得月季炭疽病是病原菌SQYJCG-1侵染所致。

2.5 炭疽病病原菌的生物學(xué)特性

2.5.1 光照、溫度、pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)病原菌SQYJCG-1的生長(zhǎng)具有一定影響，從圖4可以看出，膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）在溫度為20～30 ℃均能生長(zhǎng)，在溫度為28 ℃條件下菌落直徑最大，該溫度為其最適生長(zhǎng)溫度，病原菌在4、37 ℃環(huán)境條件下幾乎不能生長(zhǎng)。分析結(jié)果表明，不同溫度之間對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響具有顯著差異。

由圖5可見(jiàn)，供試菌株SQYJCG-1在pH值 5～10都能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH值是5，在此條件下，菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑達(dá)到46.67 mm。分析表明， 不同pH值對(duì)供試菌株的生長(zhǎng)影響不顯著。

光照對(duì)病原菌SQYJCG-1生長(zhǎng)影響的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6，每天24 h黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑最大，長(zhǎng)度為51.83 mm，12 h光照與12 h黑暗交替處理時(shí)， 菌絲直徑最小。不同光處理之間菌絲生長(zhǎng)狀況的差異不顯著。

2.5.2 不同碳源、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 從圖7可以看出，菌株SQYJCG-1在提供的7種不同碳源培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)，在不加碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)最慢。以淀粉為碳源最適合菌絲生長(zhǎng)，此條件下菌絲生長(zhǎng)最快，其次是以乳糖為碳源培養(yǎng)基，二者之間沒(méi)有顯著差異。通過(guò)方差分析，不同碳源之間差異不顯著，與對(duì)照組的差異顯著。

從圖8可以看出，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基最適合菌絲生長(zhǎng)，其次是硝酸鉀，在對(duì)照組和以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基條件下，菌絲生長(zhǎng)比較緩慢。分析結(jié)果表明，不同氮源之間的差異顯著。

3 討論

炭疽病菌是多種植物的致病菌，膠孢炭疽菌作為植物炭疽病的病原菌在國(guó)內(nèi)外有許多研究報(bào)道，是藍(lán)莓[6]、葡萄[7]、梨[8];衛(wèi)矛[9]等植物的炭疽病致病病原菌。植物炭疽病存在一病多菌的現(xiàn)象， 患病

植株生長(zhǎng)的環(huán)境不同，其優(yōu)勢(shì)種群不同[10]。將該試驗(yàn)與國(guó)內(nèi)首次報(bào)道引起月季炭疽病病原菌的是暹羅炭疽菌（C. siamense）相結(jié)合可得，膠孢炭疽菌和暹羅炭疽菌都可以引起月季炭疽病，這與王杰等鑒定紅葉石楠炭疽病病原菌是膠孢炭疽菌和暹羅炭疽菌的結(jié)果[11]類似。

ITS序列分析是炭疽病分子分類鑒定中最早、最多的方法[12]。由于膠孢炭疽是一個(gè)復(fù)合種群，目前認(rèn)為，膠孢炭疽菌復(fù)合種群包括 23 個(gè)種和 1 個(gè)亞種[13]，所以以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)研究，如rDNA-ITS、ACT、CHS等多個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，可提高病原菌鑒定工作的可靠性[14]。

本試驗(yàn)采用單孢分離法、形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)方法對(duì)月季炭疽病病原菌進(jìn)行了初步研究，最終鑒定商丘市月季炭疽病病原菌是膠孢炭疽菌SQYJCG-1，并且通過(guò)對(duì)該菌株的生物學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)該病原菌的生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃，最適pH值為5，最適碳源、氮源分別為淀粉、蛋白胨，菌絲在24 h暗處理?xiàng)l件下菌絲生長(zhǎng)速度最快。本試驗(yàn)為月季抗病品種的篩選提供了理論基礎(chǔ)，并為月季疾病管理策略提供了病原菌鑒定信息。

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